Das menschliche Chromatin-assoziierte DEK-Protein:
Funktionelle Domänen und Phosphorylierung
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat) des Fachbereiches Biologie
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Universität Konstanz
Vorgelegt von Ferdinand Kappes Konstanz, im August 2004
Tag der mündlichen Prüfung: 19. November 2004 Referentin: Priv-Doz. Dr. Claudia Gruss Referent: Prof. Dr. Rolf Knippers
Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht:
Kappes, F., C. Damoc, R. Knippers, M. Przybylski, L. A. Pinna, and C. Gruss. 2004.
Phosphorylation by Protein Kinase CK2 Changes the DNA Binding Properties of the Human Chromatin Protein DEK. Mol Cell Biol 24:6011-20.
Kappes, F.*, I. Scholten*, N. Richter, C. Gruss, and T. Waldmann. 2004. Functional Domains of the Ubiquitous Chromatin Protein DEK. Mol Cell Biol 24:6000-10.
* geteilte Erstautorenschaft
Waldmann, T., I. Scholten, F. Kappes, H.G. Hu, and R. Knippers. 2004. The DEK protein – an abundant and ubiquitous constituent of mammalian chromatin, in press
Weitere Veröffentlichungen:
Kappes, F., K. Burger, M. Baack, F. O. Fackelmayer, and C. Gruss. 2001. Subcellular localization of the human proto-oncogene protein DEK. J Biol Chem 276:26317-23.
Kulartz, M., E. Hiller, F. Kappes, L. A. Pinna, and R. Knippers. 2004. Protein kinase CK2 phosphorylates the cell cycle regulatory protein Geminin. Biochem Biophys Res Commun 315:1011-7.
Präsentation auf Kongressen:
9/2000 Weimar Conference of Genetics, Weimar Poster-Präsentation
10/2001 Annual Meeting of the German Genetics Society, Halle, Short Talk
10/2003 „1st Symposium of Transregio 5“, München, Poster-Präsentation
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Januar 2001 bis August 2004 am Lehrstuhl für Molekulare Genetik (Prof. Dr. R. Knippers) der Universität Konstanz angefertigt.
Bei meiner Betreuerin Priv. Doz. Dr. Claudia Gruss möchte ich mich für die Bereitstellung des Themas, für das stete Interesse am Fortgang der Arbeit, für die Diskussionsbereitschaft und für den vierwöchigen Forschungsaufenthalt in Oslo bedanken. Sie schied im Januar diesen Jahres durch eine Stellung in der Industrie aus. Ich wünsche Ihr von ganzem Herzen weiterhin viel Erfolg.
Herrn Prof. Dr. R. Knippers möchte ich für die Aufnahme in die Arbeitsgruppe danken, für das Interesse an der Arbeit und für die viele Unterstützung, die mir gerade nach dem Ausscheiden von Claudia Gruss entgegengebracht wurde.
Einen besonderen Dank möchte ich dem „DEK-Labor“ aussprechen, denn Tanja Waldmann, Nicole Richter, Friederike Knoche, Ingo Scholten und Hong Gang Hu, waren nicht nur Mitstreiter und oft genug Leidensgenossen im wissenschaftlichen Sinne, sondern schafften auch eine einzigartig freundschaftliche Atmosphäre. Dies wird mir sehr fehlen. Nicole und Tanja sei ganz besonders für die wunderbare Zusammenarbeit im „Mutanten“-Projekt und bei den unzähligen Reinigungen gedankt. Bei Tanja möchte ich mich noch ganz herzlich für die unermüdliche Hilfe, die Durchsicht dieses Manuskripts und für die vielen aufmunternden Worte, gerade am Schluss dieser Arbeit, bedanken.
Martina Baack, die immer ein offenes Ohr für mich hatte, möchte ich für die vielen methodischen Tipps und für die vielen fruchtbaren Diskussionen danken, ohne die einiges nicht so gut geklappt hätte.
Catalina Damoc gebührt ein großer Dank für die Durchführung der Massenspektrometrie.
Ein weiterer Dank geht an Monika Kulartz und Daniel Schaarschidt, die beide immer sehr hilfsbereit waren und gerade am Schluss viel Geduld bei der Durchsicht des Manuskriptes aufgebracht haben.
Allen anderen Mitgliedern der Arbeitsgruppe, die namentlich nicht erwähnt wurden, möchte ich an dieser Stelle für die große Hilfsbereitschaft und das Miteinander danken. So trug jeder einzelne ein Stück zu dieser Arbeit bei.
Bei Anita Krebs, die ein Jahr in unserer Gruppe verbrachte, möchte ich mich für den großen Enthusiasmus für die Problembewältigung des Baculovirus-Systems bedanken.
Bei Sonja von Aulock möchte ich mich für die Einführung in die FACS-Messung bedanken.
Ein Dankeschön geht hier auch an New England Biolabs, ohne deren „λ-Phosphatase“ die meisten hier gezeigten Daten nicht zustande gekommen wären.
Meinen „Mädels“ möchte ich ebenfalls einen Dank aussprechen für die vielen unschlagbaren
„Konstanzer“-Nächte, den unzähligen Erörterungen über das Leben und die Welt und für das
„ichsein-dürfen“. Karina möchte ich hier einen besonderen Dank aussprechen, denn „du bist nicht alles, aber ohne dich ist alles nichts“.
Danke auch an Alex und Nino, die die Zeit in Konstanz mit so manch unvergesslichen Stunden gefüllt haben.
Meiner WG und der Nachbarin möchte ich für die schöne Zeit danken und für die vielen kleinen wundervollen Gesten, die mir entgegengebracht wurden.
Auch wenn ich im Laufe dieser Arbeit neben Höhen auch so manche Tiefen durchschritten habe, so entschädigte doch jedes Ergebnis vielfach und ließ die Freude an dieser faszinierenden Wissenschaft nie untergehen.
Sehr schmerzlich war der Verlust meiner Oma, die die Fertigstellung dieser Arbeit leider nicht mehr miterleben durfte.
Der letzte Dank an dieser Stelle gebührt meinen Eltern, die, obwohl nicht immer glücklich mit meinem eingeschlagenen Lebensweg, doch immer kompromisslos hinter mir standen und sich meist mehr gefreut und meist mehr gelitten haben als ich selber. Ich bin unendlich froh, euch zu haben. Diese Arbeit widme ich euch. Danke, euer Nondi.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis IV Abbildungsverzeichnis: VIII
1 Einleitung 10
1.1 Der Zellkern 10
1.2 Chromatin 12
1.2.1 Hierarchische Organisation des Chromatins 13
1.2.2 Histone 15
1.3 Modifikation der Chromatinstruktur 16
1.3.1 Posttranslationale Modifikation der Histone 17
1.3.2 Nicht-Histon-Proteine: HMG Proteine 19
1.3.2.1 HMGB (HMG-1/-2) 20
1.3.2.2 HMGA (HMGY/I) 21
1.3.2.3 HMGN (HMG14 / -17) 22
1.3.3 Chromatinremodeling 23
1.4 Das DEK-Protein 24
1.4.1 Entdeckung 24
1.4.2 Eigenschaften 25
1.4.3 Subzelluläre Lokalisation und Zellzyklusverhalten 26
1.4.4 Topologieveränderung und DNA-Bindung 27
1.4.5 Interaktion mit anderen Proteinen 28
1.4.5.1 Interaktion AP-2α, einem Transkriptionsaktivator 28 1.4.5.2 Interaktion mit Daxx, einem Transkriptionsrepressor 28
1.4.5.3 Interaktion mit LANA 29
2 Zielsetzung 30
3 Material und Methoden 31
3.1 Material 31
3.2 Allgemeine Lösungen 33
3.3 Allgemeine Methoden 35
3.3.1 SDS-Polyacryalmid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 35 3.3.2 Coomassie Färbung und Silber Färbung von Polyacrylamid Gelen
35
3.3.3 Western-Blot und Immunfärbung (Immunblot) 35
3.3.4 Proteinfällung nach Wessel und Flügge (1984) 36
3.3.5 Agarosegelelektrophorese 36
3.3.6 DNA Fällung 36 3.3.7 Plasmid-Präparation und Cäsiumchlorid Reinigung 37
3.4 Baculovirus-System und Proteinreiniung 37
3.4.1 Klonierung von His-DEK 37
Ko-Transfektion und Plaque-Assay 38 3.4.2 Infektion, Reinigung und Dephosphorylierung von His-DEK und
His-DEK Deletionsmutanten 41 3.5 Antikörperproduktion und Reinigung 42
3.6 SV40 44
3.6.1 Präparation von SV40-DNA 44
3.6.2 Präparation von SV40-Minichromosomen 44
3.7 Topologieassay (DEK Assay) 45
3.8 DNA-Bandshiftassay (EMSA) 45
3.9 Zellkultur, Synchronisation, Radioaktive Markierung mit [32P]- Orthophosphat und [35S]-Methionin (Pulse- und Pulse Chase
Experimente), S-20 Extrakte, Hancock-Chromatin und
Immunpräzipitation 45
3.9.1 HeLa und CV1 Zellen 45
3.9.2 Insektenzellen 46
3.9.3 Synchronisation und in vivo Pulse-Markierung mit [32P]-
Orthophosphat und [35S]-Methionin 46
3.9.4 FACS Analyse 47
3.9.5 Herstellung von Hanckock Chromatin 47
3.9.6 Immunpräzipitation 48
3.9.7 Herstellung von S-20 Extrakten 49
3.10 In Vitro Phosphorylierung 49
