Detektion der an die SH2 Domänen gebundenen Phosphotyrosinproteine

Im Folgenden sollten zur Erweiterung des Detektionsspektrums unterschiedliche Antikörper gegen einen spezifischen Epitop-Tag des gebundenen Phosphotyrosinproteins getestet werden. Dadurch war es möglich, verschiedene bereits existierende Plasmidkonstrukte zur Expression in HEK293T Zellen zu verwenden. Neben dem bisher verwendeten monoklonalen anti-HA Primärantikörper wurde im Folgenden auch ein polyklonaler anti-GFP Primärantikörper zur Detektion des gebundenen CEACAM3-HA-GFP verwendet.

Abb. 2.2.6 Detektion von gebundenem Phospho-tyrosinprotein mittels monoklonalem anti-HA Antikörper und polyklonalem anti-GFP Antikörper.

Vier identische SH2 Domänen Arrays wurden mit Ganzzelllysaten von HEK293T Zellen beprobt. Die für die Herstellung der Ganzzelllysate verwendeten HEK293T Zellen exprimierten CEACAM3-HA-GFP in An- oder Abwesenheit von v-Src. Das mit den SH2 Domänen interagierende CEACAM3-HA-GFP wurde zum einen mittels monoklonalem anti-HA Primär- und Cy3-markierten Ziege-anti-Maus Sekundärantiköper nachgewiesen (linke Spalte), zum anderen wurde das gebundene CEACAM3-HA-GFP mittels polyklonalem anti-GFP Primärantikörper, gefolgt von Cy3-markiertem Ziege-anti-Kanninchen Sekundärantikörper nachgewiesen (rechte Spalte).

Zu Zwecken der Vergleichbarkeit wurden jeweils zwei identische Arrays mit dem gleichen Lysat von phosphoryliertem und unphosphoryliertem CEACAM3-HA-GFP inkubiert und alle vier Arrays mit der gleichen Signalverstärkung ausgelesen. Die Detektion des mit den SH2

2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen

Domänen interagierenden CEACAM3-HA-GFP erfolgte mittels anti-HA bzw. anti-GFP Antikörper (Abb. 2.2.6). Mit beiden Antikörpern konnte gebundenes, phosphoryliertes CEACAM3 detektiert werden. Das leicht erhöhte Hintergrundsignal des GFP-Antikörpers lässt sich durch Herabsetzung der Verstärkungsspannung reduzieren. In einem weiteren Schritt sollten, unter Verwendung von monoklonalem anti-Phosphotyrosin (pTyr) Primärantikörper, alle an die SH2 Domänen gebundenen, tyrosinphosphorylierten Proteine des Zelllysates nachgewiesen werden. Mit dieser Form der Detektion können SH2 abhängige Bindungsstudien durchgeführt werden, die das gesamte endogene Phosphotyrosinproteom der Zelle umfassen. Im Detail bedeutet dies, dass zum Beispiel Zelllysate in An- und Abwesenheit spezifischer PTKs auf eine Veränderung im Phosphotyrosin-abhängigen Bindungsmuster untersucht werden können. Um die Funktionalität des verwendeten anti-pTyr Primärantikörpers zu testen, wurden in einem ersten Schritt Ganzzelllysate verwendet, in denen zuvor CEACAM3 und v-Src koexprimiert wurden. Dieser Versuch zeigte eine effiziente Detektion der auf dem Array gebunden Proteine durch den anti-pTyr Primärantikörper (Abb. 2.2.7A).

Abb. 2.2.7 Detektion gebundener Phosphotyrosinproteine mittels spezifischem anti-Phosphotyrosin Antikörper. (A) Repräsentative Abbildung von zwei identischen SH2 Domänen Arrays, die mit phosphorylierten oder unphosphorylierten Ganzzelllysaten beprobt wurden. Die verwendeten Ganzzelllysate wurden aus HEK293T Zellen hergestellt, die CEACAM3-HA-GFP in An- oder Abwesenheit von v-Src exprimierten. Die Detektion von Phosphotyrosinproteinen, die mit den einzelnen SH2 Domänen interagieren, erfolgte mittels monoklonalem anti-pTyr Primär- und Cy3-markierten Sekundärantikörper. Die Anordnung der Proteine innerhalb des Arrays ist in der Tabelle dargestellt. (B) Grafische Darstellung der unter (A) detektierten und in Relativwerte umgerechneten Bindungssignale. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardfehler des

