Die Bindung Opa 52 -exprimierender Gonokokken an CEACAM3

PI3KR3 an den Rezeptor

Es ist bereits bekannt, dass die PI3-Kinasen (PI3Ks) der Klasse I essentiell für die Fc-Rezeptor-vermittelte Phagozytose von opsonisierten Partikeln durch Makrophagen der Maus sind (Swanson and Hoppe 2004). Auch in Bezug auf die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von Bakterien konnte gezeigt werden, dass die PI3Ks in diesen Prozess involviert sind (Booth et al. 2003). Deshalb sollte im Folgenden untersucht werden, ob die PI3-Kinasen auch am CEACAM3-vermittelten Aufnahmeprozess von Opa52-exprimierenden N. gonorrhoeae beteiligt sind.

In diesem Zusammenhang musste als erstes die Frage geklärt werden, ob die N-terminale SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der Klasse I PI3K (PI3KR3) in die Nähe von CEACAM3 rekrutiert wird, wenn dieser Rezeptor mit Opa52-exprimierenden Gonokokken interagiert. Hierfür wurden HEK293T Zellen mit GFP-fusioniertem CEACAM3 (CEACAM3 WT-GFP) oder einer verkürzten Form von CEACAM3, bei der der zytoplasmatische Abschnitt deletiert war (CEACAM3 CT-GFP), transfiziert. Zusätzlich wurde noch die mKate-fusionierte N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 (mKate-PI3KR3-N-SH2) transfiziert. Als Positivkontrolle diente ein Kotransfektionsansatz von CEACAM3 WT-GFP mit der mKate-fusionierten SH2 Domäne der Src-PTK Hck (mKate-Hck-SH2). Es ist bereits bekannt, dass die Proteintyrosinkinase Hck über ihre SH2 Domäne mit tyrosinphosphoryliertem CEACAM3 kolokalisiert und direkt interagiert (Hauck et al. 1998;

Schmitter et al. 2007b; Buntru et al. 2009). Die Zellen wurden mit Pacific Blue-gefärbten N.

gonorrhoeae infiziert, welche entweder keine Opa-Proteine (Ngo Opa-) oder Opa52 (Ngo Opa52) exprimierten. Anschließend wurden die Zellen mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. In Zellen, die mit Opa52-exprimierenden Gonokokken infiziert waren, akkumulierte die mKate-Hck-SH2 Domäne in der Nähe des Bakterien-gebundenen CEACAM3 (Abb. 3.1.4).

Abb. 3.1.4 Die N-terminale SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der Phosphatidylinositol-3’-Kinase wird in die Nähe des Gonokokken-gebundenen CEACAM3 rekrutiert. HEK293T Zellen wurden mit den angegebenen mKate-fusionierten SH2 Domänen und mit Plasmiden, kodierend für GFP-fusioniertes Wildtyp CEACAM3 (CEACAM3 WT) oder der verkürzten CEACAM3-Variante ohne den zytoplasmatischen Abschnitt (CEACAM3 CT) kotransfiziert. Die Zellen wurden für 30 min mit einer MOI = 30 mit Opa₅₂ -exprimierenden (Ngo Opa52) N. gonorrhoeae oder mit N. gonorrhoeae, welche keine Opa Proteine (Ngo Opa-) exprimieren, infiziert, fixiert und mittels Konfokalmikroskopie analysiert. Die Rekrutierung der SH2 Domäne in Bereiche, wo CEACAM3 mit Ngo interagiert, ist durch weiße Pfeilköpfe gekennzeichnet. Die Maßbalken repräsentieren 10 µm.