3.11 In-Gel-Kinaseassay 50
3.12 Filter-Bindungs-Assay 50
3.13 South-Western-Analysen 51
3.14 Zellfraktionierung 51
3.15 Mikrokokken Nuklease Verdau 52
3.16 Sucrose-Dichtengradientenzentrifugation 53 3.17 RNA-Präparation, Reverse Transkription und Real Time PCR 53
3.18 Massenspektrometrie 54
3.18.1 In-Gel-Verdau 54
3.18.2 Triple-Quadrupole-Ion-Trap-Massenspektrometrie 54 3.18.3 Datenbank-Suche und Kennzeichnung der Phosphopeptide 55
4 Ergebnisse 56 4.1 Biochechemische Charakterisierung von DEK in vivo 56
4.1.1 DEK mRNA während des Zellzyklus 56
4.1.2 Neusynthese des DEK-Proteins während des Zellzyklus 57
4.1.3 Halbwertszeit des DEK-Proteins in vivo 59
4.1.4 DEK wird während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert 60 4.2 Expression, Reinigung und Charakterisierung von
rekombinantem His-DEK mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystem 62
4.2.1 His-DEK aus dem Baculovirus-System ist hoch phosphoryliert 63 4.3 Charakterisierung der DEK-Phosphorylierung 65
4.3.1 Phosphorylierung von DEK in vitro mit Zellextrakten 65 4.3.2 Potenzielle DEK-phosphorylierende Kinasen und deren
Phosphorylierungsstellen 67 4.3.3 DEK wird durch die Protein-Kinase CK2 in vitro und in vivo
phosphoryliert 68 4.3.3.1 Filter-Bindungsassays mit gereinigten Kinasen 68
4.3.3.2 „In-Gel-Kinaseassay“ 69
4.3.3.3 Inhibition der DEK-Phosphorylierung mit TBB, einem hoch
spezifischen CK2-Inhibitor 71 4.3.3.4 Kartierung der CK2-Phosphorylierungsstellen in der DEK-
Aminosäuresequenz 74 4.4 Funktionelle Domänen des DEK-Proteins 77
4.4.1 Nur dephosporyliertes His-DEK führt, wie GST-DEK, zur Bildung
einer Topoisomerleiter und bindet an DNA 80 4.4.2 Dephosporyliertes His-DEK bindet wie GST-DEK an SV40
Minichromosomen 81 4.4.3 DNA-Bindung und Toplologierveänderung von DEK und DEK-
Deletionsmutanten 83 4.4.4 Das SAF-Box enthaltende Fragment 87-187 bindet DNA 83
4.4.5 Das SAF-Box-Fragment (87-187) ist für die Topologieveränderung
verantwortlich 85 4.4.6 Identifizierung einer zweiten DNA-Bindedomäne (270-350) des
DEK-Proteins 86 4.5 Biochemische Aspekte der DEK-Phosphorylierung 88
4.5.1 DEK-Multimerisierung und Phosphorylierung 88
4.5.2 Effekte der CK2-Phosphorylierung auf die DEK-DNA-Bindung. 91 4.5.3 Einfluss der CK2-Phosphorylierung auf die Aktivität der beiden
DEK-DNA-Bindedomänen? 94 4.5.4 Effekte der CK2-Phosphorylierung auf die DEK-Chromatin-
Interaktion 96
4.5.4.1 Eine stärkere Phosphorylierung in der G1-Phase des
Zellzyklus führt zu keiner Lokalisationsänderung von DEK 101 4.5.5 Wie wird phosporyliertes DEK an Chromatin gebunden? 103 4.6 DEK ist nur phosphoryliert auf Hancock-Chromatin zu finden 107
5 Diskussion 109
5.1 DEK-mRNA, DEK-Neusynthese und Halbwertszeit von DEK in HeLa Zellen 110 5.2 DEK wird während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert 112
5.2.1 Kann eine erhöhte Phosphorylierung von DEK alleine durch die
CK2 hervorgerufen werden? 115 5.3 DEK – ein Protein mit mehreren Modulen 117
5.3.1 Das SAF-Box enthaltende Fragment (87-187) des DEK-Proteins ist für die DNA-Bindung und für die Topologieveränderung verantwortlich.
117 5.3.2 Der Bereich 270-350 stellt eine zweite DNA-Bindedomäne von
DEK dar 122
5.4 Phosphorylierung durch die Protein Kinase CK2 – Regulation der DEK-Funktion ? 123
5.4.1 Einfluss der CK2-Phopshorylierung auf die DEK-Chromatin-
Bindung 125
5.4.2 DEK bleibt in vivo auch im phosphorylierten Zustand mit
Chromatin assoziiert. 127 5.4.3 Regulation der DNA-Bindung und Multimerisierung von DEK
durch die CK2- ein Modell 127
6 Zusammenfassung 130
7 Literatur 131
8 Abkürzungen 139
Abbildungsverzeichnis:
Abbildung 1-1 Subkompartimentierung des Nukleus 11 Abbildung 1-2 Modellvorstellung der Genomorganisation 12 Abbildung 1-3 Das Nukleosom 14 Abbildung 1-4 Hierarchische Organisation von Chromatin 15 Abbildung 1-5 Die „Core“-Histone 16 Abbildung 1-6 Modifikationen von Histon H3 und H4 18 Abbildung 1-7 Die „histone-code“-Hypothese 19 Abbildung 1-8 Die HMG-Proteine 20 Abbildung 1-9 Domänen des humanen DEK-Proteins 25 Abbildung 3-1 pBlueBacHis2 38 Abbildung 3-2 Prinzip der homologen Rekombination zur Gewinnung von
rekombinanten Viren 40 Abbildung 3-3 „Plaque“-Assay 41 Abbildung 3-4 Reinigung über Ni-NTA-Agarose 42 Abbildung 4-1 DEK m-RNA während des Zellzyklus 57 Abbildung 4-2 Neusynthese von DEK während des Zellzyklus 58 Abbildung 4-3 Halbwertszeit von zellulärem DEK 60 Abbildung 4-4 Phosphorylierung von DEK in vivo 62 Abbildung 4-5 Reinigung von wtHis-DEK aus dem Baculovirus-System 63 Abbildung 4-6 His-DEK wird phosphoryliert exprimiert 64 Abbildung 4-7 In vitro Phosphorylierung von DEK 66 Abbildung 4-8 Potenzielle Phosphorylierungsstellen von DEK 67 Abbildung 4-9 Filterbindungs-Assay mit gereinigten Kinasen 68 Abbildung 4-10 „In-Gel-Kinaseassay“ 69 Abbildung 4-11 Filterbindungs-Assay und Inhibition der CK2 durch TBB 72 Abbildung 4-12 Inhibition der DEK-Phosphorylierung durch Einstz von TBB in vitro und in vivo 73 Abbildung 4-13 Kartierung von CK2-Phosphorylierungsstellen durch ESI-MS 75 Abbildung 4-14 Identifizierte Peptide und Gesamtabdeckung 76 Abbildung 4-15 Schematische Darstellung aller klonierten und überexprimierten DEK-Deletionsmutanten 78 Abbildung 4-16 Darstellung einer Auswahl an gereinigten Deletionsmutanten aus dem Baculovirus-System 79 Abbildung 4-17 EMSA, South-Western und Topologieassay mit wtHis-DEK 81 Abbildung 4-18 Bindung von unbehandeltem und dephosphoryliertem His-DEK an salzgewaschene SV40 Minichromosomen 82 Abbildung 4-19 EMSAs mit wt-His-DEK und verschiedenen DEK
Deletionsmutanten 84 Abbildung 4-20 Topologieassay mit verschiedenen DEK-Deletionsmutanten 86
Abbildung 4-21 EMSA mit C-terminalen DEK Fragmenten 87 Abbildung 4-22 Sedimentationsanalyse und native Gelelektrophorese von
phosphoryliertem und dephosphoryliertem His-DEK 90 Abbildung 4-23 Sedimentationsverhalten von DEK in einer CK2-
Phosphorylierungszeitreihe 91 Abbildung 4-24 Phosphorylierung durch die Protein Kinase CK2 inhibiert die DEK-DNA Bindung 93 Abbildung 4-25 93 Abbildung 4-26 EMSAs mit CK2-phosphorylierten DEK-Fragmenten 95 Abbildung 4-27 Mikrokokken-Nuklease Verdau von SV40-Minichromosomen 97 Abbildung 4-28 Interaktion von dephosphoryliertem und phosphoryliertem His- DEK mit salzgewaschenen SV40-Minichromosomen 99 Abbildung 4-29 Gereinigte CK2 phosphoryliert endogenes, nukleosomal
gebundenes DEK 100 Abbildung 4-30 Zellfraktionierung von G1-Phase-Zellen 102 Abbildung 4-31 Assoziation von dephosphoryliertem und phosphoryliertem His- DEK mit nativen Oligonukleosomen 105 Abbildung 4-32 Hancock-Chromatin-Präparation 108 Abbildung 5-1 Funktionelle Domänen des DEK-Proteins 123 Abbildung 5-2 Modell einer möglichen Regulation der DEK-Funktion durch CK2- Phosphorylierung 128
1 Einleitung
1.1 Der Zellkern
Der Zellkern setzt das Prinzip der Kompartimentierung der eukaryotischen Zelle durch die Existenz einer Kernhülle um. Dies ist einer der fundamentalsten Unterschiede zur prokaryotischen Zelle. Die Kernhülle besteht aus zwei Lipid- Doppelschichten, von denen die äußere kontinuierlich in das Membransystem des Endoplasmatischen Retikulums übergeht, während die andere sich zum Kerninneren hin orientiert. Die Kernmembran ist durch Kernporenkomplexe durchspannt, die den Transport von Makromolekülen von und in den Kern regulieren (z.B. (Adam, 2001) und damit den Informationsaustausch zwischen Kern und Cytoplasma ermöglichen. Der Kern wird durch ein Geflecht von Intermediärfilamenten beweglich in der Zelle verankert. Die innere Stabilität wird durch die Kernlamina, die auch den Ab- und Wiederaufbau während der Kernteilung reguliert, vermittelt (Vlcek et al., 2001; Gruenbaum et al., 2003). Die Kernlamina ist auch an vielen anderen Prozessen regulierend beteiligt.