Protein-Protein Interaktionen

Beim Vergleich der relativen Nettobindungssignale (Abb. 2.2.7B) ist zu erkennen, dass die meisten der Signale in etwa den relativen Nettobindungssignalen aus Abbildung 2.2.5C entsprechen. Dies legt die Vermutung nahe, dass die Bindungssignale zu einem großen Teil auf das rekombinant exprimierte CEACAM3 zurückzuführen sind. Bei dieser vergleichenden Betrachtung lassen sich allerdings auch Unterschiede erkennen. So konnte für die SH2 Domäne des Adapterproteins Grb2 bei der Verwendung des anti-pTyr Antikörpers ein stärkeres Bindungssignal detektiert werden als beim direkten Nachweis von CEACAM3 mittels anit-HA Antikörpers. Dieser Unterschied lässt auf die Interaktion der Grb2-SH2 Domäne mit tyrosinphosphorylierten endogenen Proteinen schließen. Insgesamt zeigt dieses Experiment, dass die Detektion von gebundenen tyrosinphosphorylierten Proteinen auch mittels monoklonalem anti-pTyr Antikörpern möglich ist.

In einem weiterführenden Versuchsaufbau sollte überprüft werden, ob der SH2 Domänen Array auch zur Betrachtung des gesamten pTyr-Proteoms eines Zelllysats auf der Ebene von endogenen Proteinen angewendet werden kann. Hierzu sollte das pTyr-abhängige Interaktionsmuster eines Zelltyps in Abhängigkeit von An- und Abwesenheit einer endogenen PTK untersucht werden. Für diese Untersuchungen wurde die humane kolorektale Karzinomzelllinie DLD1 verwendet. Bisher zeigten zahlreiche Studien, dass pathologische Migrationsvorgänge, wie die Tumormetastasierung, auf verstärkte Tyrosinphosphorylierungs-prozesse zurückzuführen sind. In diesem Zusammenhang konnte für verschiedene humane Krebsarten eine gesteigerte FAK-Expression bzw. FAK-Aktivität nachgewiesen werden (Cance et al. 2000; Yu et al. 2006; Chatzizacharias et al. 2008). Die Unterdrückung der FAK-Expression in einer Karzinomzelllinie sollte somit einen Effekt auf die Tyrosin-phosphorylierungen dieses Zelltyps haben. Es wurde erwartet, dass die Unterdrückung der FAK-Expression eine reduzierte Menge an tyrosinphosphorylierten Proteinen zur Folge hat.

Diese Unterschiede, zwischen den wildtypischen Karzinomzellen und den Zellen mit reduzierter FAK-Expression sollten auf Ebene des gesamten pTyr-Proteoms mittels des SH2 Domänen Arrays untersucht werden. Arbeiten an unserem Lehrstuhl zeigten, dass die humane kolorektale Karzinomzelllinie DLD1 eine starke FAK-Expression und ein hohes Migrations-potential aufweist. Die Unterdrückung der FAK-Expression in diesem Zelltyp mittels der shRNA-Methodik bewirkte die Aufhebung dieses hohen Migrationspotentials. Aus diesem Grund wurde diese Zelllinie für weitere Untersuchungen verwendet. Ziel dieses Versuchsaufbaus war es, ein verändertes Bindungsverhalten endogener pTyr-Proteine an die SH2 Domänen zu visualisieren, wenn die Expression von endogener FAK unterdrückt ist. Zu

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diesem Zweck wurden zwei stabile DLD1 Zelllinien verwendet. Die eine Zelllinie exprimierte eine short-hairpin (sh)RNA gegen die FAK, während die andere Zelllinie eine ungerichtete (scrambled) shRNA exprimierte und somit DLD1-Wildtyp Eigenschaften aufwies. Nach einem 24 stündigen Serumentzug wurden die Zellen lysiert. Die Lysate wurden in einem Western Blot hinsichtlich der Expression von endogener FAK untersucht (Abb. 2.2.8A).

