Effekte der CK2-Phosphorylierung auf die DEK-Chromatin- DEK-Chromatin-Interaktion

Bisher wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung durch die Protein-Kinase CK2 die DEK-DNA-Bindung durch die zweite DNA-Bindedomäne vollständig inhibiert und einen allgemeinen inhibitorischen Effekt auf die DNA-Bindung im DEK-Molekül ausübt. Dieser Effekt wurde bisher nur auf proteinfreier DNA beobachtet. Nun sollte die Bindung von His-DEK an Chromatinsubstrate untersucht werden. Hierfür wurden zunächst SV40-Minichromosomen verwendet. Der SV40-Virus hat den Vorteil, dass er eukaryotische Zellen infiziert und dann die Wirtsproteine verwendet, um sein Genom in eine der Wirtszelle identische Chromatinstruktur zu verpacken. Diese sogenannten Minichromosomen können nun unter verschiedenen Bedingungen aufgereinigt werden, so dass Chromatinsubstrate gewonnen werden, die nur die „Core“-Histone oder „Core“-„Core“-Histone und H1 (und andere Chromatinproteine) enthalten (Gruss, 1995). Hier wurden salzgewaschene SV40-Minichromosomen verwendet, die nur die „Core“-Histone enthalten (25-28 Nukleosomen).

Waldmann et al. konnten zeigen, dass DEK an SV40-Minichromosomen bindet und die Topologie verändern kann (Waldmann et al., 2002). Inkubation von SV40-Minichromosomen mit DEK führt zu einem Schutz von 50 bp nukleosomaler DNA nach Mikrokokken-Nuklease Verdau des Chromatins (Tanja Waldmann, Dissertation).

Nun stellt sich die Frage, wie sich die Phosphorylierung auf die DEK-Chromatin-Interaktion auswirkt. Zunächst wurden salzgewaschene SV40-Minichromosomen mit steigenden Mengen an dephosphoryliertem und phosphoryliertem His-DEK inkubiert und mit Mikrokokken-Nuklease behandelt (Abbildung 4-27. DEKdephos, DEKphos). Die gereinigten Produkte wurden auf einem Agarosegel analysiert. Ohne DEK (-DEK) wurde die typische mono- bis trinukleosomale Leiter beobachtet. Dephosphoryliertes DEK führte, wie schon beschrieben, zu einer Verlängerung der geschützten DNA um 50 bp. Folglich induziert die DEK-Bindung einen Schutz von ca. 50 bp, was auf eine kompaktere Chromatinstruktur schließen lässt (DEKdephos , 50, Dreieck). Im Gegensatz dazu resultiert eine Inkubation mit phosphoryliertem DEK in keinem Schutz (DEKphos, 50). Bei höheren DEK-Mengen kann man einen etwas verzögerten Abbau beobachten, was auf eine inhomogene DEK-Population zurückzuführen sein könnte (DEKphos.150).

Abbildung 4-27 Mikrokokken-Nuklease Verdau von SV40-Minichromosomen

Dephosphoryliertes und phosphoryliertes His-DEK wurden mit je 1µg salzgewaschenen SV40 Minichromosomen in der Anwesenheit von 5 units Topoisomerase I in nE100 für 1 h bei 37°C inkubiert.

Die einzelnen Proben wurden mit 3 mM CaCl2 versetzt und mit 6 units Mikrokokken-Nuklease für 1, 2, und 3 min verdaut. Die Reaktion wurde abgestoppt, die DNA wurde gereinigt und auf einem 1,5 % Agarosegel aufgetrennt und durch Sybr-Gold Färbung sichtbar gemacht.

Beruht dieser Effekt auf einer veränderten Bindung von phosphoryliertem DEK an die Minichromosomen oder auf einer inhibierten DEK-Bindung? Dieser Aspekt sollte im Folgenden untersucht werden.

Hierfür wurde dephosphoryliertes, rekombinantes His-DEK mit salzgewaschenen SV40-Minichromosomen in Puffer mit 50 mM NaCl (nE50) und in der Anwesenheit von Topoisomerase I inkubiert. Das gebundene DEK wurde dann wie beschrieben phosphoryliert. Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne CK2. Nach erfolgter in situ Phosphorylierung wurden die beiden Proben auf 5-30 % Sucrosegradienten mit 100 mM NaCl für 3 Stunden aufgetrennt. Die Gradienten wurden fraktioniert und die gereinigte DNA auf einem Agarosegel analysiert. Die gefällten Proteine der einzelnen Fraktionen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie und durch Immunblot analysiert.

Wie GST-DEK verändert auch dephophoryliertes DEK die Topologie der Minichromosomen und bleibt während der Zentrifugation am Chromatin gebunden (Abbildung 4-28, (-P). Eine Phosphorylierung von

chromatingebundenem His-DEK durch die CK2 resultiert in einer Ablösung dieser Population von den Minichromosomen (+PCK2). Diese ungebundene DEK-Population ist phosphoryliert (vergleiche α-DEK und ³²P). Die noch gebundene Restpopulation ist entweder schwach- oder nicht phosphoryliert (+PCK2., Fraktion 13,14). Es fällt hier auf, dass die Topoisomerleiter erhalten bleibt, obwohl DEK nicht mehr gebunden ist. Dies liegt daran, dass die Topoisomerase unter den Gradientenbedingungen ebenfalls von den Minichromosomen abgelöst wird (Tanja Waldmann, persönliche Kommunikation). Die frei werdenden Supercoils können folglich nicht mehr von ihr relaxiert werden.