Trotz der hohen Dichte an Proteinen, DNA und RNA im Zellkern, muss ein geordneter und regulierter Ablauf aller genetischen Prozesse ermöglicht werden. Dies wird, nach Meinung vieler Autoren, durch eine weitere Subkompartimentierung des Nukleus erreicht. Das am längsten bekannte Subkompartiment des Nukleus ist der Nukleolus, der den Ort der rRNA- Synthese und des Ribosomenzusammenbaus darstellt (Scheer and Weisenberger, 1994). Eine weitere funktionelle Kompartimentierung erfolgt durch die Chromosomen Territorien. Jedes Chromosom nimmt, seinem DNA- Gehalt folgend, ein bestimmtes, nicht überlappendes Territorium im Zellkern ein (Lichter et al., 1988), welches wiederum in sogenannte subchromosomale Foci untergliedert ist. Aktive Gene oder aktive Transkriptionseinheiten sind hierbei auf der Oberfläche, inaktive Gene eher im inneren Bereich zu finden (Croft et al., 1999). In diesen Territorien lassen sich weitere Strukturen, die sogenannten PcG-Körper finden, die Polycomb Proteine enthalten und dadurch heterochromatische Bereiche darstellen (Saurin et al., 1998). Diese Bereiche können mit der Kernlamina assoziiert sein. Die Bereiche zwischen den Chromosomenterritorien werden durch das Inter-Chromatin-Domänen- Kompartiment (ICD) ausgefüllt (Bridger et al., 1998). Dieses „Kanalsystem“
umgibt die Territorien, durchspannt sie teilweise und dient als Transportweg für Makromoleküle (z.B RNA) aus dem Kern. Pre-mRNA Spleißproteine kommen gehäuft in den sogenannten „nuclear-speckles“ vor, wovon es pro Zelle etwa 25-50 gibt (Spector, 1993). Weitere verschiedene örtlich eingegrenzte
Strukturen wurden kollektiv als „nuclear-bodies“ bezeichnet (Grande et al., 1997) (Gall, 2000), (Schul et al., 1996).
Die räumliche Trennung dieser Subkompartimente wird vermutlich über die Assoziation oder Anheftung an die sogenannte Kernmatrix vermittelt. Die Kernmatrix ist eine operational definierte Struktur, deren genaue Zusammensetzung noch nicht erschöpfend bekannt ist. Sie kann durch enzymatische Extraktion des Chromatins gewonnen werden und beinhaltet Teile der Kernporenkomplexe, Überreste der Nukleoli und ein dreidimensionales Netzwerk, das hauptsächlich aus heterogener RNA und verschiedenen Proteinen besteht. Die RNA übt bei der Aufrechterhaltung der faserigen Struktur eine wichtige Rolle aus (Xing and Lawrence, 1991),(He et al., 1990). Behandelt man Zellen mit Transkriptionshemmstoffen führt dies zum Zusammenbruch der Kernmatrix, was eine direkte Korrelation zwischen Transkription und der Existenz der Kernmatrix vermuten lässt (Fey et al., 1986);
(Nickerson et al., 1989).
Abbildung 1-1 Subkompartimentierung des Nukleus
Der Nukleus ist eine mosaikartig zusammengesetzte Organelle, die durch die Kernhülle vom Cytoplasma getrennt ist. Die größten Strukturen sind die Chromosomenterritorien, die durch die ICD-Domänen voneinander getrennt werden. Weitere „Kompartimente“ sind schematisch dargestellt (entnommen aus Architektur des Zellkerns (Fackelmayer, 2000).
Die Kernmatrix scheint daher im Interphase-Kern eine wichtige Rolle bei der Organisation des Genoms und der subnuklearen Kompartimente zu haben (Gasser et al., 1989).
Man geht davon aus, dass die Chromatinfasern in Schleifen von ca. 20000- 80000 bp organisiert sind. Es wird vermutet, dass jede Schleife, in vivo einen funktionellen Abschnitt darstellt (Gasser et al., 1989). Die Chromatinschleifen sind über SAR/MAR-Bereiche an die Kernmatrix gebunden. Die 200-3000 bp
langen SAR/MAR-Elemente zeichnen sich durch AT-Reichtum aus und befinden sich meist außerhalb von kodierenden Regionen. Den SAR/MAR- Bereichen wird eine Funktion bei der Aufrecherhaltung der Domänenorganistion eukaryotischer Gene, bei der Transkriptionsaktivierung und bei der DNA- Replikation zugesprochen. Häufig werden SAR/MAR-Elemente stromaufwärts und -abwärts von transkribierten Genen oder Gengruppen gefunden oder liegen in unmittelbarer Nähe von regulatorischen Sequenzen, wie Promotoren und Enhancern (Blasquez et al., 1989; Bonifer et al., 1991). Als Beispiele für SAR/MAR-bindende Proteine sind SAF-A (Romig et al., 1992a), Topoisomerase II (Udvardy et al., 1985; Adachi et al., 1989), Histon H1 (Izaurralde et al., 1989), Lamin B1, A und C (Luderus et al., 1994) bekannt.
Abbildung 1-2 Modellvorstellung der Genomorganisation
Die einzelnen Chromatinschleifen sind an ihrer Basis mit architektonischen Elementen, den SAR/MAR- Bereichen, und über SAR/MAR-bindende Proteine an die Kernmatrix geheftet (entnommen aus: Die Archtitektur des Zellkerns (Fackelmayer, 2000)
1.2 Chromatin
Die DNA, der Träger der genetischen Information aller Organismen, würde in einer eukaryotischen Zelle im ausgestreckten Zustand eine Länge von etwa zwei Meter in Anspruch nehmen. Diese langen Moleküle müssen nicht nur in einem Zellkern von 10-5 m Durchmesser Platz finden, sondern auch in einer hoch organisierten Art und Weise gelagert werden, die verschiedenste Prozesse, wie Transkription, DNA-Replikation, DNA-Reparatur und DNA- Rekombination ermöglichen. Dies wird durch eine Kompaktierung der DNA in verschieden stark kondensierten Schleifen erreicht. Diesen lichtmikroskopisch deutlich anfärbbaren Nukleoproteinkomplex nennt man Chromatin. Neben den
Histonen, den am häufigsten vorkommenden Proteinen im Chromatin, sind noch eine Vielzahl anderer Proteine, wie Nicht-Histon-Proteine, Transkriptionsfaktoren und Topoisomerasen mit diesem assoziiert. Chromatin ist eine hochdynamische Struktur, die verschiedensten Veränderungen, abhängig von dem funktionellen Status der Zelle, unterliegt.
1.2.1 Hierarchische Organisation des Chromatins
Chromatin ist in drei verschiedene Ebenen organisiert, wobei Histon H1 entscheidend an der Entstehung und Aufrecherhaltung höherer Chromatinstrukturen beteiligt ist. Das Nukleosom stellt den kleinsten strukturellen Baustein des Chromatins und gleichzeitig die erste Kompaktierungsstufe dar. Ein Nukleosom besteht aus einem Histonoktamer, um das 146 bp DNA in 1,75 linksgängigen Windungen gewunden sind. Histone sind kleine basische Proteine auf die in Kapitel 1.2.2 eingegangen wird. Durch die Bindung eines Histons H1-Moleküles an die Ein- und Austrittsstelle des Nukleosoms wird dieses zum Chromatosom vervollständigt. Hier sind nun 168 bp DNA in zwei vollen Windungen zu finden (Thoma et al., 1979; Thoma, 1988).
Das Histonoktamer besteht aus je zwei H2A/H2B Dimeren und einem H3/H4 Tetramer, die zusammen die „Core“-Histone bilden. Im Nukleosem wird je ein H3/H4-Tetramer beidseitig von einem H2A/H2B-Dimer flankiert. Verbunden werden die einzelnen Nukleosomen durch die „Linker“-DNA, einem kurzen Stück DNA, die je nach Organismus und Zelltyp zwischen 0 und 120 bp variieren kann (Richmond, 1984; Luger et al., 1997).
Abbildung 1-3 Das Nukleosom
A. Modell des Chromatosoms, bestehend aus dem „Histonoktamer-Kern“ und zwei vollen Windungen der DNA (168 bp), die von einem Molekül H1 an der Ein- und Austrittstelle stabilisiert werden (aus Knippers, 6 Auflage, Thieme Verlag).
B. Darstellung der 4 „core“-Histone, Struktur, Faltung und Interaktionen sind vereinfacht dargestellt. DNA wird durch einen weißen Schlauch symbolisiert. (a) “Core“-Histon Oktamer; (b) Nukleosomen–„Core“
Partikel in der Seitenansicht, mit 1.75 DNA-Windungen um das Oktamer; (c) Nukleosomen–„Core“
Partikel, Ansicht um 90° gedreht; (d) Lage der flexiblen N-terminalen Domönen der „Core“-Histone, Ansicht wie in (b); (e) Aufsicht auf die Struktur (aus (Smith, 1991).
Die nukleosomale Verpackung der DNA wird als „10 nm“-Faser oder auch als Perlenkettenstruktur („beads on a string“) bezeichnet und führt zu einer Kompaktierung um den Faktor 6-7, im Vergleich zu proteinfreier DNA. Mit Bindung von Histon H1 an die Ein- und Austrittstelle des Nukleosoms, bildet sich die sogenannte „30 nm“-Faser aus, bei der sich 6-8 Nukleosomen aufspiralisieren. Histon H1 befindet sich bei diesem sogenannten Solenoidmodell im Inneren der Helix. Diese zweite Kondensationsstufe führt zu einer Kompaktierung um den Faktor 40. Eine weitere Kompaktierung um den Faktor 600-800 wird durch die Anheftung der 30 nm-Faser über SAR/MAR-
Bereiche an die Kernmatrix vermittelt (Wolffe, 1998). Dabei entstehen die in Abbildung 1-2 beschriebenen Schleifen.
Abbildung 1-4 Hierarchische Organisation von Chromatin
Organisation von Nukleosomen in Chromatin. Die „core“-Histone bilden zusammen mit 146 bp DNA das Nukleosom. Es ensteht eine Perlenkettenstruktur („10 nm“-Faser), die durch die Bindung von H1 und unter bestimmten Salzbedingungen zu der „30 nm“-Faser kondensiert (Solenoid-Struktur), wobei H1 immer zur zentralen Helix hin gerichtet ist. Die 30nm Faser spiralisiert sich weiter auf, bildet Schleifen die über die Kernmatrix angeheftet werden können. Rechts, Metaphase-Chromosom. (aus Schiessel, www.mpip- mainz.mpg.de/~heli ).
1.2.2 Histone
Die Histone, kleine basische Proteine, bilden den Proteinbestandteil des Nukleosoms. Sie liegen im Massenverhältnis 1:1 zur DNA vor und sind die evolutionär am höchsten konservierten Proteine. Histone bestehen aus zwei Proteindomänen, einer globulären und ein- bis zwei flexiblen N- oder C- terminalen Armen (Abbildung 1-5).