3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen

In gleicher Weise kolokalisierte auch mKate-PI3KR3-N-SH2 mit CEACAM3, wenn Opa52 -exprimierende Gonokokken mit dem Rezeptor assoziierten (Abb. 3.1.4). Im Gegensatz dazu erfolgte keine Rekrutierung von mKate-PI3KR3-N-SH2 in Zellen, die CEACAM3 CT-GFP exprimierten. Dies ist darauf zurückzuführen, dass dieser CEACAM3-Variante die ITAM-ähnliche Sequenz fehlt, welche für die Bindung von SH2 Domänen verantwortlich ist. Um zu überprüfen, ob die PI3KR3-N-SH2 Domäne generell mit CEACAM3 assoziiert, wurden Zellen mit Gonokokken infiziert, welche keine Opa-Proteine (Opa-) exprimieren und deshalb nicht an CEACAM3 binden. Somit war es nicht überraschend, dass lediglich eine sehr geringe Anzahl von Bakterien mit CEACAM3-exprimierenden Zellen assoziierten (Abb. 3.1.4). Weiterhin ist auch zu erkennen, dass weder der Rezeptor selbst noch die PI3KR3-N-SH2 Domäne verstärkt an die Stellen der Zellmembran rekrutiert werden, an denen der Kontakt mit den Bakterien stattfindet. Dieses Ergebnis zeigt, dass die PI3K in Abhängigkeit der Bindung von Opa52-exprimierenden Gonokokken an den stimulierten Rezeptor rekrutiert werden kann. In diesem Zusammenhang wurde eine weitere Kontrolle durchgeführt, um die Spezifität der Rekrutierung der PI3KR3-N-SH2 Domäne an CEACAM3 zu überprüfen. Hierfür wurden HEK293T Zellen mit CEACAM3 WT-GFP und der mKate-fusionierten SH2 Domäne des Adapterproteins Slp76 (mKate-Slp76-SH2) kotransfiziert. Die Slp76-SH2 Domäne zeigte in biochemischen Analysen keine Interaktion mit CEACAM3 (Schmitter et al. 2007b). Auch die vorliegende konfokalmikroskopische Analyse zeigte, dass die SH2 Domäne von Slp76 nicht an den durch Gonokokken stimulierten Rezeptor rekruiert wird (Abb. 3.1.4). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die PI3Ks der Klasse I über die N-terminale SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 spezifisch an den zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 rekrutiert werden. Diese Rekrutierung ist dabei abhängig von der Bindung Opa52-exprimierender Gonokokken an den Rezeptor.

Die bereits in den Kapiteln 3.1.2.1 und 3.1.2.2 vorgestellten Ergebnisse der in vitro Experiment deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen CEACAM3 und der PI3KR3-N-SH2 Domäne direkter Natur ist und über die phosphorylierten Tyrosinreste der ITAM-ähnlichen Sequenz des Rezeptors vermittelt wird. Um zu überprüfen, ob diese Interaktion auch in intakten Zellen stattfindet, wurden Untersuchungen auf Grundlage des Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers (FRET) durchgeführt. Beim FRET wird Energie eines angeregeten Farbstoffes (Donor) auf einen zweiten Farbstoff (Akzeptor) übertragen. Der Energietransfer findet dabei strahlungsfrei, d. h. ohne Abgabe oder Aufnahme von Photonen, statt. Dieser strahlungsfreie Energietransfer kann allerdings nur stattfinden, wenn sich Donor und

Akzeptor in sehr enger räumlicher Nähe (wenige Nanometer) zueinander befinden (Clegg 1995). Sollen zwei Proteine auf eine direkte Interaktion untersucht werden, muss ein Molekül mit einem Donorfluorophor und das andere mit einem passenden Akzeptorfluorophor markiert werden. Um die Interaktion zwischen CEACAM3 und der PI3KR3-N-SH2 Domäne mittels der FRET Methode untersuchen zu können, wurde der Rezeptor an seinem C-Terminus mit dem FRET-Donor CyPet fusioniert und die PI3KR3-N-SH2 Domäne mit dem FRET-Akzeptor YPet. Sowohl in Ganzzelllysaten als auch in intakten Zellen, welche CEACAM3-CyPet und die YPet-PI3KR3-N-SH2 Domäne koexprimierten, konnte ein FRET gemessen werden (siehe (Buntru et al. 2011)).

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die PI3Ks der Klasse I über die N-terminale SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 direkt an den tyrosinphosphorylierten, zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 binden. Dabei ist diese Interaktion auf die Stellen der Zelle beschränkt, an denen Opa52-exprimierende Gonokokken über CEACAM3 mit der Wirtszelle in Kontakt treten.

3.1.2.4 Die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von Bakterien ist