Abb. 2.2.8 Die unterdrückte Expression von endogener FAK in DLD1 Zellen resultiert in verändertem Bindungsverhalten von endogenen tyrosinphosphorylierten Proteinen an verschiedene SH2 Domänen. (A) DLD1 Zellen mit stabiler Expression von shRNA gegen FAK oder ungerichteter shRNA (shRNA-scrambled) wurden durch Western Blot Analyse auf endogene Expression überprüft. Zum Nachweis der FAK-Expression wurde ein monoklonaler anti-FAK Antikörper verwendet. (B) Repräsentative Abbildung von zwei identischen Arrays, die mit DLD1 Ganzzelllysaten (siehe (A)) beprobt wurden. Die an die SH2 Domänen gebundenen endogenen Phosphotyrosinproteine wurden mittels monoklonalem anti-Phosphotyrosin Primärantikörper und Cy3-markiertem Sekundärantikörper nachgewiesen. Die Anordnung der GST-Proteine innerhalb eines Arrays ist tabellarisch dargestellt. (C) Grafische Darstellung der unter (B) detektierten und in Relativwerte umgerechneten Nettobindungssignale. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardfehler des Mittelwerts aus Vierfachbestimmungen von drei unabhängigen Experimenten.

Protein-Protein Interaktionen

Um vergleichbare Bindungssignale der Lysate mit und ohne FAK-Expression zu gewährleisten, wurden die Lysate vor der Beprobung der Arrays auf einen Gesamtprotein-gehalt von 0,5 mg/ml eingestellt. Anschließend wurden die Lysate zur Beprobung zweier identischer Arrays benutzt und die gebundenen, endogenen Phosphotyrosinproteine mittels anti-pTyr Primärantikörper nachgewiesen. Vergleicht man die relativen Signalintensitäten des DLD1 Lysates mit der scrambled shRNA mit den Signalintensitäten des Lysats mit der reduzierten FAK-Expression, ist ein Rückgang der Bindung an verschiedene SH2 Domänen zu erkennen (Abb. 2.2.8B und C). Für die SH2 Domänen der PI3KR1 (N-terminale und Tandem (NC)-SH2 Domäne) und Hck beträgt dieser Rückgang mehr als 60 %. Für die Interaktionen mit der C-terminalen SH2 Domäne von PI3KR1 ist bei herunterregulierter FAK-Expression nur ein mäßiger Rückgang zu verzeichnen – ebenso für die SH2 Domänen der Adapterproteine Nck1, Nck2, Grb2, der Src-Kinase Hck und des Guaninnukleotid-Austauschfaktors Vav1. Die Abwesenheit von FAK zeigte keine Veränderung bei der Bindung von pTyr-Proteinen an die SH2 Domäne von Tensin-1 (TNS1), welches ein wichtiges Protein in Fokalkontakten ist und eine entscheidende Rolle bei der Zellmigration spielt (Le Clainche and Carlier 2008). Auch die SH2 Domänen der bekannten FAK-Interaktionspartner Src, Phospholipase-Cγ-1 (PLCG1; N- und C-terminale SH2 Domäne) und SHC zeigten keine Unterschiede im pTyr-abhängigen Bindungsverhalten bei herunter-regulierter FAK-Expression. Allerdings bewegten sich die Bindungssignale in einem sehr niedrigen Detektionsbereich, wodurch eine exakte Auswertung dieser Signale nicht gewährleistet werden konnte. Durch diesen Versuchsaufbau ist es gelungen, nicht nur die Bindung überexprimierter, sondern auch endogener Phosphotyrosinproteine an die SH2 Domänen nachzuweisen.

Zusammenfassend betrachtet zeigen diese Ergebnisse, dass der SH2 Domänen Array durch Verwendung unterschiedlicher monoklonaler und polyklonaler Antikörpern gegen Epitop-Tags oder spezifische Strukturen wie Phosphotyrosine zur Beantwortung verschiedener Fragestellungen herangezogen werden kann.

2.2.4 Verifikation des SH2 Domänen Arrays – Nachweis zytoplasmatischer