Die Histone H3 (135 aa, 15 kDa) und H4 (102 aa, 11,2 kDa) sind am höchsten konserviert. Sie unterscheiden sich an nur vier bzw. zwei Stellen zwischen Tier- und Pflanzenzellen. Beide weisen einen hohen Anteil an Arginin auf (13 bzw. 14
%).
H2A (129 aa, 13.9 kDa) und H2B (125 aa, 13.7 kDa) sind weniger stark konserviert und haben einen höheren Anteil an Lysin (11 bzw. 16 %).
H1, das „Linker" Histon, ist das größte (210-230 aa, 22.5 kDa) und zugleich am wenigsten konservierte Histon. Es hat einen sehr hohen Anteil an Lysin (29%).
Im C-terminalen Bereich der „Core“-Histone liegt die „Histone-fold“-Domäne, die maßgeblich an den Wechselwirkungen der Histone untereinander, sowie an der DNA-Bindung beteiligt ist. Diese Domäne besteht aus einer zentral gelegenen großen α-Helix, an die beidseitig jeweils eine kleinere α-Helix angeschlossen ist. Hierbei dient die große α-Helix als Dimerisierungsdomäne, mit deren Hilfe H3 mit H4 sowie H2A mit H2B Heterodimere ausbilden können. Die Kontakte der Histone mit der DNA erfolgt über Argininreste, die eine elektrostatische Wechselwirkung mit dem Phosphatrückgrat der DNA-Doppelhelix eingehen (Pruss et al., 1995; Luger et al., 1997)
Die N- und C-terminalen flexiblen Arme der Histone sind an der Ausbildung von höheren Chromatinstrukturen durch Wechselwirkungen mit benachbarten Nukleosomen beteiligt (Luger et al., 1997). Darüber hinaus sind sie Angriffspunkte für posttranslationale Modifikationen, die eine wichtige Rolle bei der Genregulation spielen.
Abbildung 1-5 Die „Core“-Histone
Schematische Darstellung der „Core“-Histone und des „Linker“-Histons H1. Alle Histone bestehen aus einer zentralen, globulären Domäne und flexiblen Armen mit einem hohen Anteil der basischen Aminosäuren Arginin (R) und Lysin (K). N, aminoterminales Ende. (aus Knippers 2001).
1.3 Modifikation der Chromatinstruktur
Chromatin ist eine hochdynamische Struktur, die durch mannigfaltige Modifikationen auf veränderte Anforderungen in der Zelle reagieren muss. Die Chromatinstruktur spielt bei allen DNA-abhängigen Prozessen wie Replikation,
Transkription, Rekombination und Reparatur eine Rolle und greift regulierend in diese Prozesse ein. Neben den regulatorischen DNA-Sequenzen spielt die Veränderung der Chromatinstruktur eine immer bedeutendere Rolle.
Mechanismen wie posttranslationale Modifikation der Histone oder Austausch der „Core“-Histone durch spezialisierte, funktionsspezifische Varianten, Chromatinremodeling, und Chromatinsilencing ermöglichen durch strukturelle und funktionelle Veränderungen eine gerichtete Antwort auf veränderte Situationen in der Zelle.
1.3.1 Posttranslationale Modifikation der Histone
Zu posttranslationalen Veränderungen der Histonarme gehören Phosphorylierung (Serin/Threonin), Acetylierung (Lysine), Ubiquitinierung (Lysin), Sumoilierung (Lysin), ADP-Ribosylierung (Glutaminsäure) und die Methylierung (Lysine, Arginin).
Die bisher am besten untersuchte Modifikation ist die reversible Acetylierung/Deacetylierung von bis zu 4 ε-Aminogruppen an Lysinresten der N-terminalen Domänen von H3 und H4 (Grunstein, 1997). Jede eingeführte Acetylgruppe neutralisiert eine positive Ladung und schwächt somit die Bindung des Histons an das negativ geladene DNA-Rückgrat ab. Dies führt zu partiellen Auflockerungen im Nukleosom, die eine erleichterte Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren an diesen Bereich ermöglichen. Tatsächlich sind die Histone in transkriptionsaktiven Chromatinbereichen hyperacetyliert, wohingegen die Histone in inaktiven Bereichen hypoacetyliert sind (Grunstein, 1997). Die reversible Acetylierung/Deacetylierung wird durch die Enzym- Familien der Histon-Acetyltransferesen (HATs) und durch die Histon- Deacetylasen (HDACs) vermittelt (Marmorstein, 2001; Marmorstein and Roth, 2001). Die Acetylierung der „Core“-Histone beeinflusst auch die Wechselwirkung des Histons H1 mit dem Chromatin. In hyperacetylierten Bereichen des Genoms ist die H1 Menge deutlich erniedrigt (Ridsdale et al., 1990).
Neben der Acetylierung werden die Histone auch an Serinen und Threoninen phosphoryliert (Abbildung 1-6), was funktionelle Konsequenzen in der Mitose, in der Chromosomenkondensation und auf die transkriptionelle Aktivität hat.
Beispielsweise wird Histon H1 zellzyklusabhängig phosphoryliert, wobei das Maximum in der Mitose erreicht wird (Roth and Allis, 1992);(Bradbury et al., 1974). Die Phosphorylierung scheint auch eine Rolle bei der Regulation anderer Histon-Modifikationen zu haben. So ist z.B. die Phosphorylierung von S10 des Histons H3 eine Voraussetzung für die Acetylierung von K14.
Die Methylierung von Histonen wird von Histon-Methyl-Transferasen (HMTasen) durchgeführt. Histon H3 kann an fünf Lysinen (K4, K9, K27, K36, K79) methyliert werden, wobei bisher nur eine Stelle bei H4 (K20) bekannt ist.
Methylierte Histone werden sowohl in aktiv transkribierten Genen, wie auch in stillen Regionen gefunden. Zum einen wurde die H3-K4-Methylierung in aktiven Genen, die H3-K9-Methylierung hingegen in inaktiven Genen beobachtet (Übersicht in (Kouzarides, 2002), wobei der Methylierungsstatus eine weitere wichtige Rolle spielt. So konnte gezeigt werden, dass trimethyliertes K4 in H3, in aktiven Genen und dimethyliertes K4 in aktiven und inaktiven Genen zu finden ist (Santos-Rosa et al., 2002). Die Methylierung von Argininen in H3 und H4 ist mit transkriptionsaktiven Bereichen assoziiert und erleichtert die weitere Acetylierung (Zhang and Reinberg, 2001).
Ubiquitinierung von Histonen hat einen positiven Effekt auf die Transkription, wohingegen Sumoilierung von H4 eine Rolle bei der transkriptionellen Repression spielt (Shiio and Eisenman, 2003; Zhang, 2003).
Abbildung 1-6 Modifikationen von Histon H3 und H4
Darstellung der posttranslationalen Modifikation von H3 und H4. Dargestellt ist die Aminosäuresequenz der N-terminalen Arme. Acetylierung ist als grünes, Phosphorylierung als weißes und Methylierung als gelbes Symbol dargestellt. (Aus (Strahl and Allis, 2000)
Die Histon-Modifikationen verändern also die Wechselwirkung von Histonen und DNA auf elektrostatischer Ebene, wie beispielsweise für die Acetylierung und Phosphorylierung gezeigt werden konnte. Andererseits ist dies nicht zu verallgemeinern, da dieselbe Modifikation (z.B. Methylierung) zum einen mit aktiven und zum anderen mit inaktiven Genen in Zusammenhang gebracht werden konnte. Dies führte zur sogenannten „Histon-Code-Hypothese“, die besagt, dass sich die Histonmodifikationen nicht ausschließlich auf die Chromatinstruktur auswirken. Vielmehr werden durch die Modifikationen Regulatoren rekrutiert, die ihrerseits die Chromatinstruktur weiter verändern.
(Strahl and Allis, 2000; Jenuwein and Allis, 2001). In Abbildung 1.7 sind die bisher bekannten kombinatorischen Modifikation dargestellt und, wenn bekannt, die Proteine/Proteinkomplexe die diese Modifikation spezifisch erkennen, und die dadurch implizierte Funktion (Abbildung 1.7, weitere Übersicht in (Khorasanizadeh, 2004).
Abbildung 1-7 Die „histone-code“-Hypothese
Dargestellt sind verschiedene gefundene posttranslationale Modifikationen, ihre Funktion und die Rekrutierung von Protein-Komplexen. CENP-A ist eine Zentromer-spezifische H3 Form.(Wolffe, 1995) (aus (Strahl and Allis, 2000)
Gesamtheitlich werden alle kombinatorischen Modifikationen der Histone und die dadurch implizierte Funktion als Epigenetik bezeichnet. Hier fließt auch die DNA-Methylierung an CpG-Inseln ein. Methylierung an Histonen und DNA führt auch zu dem sogenannten „genomic-imprinting“, Modifikationsarten, die von Generation zu Generation weitervererbt werden (Bird et al., 1998) (Lachner and Jenuwein, 2002); (Lachner et al., 2003).
1.3.2 Nicht-Histon-Proteine: HMG Proteine
Einen weiteren Einfluß auf die Chromatinstruktur stellt die Einlagerung von Nicht-Histon-Proteinen dar.
Zur Gruppe der Nicht-Histon-Proteine zählen alle Proteine, die an Chromatin binden, aber nicht zur Klasse der Histone gehören, wie z.B Transkriptionsfaktoren, Polymerasen und Topoisomerasen, deren Mengen vom Zelltyp abhängig sind.
Eine Gruppe der Nicht-Histon-Proteine, die in verschiedenen Zelltypen ubiquitär und in konstanten Menge zu finden sind, sind die klassischen High-Mobility- Group-(HMG)-Proteine. Sie erhielten ihren Namen durch ihre hohe gelelektrophoretische Mobilität (10-30 kDa). Die Einteilung erfolgt aufgrund ihrer DNA-Bindemotive (Bustin, 2001).
Die Gruppe der klassischen HMG-Proteine setzen sich aus den HMGBs (alter Name:HMG-1/-2), den HMGAs (alter Name: HMG-I/-Y) und HMGNs (alter Name: HMG-14/-17) zusammen (siehe Abbildung 1-8).
Abbildung 1-8 Die HMG-Proteine
Die Familie der klassischen HMG-Proteine und die HMG-Motiv-Proteine mit neuer und alter Nomenklatur.
Das funktionelle Motiv, das die Klassenzugehörigkeit bestimmt, ist angegeben.
1.3.2.1 HMGB (HMG-1/-2)
Die HMG-1-Domäne (HMG-Box) ist das funktionelle Motiv der größten Unterfamilie der HMG-Proteine. HMGB-Proteine weisen zwei unabhängige HMG-1-Domänen (HMG1 A und B Box) auf, die für die sequenzunspezifische DNA-Bindung verantwortlich sind. Eine saure Domäne im C-terminalen Bereich vermittelt Proteininteraktionen und modelliert die DNA-Bindung. Die HMG-1- Domäne besteht aus etwa 80 Aminosäuren, die eine gedrehte L-förmige, homolog gefaltete Domäne aus drei α-Helices bildet. Die Konservierung der HMG-1-Domänen beruht eher auf dieser Struktur als auf der Aminosäuresequenz. Die DNA-Bindung erfolgt ausschließlich an der kleinen Rinne der DNA durch interkalierende, hydrophobe Aminosäuren. Dies führt zu einer teilweisen Entwindung der DNA und dadurch zu einer Erweiterung der kleinen Rinne. Die HMGB-Proteine binden mit einer geringen Spezifität an B-
Form DNA, haben allerdings eine hohe Affinität für ungewöhnliche DNA- Formen, wie kreuzförmige, gebogene und supergecoilte DNA. Die Bindung an relaxierte Plasmid-DNA führt in vitro zu einer Einführung von Supercoils.
HMGB-Proteine können durch Transkriptionsfaktoren rekrutiert werden, führen in diesen Bereichen zu DNA-Strukturveränderungen, die eine Transkriptionserleichterung darstellen, und verlassen dann diese Stelle wieder.
Deshalb werden die HMGB-Proteine als „Architektur-Transkriptionsfaktoren“
oder „Chromatin-Chaperone“ bezeichnet. Durch ihre hohe Mobilität im Zellkern werden sie auch „an architekt for hire“ bezeichnet. Interaktionen, sowohl mit Proteinen als auch mit DNA, sind immer transient und von sehr kurzer Dauer.
HMGB spielen so wie die HMGAs eine Rolle in der „Enhancosome“ Ausbildung, jedoch sind bis jetzt nur einige „B-Enhancosomen“ bekannt, was durch die transiente Bindung erklärt werden könnte. (entnommen aus (Agresti and Bianchi, 2003).
Für die V(D)J-Rekombination konnte in vivo gezeigt werden, dass die HMG- vermittelte DNA-Biegung eine Erleichterung darstellt (Aidinis et al., 1999). In vitro konnte für HMGB1 nachgewiesen werden, dass durch die DNA-biegende Eigenschaft das „Nukleosomen-Sliding“ durch ACF/CHRAC erleichtert wird (Bonaldi et al., 2002).
1.3.2.2 HMGA (HMGY/I)
Die humanen HMGA-Proteine bestehen aus vier Mitgliedern, HMGA1a, HMGA1b HMGA1c und HMGA2, und zeichnen sich durch die Anwesenheit von drei identischen, jedoch unabhängigen DNA-bindenden AT-Hooks und einem sauren C-terminalen Bereich aus. Das positiv geladene AT-Hook-Motiv besteht aus neun Aminosäuren, wobei die Aminosäuren Prolin-Arginin-Glycin-Arginin- Prolin die Kernsequenz bilden, die von einer bestimmten Anzahl an Lysinen und Argininen umringt wird, was wiederum einen Einfluss auf die Bindung ausübt (Reeves and Nissen, 1990; Aravind and Landsman, 1998). Die Kernsequenz ist in allen AT-Hook-Proteinen evolutionär hoch konserviert. Eine Bindung mit dem AT-Hook erfolgt an der kleinen Rinne der DNA und führt zu Strukturveränderungen des gebundenen Bereiches. Die bevorzugte Bindung erfolgt an AT-reiche DNA-Sequenzen (AA(T/A)T). Wie die HMGBs auch, binden die HMGAs bevorzugt an ungewöhnliche DNA-Formen, wie kruziform, supergecoilte, gebogene und nukleosomale DNA-Formen. Durch eine Bindung von HMGA-Proteinen werden die DNA-Bereiche je nach Ausgangssituation gebogen, begradigt, aufgewunden oder Schleifen ausgebildet. In vitro können HMGAs, wie die HMGBs, auch Supercoils in relaxierte Plasmid-DNA einführen.
Strukturveränderungen durch HMGAs sind ATP-unabhängig und erfolgen im Gegensatz zu den HMGBs nicht durch Interkalation. Es wird vermutet, dass die Veränderung durch das gleichzeitige Binden der drei AT-Hooks hervorgerufen wird. HMGA-Proteine sind an der Formierung von sogenannten
„Enhancosomen“ beteiligt und spielen damit eine wichtige Rolle bei der Expression von Genen. Sie können verschiedene Funktionen in diesen Enhancosomen ausüben, die teilweise durch Protein-Protein-Interaktion, aber hauptsächlich durch HMGA-DNA Interaktion, die zu einer DNA-Biegung führt, vermittelt werden. Das am besten untersuchte Beispiel ist der IFN- (Interferon)β-Promotor, wobei viele weitere Enhancosomen bekannt sind (Übersicht in (Reeves and Beckerbauer, 2001).
Durch die Beteiligung der HMGA-Proteine an der Transkriptionskontrolle, der Chromatinarchitektur, der DNA-Strukturveränderung und vielen anderen Prozessen, sind die HMGA-Proteine hoch-multifunktionelle Proteine in der Zelle.
1.3.2.3 HMGN (HMG14 / -17)
Die dritte HMG-Familie sind die HMGNs. Sie binden über die „Nukleosomen- Bindungsdomäne“ (NBD) an Chromatin. Die NBD erstreckt sich über etwa 30 Aminosäuren und ist zweigeteilt. Der N-terminale Bereich ist hoch konserviert und an Argininen angereichert, wobei der C-terminale Teil reich an Prolinen und Lysinen ist. Mit dieser Domäne erkennen die HMGN-Proteine die Struktur des Nukleosomenkerns (146 bp). Die HMGN-Familie besteht aus HMGN1 und HMGN2. Beide stimulieren die Transkription und die Replikation von Chromatin, doch nicht von proteinfreier DNA. Dies wird durch eine Dekompaktierung der Chromatinstruktur erreicht, wobei der Mechanismus noch nicht genau verstanden ist. Es konnte gezeigt werden, dass der C-terminale, saure Bereich von HMGN mit den N-terminalen Armen von H3 interagieren kann und dass diese Interaktion essenziell ist, da an trypsiniertes H3 die Bindung von HMGN sehr schwach ist. Interessant ist auch, dass die HMGN-Proteine offensichtlich wie H1 an die Ein- und Austrittstelle der DNA im Nukleosom binden und dadurch mit H1 um die Bindestelle konkurrieren. Eine Stimulation von Transkription und Rekombination könnte dann damit erklärt werden, dass HMGN H1, das inhibitorisch wirkt, vom Nukleosom verdrängt und die Wechselwirkung zwischen Histonoktamer und DNA auflockert. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass HMGN-Proteine in aktiv proliferierenden Zellen durch den ganzen Zellkern in vielen Foci lokalisiert sind, sich aber in transkriptionsinaktiven Zellen in dem interchromosomalen Bereich befinden (Bustin, 1999).
Neben den klassischen HMGs gibt es die sogenannten HMG-Motiv-Proteine die eine strukturelle Eigenschaft, wie HMG-Box, Nukleosomen-Bindemotiv oder AT- Hook aufweisen (siehe Abbildung 1-8). Bei den HMG-Motiv Proteinen handelt es sich um verschiedenste Proteine, die neben einem oder mehreren HMG- Motiven auch andere Motive besitzen. Diese Proteine kommen teilweise Zelltyp-spezifisch vor und sind nicht so verbreitet wie die klasischen HMG-
Proteine. Meist binden sie sequenzspezifisch an DNA oder dienen der Expression einer definierten Subklasse von Genen.
1.3.3 Chromatinremodeling
Der Mechanismus des Chromatinremodelings stellt eine dritte Möglichkeit dar, die Chromatinstruktur zu verändern. Bei diesem Mechanismus wird die
Chromatinstruktur ATP-abhängig von sogenannten Chromatinremodelingkomplexen verändert. Dabei handelt es sich um
Multiproteinkomplexe (0,5 – 2 MDa), deren gemeinsames Merkmal eine ATPase-Untereinheit ist. Nach diesen ATPasen werden die Chromatinremodelingkomplexe in vier Familien unterteilt: Swi2, ISWI, MI-2 (CHD) und INO80 Familie (Shen et al., 2000; Varga-Weisz, 2001). Die ATPasen besitzen neben der ATP-Domäne noch weitere funktionelle Domänen.
So besitzt die Swi2-ATPase eine zusätzliche Bromodomäne, die acetylierte Histone erkennt. Die Mi-2-ATPasen dagegen haben eine Chromodomäne, die an methylierte Histone bindet (Berger, 2002);(Varga-Weisz, 2001).
Neben der ATPase-Untereinheit, setzen sich die verschiedenen Remodelingkomplexe aus unterschiedlichen akzessorischen Untereinheiten zusammen. ACF, der kleinste Komplex, besitzt neben der ATPase ISWI nur noch eine Untereinheit, Acf1. SWI/SNF hat mehrere zusätzliche Untereinheiten.
Es wird vermutet, dass die unterschiedliche Zusammensetzung der Remodelingkomplexe deren Funktion und deren Aktionsort beeinflusst.
Die Mechanismen der Remodelingkomplexe sind in vitro gut charaktersiert. So sind sie in der Lage, Histon-Oktamere auf kurzen DNA-Fragmenten zu verschieben. So könnten Regulatorelemente auf der DNA nukleosomenfrei gemacht werden. Von den ISWI-Komplexen ist bekannt, dass sie für eine regelmäßige Anordnung von Nukleosomen auf längeren DNA-Fragmenten verantwortlich sind („Nukloesomen-Spacing“). Dies kommt wahrscheinlich auch durch die oben beschriebene „Sliding“-Aktivität zustande (Vignali et al., 2000).
Im Gegensatz zu den in vitro Daten ist über die in vivo Funktion nur wenig bekannt. Für ACF konnte eine Beteiligung bei der Replikation in heterochromatischen Bereichen in der späten S-Phase gezeigt werden (Collins et al., 2002).
Chromatinremodelingkomlexe sind aber nicht nur in die Genaktivierung, sondern auch in dem Verschließen oder „Silencen“ von Chromatin beteiligt. Hier wäre z.B der NURD-Komplex zu nennen. Neben der MI-2 ATPAse und anderen Untereinheiten, hat dieser Komplex eine HDAC-Untereinheit, die Histone deacetylieren kann und dadurch zu einer unzugänglicheren Chromatinstruktur führt (Xue et al., 1998). In Microarray-Studien wurde gezeigt, dass etwa 5 % der Gene in Hefe durch die ATPase-Aktivität des SWI/SNF-Komplexes stimuliert, aber auch reprimiert werden können (Sudarsanam and Winston, 2000).
Aus diesen wenigen genannten Beispielen wird deutlich, dass die Regulation der Genexpression auf epigenetischer Ebene weit komplexer ist als bisher vermutet wurde.
1.4 Das DEK-Protein
1.4.1 Entdeckung
Das DEK-CAN Onkogen wurde 1992 bei Patienten mit einer Subform der akuten myeloiden Leukämie entdeckt (AML). Dieses Fusionsprodukt entsteht durch eine Chromosomentranslokation des 3`-Bereiches des CAN-Gens auf Chromosom 9, auf den 5`-Bereich des DEK-Gens auf Chromosom 6, die sich im Leseraster befindet. Durch diese Translokation t(6;9)(p23;q34) entsteht ein Fusionsprotein aus 350 Aminosäuren (1-350) von DEK und 1278 Aminosäuren des C-Terminus von CAN, das ein Molekulargewicht von 165 kDa hat (von Lindern et al., 1990), (von Lindern et al., 1992). Bei CAN (Nup214) handelt es sich um eine Komponente des Kernporenkomplexes, daher ist es strikt in der Kernmembran lokalisiert, wohingegen das Fusionprotein DEK-CAN im Zellkern zu finden ist (Fornerod et al., 1995), (Hamaguchi et al., 1998) (Boer et al., 1998). Bei den AML-Patienten mit der DEK-CAN-Fusion bleibt je ein Allel unbeeinflusst und es werden höhere Mengen an DEK-Transkript im Vergleich zu dem DEK-CAN-Transkript beobachtet. Die Präsenz des Fusionsproteins DEK-CAN ist oft die einzige karyotypische Abnormalität bei diesen Patienten, deshalb wurde hier die transformierende Aktivität vermutet und DEK selbst als Protoonkogen eingestuft. Weitere Studien zeigten jedoch, dass die Translokation t(6;9) in AML sehr selten vorkommt. Thiede et al. konnten unter 979 AML-Patienten nur zehn mit dieser Translokation finden. Jedoch wiesen 90% der DEK-CAN-Patienten eine Mutation in der FLT3-Kinase (FMS-Tyrosin- Kinase) auf, wohingegen dies in nur 20 % der anderen untersuchten AML- Patienten zu finden war (Thiede et al., 2002). Die Mutation führt zu einer konstitutiv erhöhten Kinaseaktivität. Die FLT3-Kinase ist in der cytoplasmatischen Membran lokalisiert und dient als Rezeptor für verschiedene Wachstumssignale. Sie ist daher in verschiedene Signaltransduktionswege involviert und scheint bei der Aufrechterhaltung der Proliferation und bei der Entgegenwirkung der Differenzierung in diesen leukämischen Zellen eine wichtige Rolle zu spielen (Libura et al., 2003). Eine Überexpresion von DEK- CAN in U937 myeloiden Vorläuferzellen konnte die Ausdifferenzierung dieser Zellen nicht verhindern (Boer et al., 1998). Die Expression von DEK-CAN in transgenen Mäusen führte nicht zur Ausbildung einer Leukämie (Grosveld, 2002). Daher scheint eher die Mutation in der FLT3-Kinase und nicht die Präsenz von DEK-CAN zu einer Transformation zu führen, wobei man nicht ausschließen kann, dass DEK-CAN in bestimmten Transformationsstadien eine Rolle spielt. Es bleibt daher fraglich, ob DEK wirklich ein Protoonkogen ist.
1.4.2 Eigenschaften
DEK ist ein sehr häufiges Kernprotein (2-4 106 Kopien/Zelle), das in allen höheren Eukaryoten gefunden wird (Pflanzen, Pilze, Tiere), aber nicht in Hefe vorkommt. Die DEK-Proteine unterschiedlicher Spezies weisen homologe Bereiche auf, die in den unterschiedlichen Spezies in der Länge variieren (Abbildung 1-9). Humanes DEK hat ein Molekulargewicht von 43 kDa und enthält 375 Aminosäuren. Dahingegen ist DEK aus D. melanogaster 612 Aminosäuren lang, aus X.laevis nur 300 Aminosäuren lang. DEK-Proteine der verschiedenen Organismen weisen alle eine SAF- oder SAP-Box auf (Aravind and Koonin, 2000; Kipp et al., 2000). Diese konservierte, 35 Aminosäuren lange DNA-Bindedomäne erstreckt sich bei menschlichem DEK von Aminosäure 149 bis 187 (Abbildung 1-9). Des Weiteren findet man eine Kernlokalisationssequenz (205-221) und vier saure Bereiche, die sich jeweils von Aminosäure 30-49, 228-236, 241-254 und 300-310 erstrecken.
Durch Yeast-Two-Hybrid-Analysen und Far-Western-Studien konnte eine Multimerisierungsdomäne, die sich von Aminosäure 270-350 erstreckt, identifiziert werden (Kappes et al., 2004; Scholten, 2004).
Abbildung 1-9 Domänen des humanen DEK-Proteins
Das menschliche DEK-Gen ist auf Chromosom 6 (6;p23) lokalisiert und enthält 11 Exons. Der DEK-Promotor weist die Eigenschaften eines Haushaltsgens auf (CCAATT-Box, unmethylierte CpG-Inseln, keine TATA-Box) und wird potenziell über die Faktoren NF-Y und YY1 reguliert (Sitwala et al., 2002). Die DEK- Expression ist in allen untersuchten Geweben sehr stark und in vielen Krebsarten wird DEK überexprimiert, wohingegen die DEK-Expression in ausdifferenzierten Zellen eher schwach ist (Boer et al., 1998; Kondoh et al., 1999; Kroes et al., 2000; Makita et al., 2002; Savli et al., 2002; Sanchez- Carbayo et al., 2003; Daibata et al., 2004; Evans et al., 2004). Bisher sind keine
Spleissvarianten und regulatorische Elemente, die die Stabilität oder die Translationseffizienz der DEK-mRNA beeinflussen könnten, bekannt.
DEK wurde in vielen humanen Autoimmunkrankheiten als Antigen gefunden. In einer Untersuchung von Dong et al. (2000) wurden DEK-Antikörper in juveniler rheumatoider Arthritis (JRA, 40 % der Patienten), im systemischen Lupus erythematodes (SLE, 25% der Patienten), in der Sytemsklerose und in weiteren Autoimmunkrankeiten gefunden. Die Produktion von DEK-Antikörpern scheint auf eine erhöhte Anwesenheit von IFNγ (Interferon) zurückzuführen zu sein (Dong et al., 2000).
1.4.3 Subzelluläre Lokalisation und Zellzyklusverhalten
DEK ist ausschließlich im Nukleus lokalisiert. Durch Zellfraktionierungsstudien konnte gezeigt werden, dass sich die Hauptfraktion von DEK mit 250 mM NaCl aus isolierten Kernen extrahieren lässt. DEK weist damit ein Verhalten auf, wie es für andere Chromatinproteine beschrieben ist (z.B (Ritzi et al., 1998).
Sedimentationsanalysen von freigesetzten Chromatinfragmenten zeigten tatsächlich, dass DEK in vivo Zellzyklus-unabhängig mit Chromatin assoziiert ist (Kappes et al., 2001). DEK ist sowohl mit Metaphase-Chromosomen und mit mitotischem Chromatin assoziiert (Fornerod et al., 1995; Kappes et al., 2001;
Krithivas et al., 2002; Scholten, 2004). Die DEK-Protein-Menge ändert sich im Zellzyklus nicht. Eine Assoziation mit hetero- und euchromatischen Bereichen konnte gezeigt werden, jedoch wurde eine fünffache Anreicherung in Euchromatin gefunden (Kappes et al., 2001). Mit zwei verschiedenen Methoden der Kernmatrix-Präparation konnte eine Assoziation von DEK mit dieser Struktur nachgewiesen werden (Kappes, 2000).
DEK ist, wie viele andere Chromatin-assozierte Kernproteine, hoch mobil, unterliegt folglich einer schnellen Dissoziation und Wiederbindung an Chromatin. Dies wurde durch FRAP-(flueorescence recovery after photobleaching) Analysen von transient exprimierten GFP-(green fluorescent protein) DEK gezeigt (Scholten, 2004). Es wurden aber auch DEK-Populationen gefunden, die über Minuten hinweg einen stabilen Komplex ausbilden.
Eine kleinere Population von DEK ist in vivo mit RNA assoziiert (Kappes et al., 2001).
Einige Gruppen konnten eine Interaktion von DEK mit dem EJC-(exon-exon- junction) Komplex nachweisen (Le Hir et al., 2000; Le Hir et al., 2001) (McGarvey et al., 2000). Es stellte sich allerdings heraus, dass die gefundene Interaktion auf einer Kreuzreaktion des verwendeten Antikörpers beruhte (Reichert et al., 2002). Weitere Studien in unserem Labor bestätigten die Kreuzreaktion (Scholten, 2004).
1.4.4 Topologieveränderung und DNA-Bindung
Alexiadis et al. (2000) zeigten, dass natives, über konventionelle Säulenchromatographie gereinigtes DEK in Anwesenheit von Topoisomerase I die superhelikale Dichte von SV40-Minichromosomen verändert. Diese Topologieveränderung wurde zuerst nur an Chromatin-Substraten beobachtet (Alexiadis et al., 2000). In weiteren Arbeiten von Waldmann et al. konnte diese Topologieveränderung auch an proteinfreier DNA beobachtet werden (Waldmann et al., 2002; Waldmann et al., 2003). Es konnte gezeigt werden, dass DEK fixierte, positive Supercoils in proteinfreie DNA einführt und zu einer Reduktion von negativen Supercoils in SV40 Minichromosomen führt. Der Mechanismus der Topologieveränderung ist bisher noch nicht genau verstanden, ein Nukleosomenverlust konnte jedoch ausgeschlossen werden (Alexiadis et al., 2000). In elektronenmikroskopischen Studien konnte auch ein
„Wrapping-Machanismus“ ausgeschlossen werden, wie für die Histone gezeigt.
Jedoch wurde eine leichte Längenzunahme beobachtet. Durch die Präsenz von interkalierenden Aminosäuren (Phenylalanine) inmitten der potenziellen DNA- Bindedomäne SAF-Box, kann die Interkalation von DEK nicht ausgeschossen werden.
Alle bisher beschriebenen Arbeiten identifizierten DEK als sequenzunspezifisches DNA-Bindeprotein. Die Gruppe von Markovitz allerdings beschrieben eine Sequenzspezifität von DEK für eine Sequenz aus dem HIV-2 Promotor (pets-site) und für eine Sequenz aus MHC-II Genen (Fu et al., 1997;
Faulkner et al., 2001; Adams et al., 2003). In identischen Experimenten von Waldmann et al. konnte diese sequenzspezifische Bindung von DEK an die pets-site nicht gezeigt werden (Waldmann et al., 2003). Vielmehr wurde gefunden, dass DEK strukturspezifisch an supergecoilte und kruziforme DNA bindet (Waldmann et al., 2003). Diese Eigenschaft verbindet DEK mit Architekturproteinen.
Die Bindung von DEK an Chromatinsubstrate in vitro führt zu einer drastischen Kompaktierung und dadurch zu einer verminderten Zugänglichkeit für Restriktionsenzyme, Mikrokokken-Nuklease und Replikationsproteine (Alexiadis et al., 2000), (Waldmann et al., 2003). Alexiadis et al. wiesen eine Assoziation von DEK mit SV40 Chromatin in vitro nach und konnten in Far-Western-Studien zeigen, dass DEK mit den Histonen H2A und H2B in vitro interagiert (Alexiadis et al., 2000). Allerdings konnte in weiteren Experimenten keine Interaktion von DEK mit rekombinanten Histonen gezeigt werden (Scholten, 2004).
Wird DEK zusammen mit proteinfreier DNA inkubiert und im Elektronenmikroskop analysiert, findet man zum einen intermolekulare Wechselwirkungen zwischen DEK und DNA, die zu Schleifenbildungen führen und zum anderen kann man erkennen, dass DEK in einer geordneten Art und
Weise an DNA-Substrate bindet (Waldmann et al., 2002; Waldmann et al., 2003).
1.4.5 Interaktion mit anderen Proteinen
In den letzten Jahren wurden drei Interaktionspartner von DEK identifiziert. Zwei davon, hDaxx und AP-2α sind Komponenten der Transkriptionskontrolle. Der dritte Partner ist LANA, ein virales Protein, das die Bindung des Kaposi- Sarkoma assoziierten Herpesvirus an zelluläres Chromatin vermittelt.
1.4.5.1 Interaktion AP-2α, einem Transkriptionsaktivator
Campillos et al. (2003) identifizierten DEK in Affinitätsreinigungen als Interaktionspartner von AP-2α. AP-2α ist ein Mitglied der AP-2 Transkritionsfaktoren-Familie, die eine Funktion bei der Embryogenese, Apoptose und Differenzierung haben. In EMSAs wurde DEK als stimulierender Faktor für die AP-2α-Bindung gefunden. Jedoch wurde hier GST-DEK eingesetzt, dem N-terminal 80 Aminosäuren fehlen, und GST alleine konnte schon die AP-2α-Bindung deutlich stimulieren. In Ko-Transfektionsassys in Leberzellen konnten die Transkription eines AP-2α-abhängigen Promotors (APOE) durch die Überexpression von DEK stimuliert werden. Die Autoren folgern daraus, dass DEK über eine transiente Komplexbildung mit C- terminalen Bereichen des AP-2α-Proteins dessen Affinität für DNA steigert. Der C-terminale Bereich ist in der AP-2-Familie konserviert, deshalb wird auf eine generelle Interaktion von DEK mit allen Mitgliedern dieser Familie spekuliert.
Auffälligerweise konnte DEK alleine nicht an die verwendete DNA, die Sequenzähnlichkeiten zum pets-Fragment hat, binden (Campillos et al., 2003).
Diese Interaktion von DEK mit AP-2α könnte in der DEK-CAN Fusion gestört sein und dadurch zu einer Transformation führen (Campillos et al., 2003).
1.4.5.2 Interaktion mit Daxx, einem Transkriptionsrepressor
Im Gegensatz zu Campillos et al., die für DEK eine Rolle in der Transkriptionsaktivierung postulieren, finden Hollenbach et al. eine potenzielle transkriptionsreprimierende Funktion für DEK (Hollenbach et al., 2002). Daxx ist ein ubiquitär exprimiertes Protein, das die Transkription in verschiedenen Zelltypen reprimiert (Hollenbach et al., 1999). Durch konventionelle säulenchromatographische Auftrennung von Flag-DEK überexprimierenden Zellen konnte in einigen Fraktionen gemeinsam hDaxx, HDAC II, acetyliertes H4, die „Core“ Histone und Flag-DEK gefunden werden. Die Autoren leiteten daraus ein Modell ab, bei dem DEK eine Rolle in der Rekrutierung von hDaxx an das Chromatin hat. In diesem Modell wird phosphoryliertes hDaxx über die Transkriptionsfaktoren Pax3 und ETS-1 an aktiv transkribiertes Chromatin rekrutiert. Die Assoziation von Daxx an Chromatin wird dann über die „Core“- Histone und chromatingebundenes DEK vermittelt, woraufhin die HDAC II
rekrutiert werden kann und die Deacetylierung von Histonen vermittelt. Es kommt dadurch zu einer Kompaktierung dieser Chromatinbereiche, die in einer Transkriptionsrepression endet. DEK ist hier eine Komponente eines Multiproteinkomplexes und vermittelt als chromatingebundenes Protein weitere Proteininteraktionen (Hollenbach et al., 2002).
1.4.5.3 Interaktion mit LANA
LANA (latency associated nuclear antigen) ist ein konstitutiv exprimiertes Protein in Kaposis Sorkoma-assozierten Herpesinfektionen (KSHV) und ist für die Verteilung der episomalen viralen DNA auf die Tochterzellen notwendig.
LANA bindet dabei an terminale Repeats (TR) des KSHV-Genoms und assoziiert die viralen Episomen mit zellulärem Chromatin und Chromosomen.
Krithivas at al. konnten zeigen das LANA über MeCP2 (methyl CpG binding protein 2) und DEK an das zelluläre Chromatin gebunden wird. LANA assoziiert hierbei über eine N-terminale Interaktion mit MeCP2, das an methylierte
„Linker“ DNA bindet, und über eine C-terminale Interaktion mit DEK an das Chromatin. DEK dient hier als Plattform für weitere Proteininteraktionen (Krithivas et al., 2002). Interessanterweise gab es Studien, in denen H1 als potenzielle Plattform für die LANA Bindung dienen sollte.
2 Zielsetzung
DEK ist ein sehr häufiges und ubiquitär vorkommendes Chromatin-assoziiertes Protein (Kappes et al., 2001) und wird unter anderem in Zusammenhang mit Transkriptionskontrolle gebracht (Hollenbach et al., 2002; Campillos et al., 2003).
Durch die Entdeckung von DEK als Fusionsprotein mit dem Nukleoporin CAN in einer Subform der akuten myeloiden Leukämie (von Lindern et al., 1990; von Lindern et al., 1992) und durch die Überexpression von DEK in verschiedenen Krebsarten wird es als Protoonkogen bezeichnet. Bis heute wurde kein eindeutiger Zusammenhang zwischen DEK-Expression und Onkogenese festgestellt, jedoch scheint die DEK-Expression im Zusammenhang mit dem Proliferations– und Differenzierungsstatus einer Zelle zu stehen.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Biochemie des DEK-Proteins besser zu verstehen. Dazu wurden drei verschiedene Untersuchungsstrategien gewählt.
Aufbauend auf Kappes et al. (2001) sollten weitere Zellzykluseigenschaften von DEK in vivo untersucht werden, die einen Beitrag zum Verständnis der Expressionskontrolle von DEK liefern sollten.
Eine weitere beschriebene Eigenschaft von DEK ist die Einführung von Supercoils in DNA- und Chromatinsubstrate in vitro und die sequenzunspezifische Bindung an DNA (Alexiadis et al., 2000; Waldmann et al., 2002). Hier sollten durch die Herstellung von DEK-Deletionsmutanten die verantwortlichen Bereiche für diese Aktivitäten identifiziert werden.
Im dritten Teil dieser Arbeit sollte die Phosphorylierung, die einzige bisher bekannte posttranslationale Modifikation von DEK (Fornerod et al., 1995), die bisher jedoch noch nicht näher charakterisiert wurde, untersucht werden. Hierzu sollte die Phosphorylierung von DEK in vivo und die dafür verantwortliche(n) Kinase(n) identifiziert werden. Des Weiteren sollten die Auswirkungen der Phosphorylierung auf die DEK-Funktion untersucht werden.
3 Material und Methoden
3.1 Material
•Aldrich:
Phosphat-freies DMEM Methioninfreies DMEM Plasmid-Präparations-Kit
•Amersham Pharmacia Biotech:
Molekulargewichtsmarker für die SDS-PAGE (LMW-Marker) ECL Western-Blot-Detektions-System
ATP
•Beckmann:
Zentrifugenröhrchen aus Polyallomer für die Ultrazentrifugation (SW-40 Rotor)
Rotoren: SW-40, SS-34, GS-3, HB-4.
•Biolabs (NEB)
100x BSA
λ-Phosphatase
•Gibco:
Nährmedium für die Zellkultur (DMEM, Grace`s Insect Medium) Fötales Kälberserum (FCS)
HeLa S3 Zellen
•Greiner:
62-95-145 mm Plastikpetrischalen in Zellkultur-(TC)-Qualität Zellkulturflaschen für die Kultur von SF-9 und High-5 Zellen
•Invitrogen:
Bac-N-Blue-DNA
•Sarstedt:
13 ml Polypropylenröhrchen („Weisskappenröhrchen“)
Plastikküvetten (1ml)
•Schleicher & Schuell:
Nitrocellulose Membran (Protran®) und Blotfilter für Western Blot Nitrocellulose Filter für die Filterbindung
Sterilfilter
Dialyse Schwimmfilter
•MBI Fermantas :
Mikrokokken Nuklease (MNase)
•Promega:
PKC
Topoisomerase I (wheat germ)
•Roche:
DNase I (RNase frei)
RNase A
Complete (Proteasen Inhibitor Mix)
•Fluka:
Nonidet-P40 Lösung (10%)
•Roth:
Roti®-Block (Blocking Reagenz für den Western Blot) Polyacrylamid (Gel 30)
•TPP:
50 ml Polypropylenröhrchen („Gelbkappenrörchen“)
•Pierce:
SulfoLink Coupling Gel
BCA-Proteinbestimmungs Kit
•Millipore:
Dialysefilter
•ICN:
[γ-32P] ATP [α-32P] ATP
•Fuji Film:
Medizinische Röntgenfilme (Super RX) für den Western Blot
•Mitsubishi:
Thermopapier (K 65HM)HD Type) für die Fotographie von DNA Gelen
•Eppendorf:
Reaktionsgefäße Tischzentrifuge
Alle übrigen Chemikalien wurden von den Firmen Fluka, Riedel-deHäen, Serva, Sigma, Roth und Calbiochem bezogen. Sofern nicht ausdrücklich angegeben, hatten alle Chemikalien den Reinheitsgrad „pro analysi“ (pa).
3.2 Allgemeine Lösungen
Im Folgenden sind alle verwendeten Lösungen und Puffer aufgelistet, auf die nicht näher eingegangen wird. Spezielle Lösungen und Puffer werden bei den entsprechenden Methoden aufgeführt.
PBS:
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4
5 x TBE :
450 mM Tris-Base
445 mM Borsäure
10 mM EDTA, pH 8 4 x Probenpuffer für SDS-PAGE:
200 mM Tris-HCl, pH 6,8
8 % SDS
40 % Glycerin
0,4 % Bromphenolblau (oder Orange G für Agarosegele) 10 % β-Mercaptoethanol
5 x Laufpuffer für SDS-PAGE:
247 mM Tris-Base
1,9 M Glycin
0,5 % SDS (pH nicht einstellen) 2 x Sammelgelpuffer für SDS-PAGE:
0,25 M Tris-HCl, pH 6,8
0,2 % SDS
1 Spatelspitze Bromphenolblau 50 x TAE:
242 g Tris-Base
57,1 ml Essigsäure conc.
100 ml EDTA (0,5 M, pH 8) ad 1l mit bidest H2O
TBST:
150 mM NaCl
50 mM Tris-HCl, pH 7,8
0,05 % Tween 20
TE:
10 mM Tris-HCl, pH 8 1 mM EDTA
Coomassie –Färbung:
0,1 % Coomassie Brilliant Blue 40 % Methanol
10 % Essigsäure
Semi-Dry-Puffer für den Western-Transfer:
20 % Methanol
50 mM Tris
40 mM Glycin
1,5 mM SDS
6 x Probenpuffer für Agarosegele:
15 % Ficoll Type 400 60 mM EDTA
0,6 % SDS
0,25 % Orange G
LB-Medium:
10 g Trypton
5g Hefeextrakt
10 g NaCl
ad 1l mit H2O
3.3 Allgemeine Methoden
3.3.1 SDS-Polyacryalmid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Auftrennung der Proteine erfolgte aufgrund ihres Molekulargewichtes mittels Polyacrylamid-SDS-Gelelektrophorese nach Lämmli (Laemmli, 1970), modifiziert nach ((Thoma et al., 1979). Wenn nicht anders angegeben, wurden Gele mit 10 % Acrylamid/Bisacrylamid (30:0,8) und einer Dicke von 0,7 mm verwendet. Die Trennung wurde bei 20 mA gestartet und bei 40 mA durchgeführt. Die Gesamtlaufzeit betrug 80 min.
3.3.2 Coomassie Färbung und Silber Färbung von Polyacrylamid Gelen Der Nachweis der Proteinbanden in Polyacrylamidgelen erfolgte durch Anfärbung mit Coomassie Brilliantblau nach Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989b).
Die Silberfärbung von Proteingelen wurde nach Wray et al. (Wray et al., 1981) durchgeführt.
3.3.3 Western-Blot und Immunfärbung (Immunblot)
Für den immunologischen Proteinnachweis wurden zunächst die Proteinbanden aus dem Polyacrylamidgel auf eine Nitrocellulose Membran transferiert. Der Transfer wurde in einer Semi-Dry-Blot Apparatur der Firma Hoefer durchgeführt und erfolgte mit 0,8 mA/cm2 für eine Stunde bei einer Geldicke von 0,7 mm. Im Anschluss an den Transfer wurde die Membran kurz in Wasser gewaschen und mit Poinceau-S Lösung (0,2 % Poinceau-Red, 5 % Essigsäure) angefärbt, um die Position der Markerproteine und die Qualität das Transfers festzuhalten.
Nach dem Entfärben der Membran in TBST wurde sie für 1 h in 1 x Rotiblock
Lösung inkubiert, um Proteinbindestellen abzusättigen. Danach wurde die Membran mit TBST gewaschen und für 1 h mit dem primären Antikörper (verdünnt in TBST) inkubiert. Nach weiteren Waschschritten mit TBST (3 x 5 min) folgte eine einstündige Inkubation mit dem sekundären Antikörper (verdünnt in TBST, 0,5 % Magermilchpulver). Die Nachweisreaktion erfolgte nach erneutem Waschen in TBST (2x5 min; 1x 15 min) durch eine Chemolumineszenzreaktion nach Angaben des Herstellers (ECL, Amersham).
3.3.4 Proteinfällung nach Wessel und Flügge (1984)
Für die quantitative Fällung von Proteinen aus verdünnten, wässrigen Lösungen wurde die Methode nach Wessel und Flügge (Wessel and Flügge, 1984) verwendet. Zu einem Volumen Probe wurde ein Volumen 100 % Methanol und
¼ Volumen 100 % Chloroform gegeben und kräftig gemischt. Nach einer Zentrifugation (Eppifuge, 14.000 rpm, 5 min, RT) und erfolgter Phasentrennung (obere wässrige Phase: DNA, Interphase: Proteine) wurde die obere Phase abgenommen, zu dem Rest wurden ¾ Volumen 100 % Metanol gegeben, kräftig gemischt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, das proteinhaltige Pellet wurde im Exsikator oder bei 55 °C getrocknet (30 min).
Bei Proben, die mehr als 10 % Sucrose (siehe Gradienten) oder Glycerin enthielten, musste die Chloroformmenge auf 1/3 oder ½ des Ausgangsvolumens erhöht werden. Das Pellet wurde in 1x Lämmliprobenpuffer aufgenommen und erhitzt. Bei Immunfällungen wurde das Proteinpellet zuerst in 2 % SDS gelöst (30 min, 55°C), dann wurde die Probe auf 200 mM DTT eingestellt, für 10 min bei RT inkubiert mit 10 x Lämmliergänzungspuffer versetzt und für 5 min bei 95°C erhitzt.
3.3.5 Agarosegelelektrophorese
Gereinigte oder deproteinisierte DNA wurde auf einem 0,8 % oder 1 % Agarosegel aufgetrennt. Als Laufpuffer wurde entweder 1 x TAE (Chromatinfragmente) 0,5 x TBE (Topolgie Assay) oder 0,5 x TBE-spezial (EMSA) verwendet. Die Gelelektrophorese wurde im Allgemeinen bei einer Spannung von 100 V und einer Laufzeit von 90 min durchgeführt. Für topologische Untersuchungen wurden 0,8 % Gele verwendet, die mit 2 V/cm für 16 h liefen. Die Gele wurden für 30 min in Ethidiumbromid (0,05 µg/ml in Wasser) eingelegt, dann für 15 min in reichlich Wasser entfärbt und fotografiert.
3.3.6 DNA Fällung
Zu einer Probe wurde 1/10 Volumen 3M Natriumacetat und das 2,5-fache Volumen 100 % Ethanol (-20°C) gegeben, gemischt und für 1 h bei –20°C gefällt. Die Probe wurde dann für 15 min zentrifugiert (Eppifuge, 14.000 rpm, 4°C), der Überstand verworfen und das Pellet mit 0,5 ml 70 % Ethanol
gewaschen und erneut zentrifugiert. Für Oligonukleosomen wurde 80 % Ethanol verwendet. Die Pellets wurden im Exsikator oder bei 55°C getrocknet und im entsprechenden Probenpuffer aufgenommen.
3.3.7 Plasmid-Präparation und Cäsiumchlorid Reinigung
Plasmidpräparationen wurden zu Kontrollzwecken aus einer 5 ml Übernachtkultur mittels einem Plasmid-Mini-Präp-Kit durchgeführt. Für einen Cäsiumchloridgradienten wurden die Plasmide aus einer 500 ml Übernachtkultur nach Birnboim aufgereinigt (Birnboim, 1983). Der Cäsiumchloridgradient zur Reinigung der Plasmide wurde nach Sambrook et al (Sambrook et al., 1989a) durchgeführt.
3.4 Baculovirus-System und Proteinreiniung
3.4.1 Klonierung von His-DEK
Die DEK cDNA (open reading frame) wurde aus dem pRSET–A Vektor (Ingo Scholten, Universität Konstanz) durch EcoRI und BamHI-Verdau gewonnen (Fragment von 1,2 kb). Dieses Fragment wurde in einen durch EcoRI und BamHI linearisierten pBacBlueHis2 A subkloniert und amplifiziert. Der Vektor wurde in den E.coli Stamm XL-1 Blue mittels Hitzeschock transformiert. Klone wurden gepickt, der Vektor durch Plasmidpräparation aufgereingt und durch erneuten Restriktionsverdau und Sequenzierung auf die Richtigkeit überprüft.
Um genügend Material zu bekommen, wurden Maxipräparationen mit anschließender Cäsiumchlorigradienten Reinigung durchgeführt.