Der beobachtete Verlust des Schutzes von 50 bp für die phosphorylierte DEK-Population in Abbildung 4-27, beruht folglich nicht auf einer veränderten Bindung, sondern auf einer inhibierten DEK-Bindung an Chromatin.

Abbildung 4-28 Interaktion von dephosphoryliertem und phosphoryliertem His-DEK mit salzgewaschenen SV40-Minichromosomen

A. Salzgewaschene SV40-Minichromosomen wurden mit dephosphoryliertem His-DEK (im molaren Verhältnis von 60 DEK/DNA) in der Anwesenheit von Topoisomerase I für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Der Ansatz wurde auf einen 5-30 %Sucrose Gradienten aufgeschichtet und bei 36.000 rpm (SW40) für 3 Stunden zentrifugiert. Aus den einzelnen Fraktionen wurde die DNA durch Ethanolpräzipitation gefällt, auf einem 0.8 % Agarosegel in 0.5 x TBE aufgetrennt und durch EtBr-Färbung sichtbar gemacht. Die Proteine wurden durch Wessel-Flügge Fällung präzipitiert und durch SDS-PAGE, Autoradiographie (³²P) und Immunoblotting mit DEK spezifischen Antikörpern nachgewiesen (α-DEK). Form I DNA: supergecoilt; Form II: entspannte, zirkulär geschlossene oder genickte DNA.

B. Ansatz wie in A, gefolgt von einer in situ-Phosphorylierung durch gereinigte CK2 (+PCK2).

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Phosphorylierung durch die CK2 nicht nur die DEK-DNA-Interaktion inhibiert, sondern auch die DEK-Chromatin-Interaktion.

Nun sollte untersucht werden, ob gereinigte CK2 auch endogenes, nukleosomal gebundenes DEK phosphorylieren kann. Dafür wurden HeLa S3-Kerne mit Mikrokokken-Nuklease verdaut, wodurch etwa 50 % des chromatingebundenen DEKs freigesetzt wird. Diese Population ist mit Mono- bis Oligonukleosomen assoziiert (Kappes et al., 2001). Nach Ermittlung der optimalen Verdauzeit, wurden dann die gewonnenen nukleosomalen Fragmente mit gereinigter CK2 und [³²P]γ–ATP wie beschrieben phosphoryliert. Nach der Inkubation erfolgte eine Immunfällung des endogenen DEKs. Die Immunkomplexe wurden durch SDS-PAGE, Autoradiographie und Immunblot analysiert (Abbildung 4-29).

Die optimale Verdauzeit für die Mikrokokken-Nuklease lag bei 10 min. Hier kommt es zu einer gleichmäßigen Verteilung von Mono- bis Oligonukleosomen (Abbildung 4-29, A). Die freigesetzte DEK-Menge wurde im Immunblot überprüft (A, DEK). Nach der Phosphorylierungsreaktion mit gereinigter CK2 ist deutlich zu erkennen, dass auch endogenes, nukleosomal gebundenes DEK phosphoryliert wird (Abbildung 4-29, B, ³²P +CK2). In der Kontrolle ohne gereinigte CK2 kommt es nur zu einer schwachen Phosphorylierung, die durch die endogen vorhandene CK2 hervorgerufen werden könnte (³²P -CK2). Hiermit wurde gezeigt, dass endogenes nukleosomal gebundenes DEK auch in vitro durch gereinigte CK2 phosphoryliert werden kann.

Abbildung 4-29 Gereinigte CK2 phosphoryliert endogenes, nukleosomal gebundenes DEK A. Aus HeLa S3 Zellen wurden Kerne hypoton extrahiert und die Kernmembran mit NP-40 entfernt.

Die Kernsuspension wurde für die angegebene Zeit mit 10 units Mikrokokken-Nuklease (für 50µg DNA) bei 14°C inkubiert. Einzelne Proben wurden entnommen, mit 8 mM EDTA versetzt und durch Zentrifugation wurden die freigesetzten nukleosomalen Fragmente gewonnen. Die gereinigte DNA wurde auf einem 0.8 % Agarosegel in 1x TAE aufgetrennt und durch EtBr-Färbung sichtbar gemacht. Die Positionen der mono- di – tri und tetra nukleosomalen Fragmente sind angegeben.

B. Kerne wurden wie in A für 10 min mit 10 units MNase behandelt. Die freigesetzten Fragmente wurden mit Protease- und Phosphatase Inhibitoren, [³²P]γ–ATP und ATP versetzt. Die Phosphorylierungsreaktion wurde durch Zugabe von CK2 gestartet. Nach einer Stunde bei 37°C wurden die Ansätze auf 450 mM NaCl eingestellt und DEK durch monospezifische, polyklonale DEK Antikörper gefällt. Die Immunkomplexe wurden durch SDS-PAGE (10%), Autoradiographie und Immunblot (monoklonaler DEK-AK) analysiert.

Wie oben gezeigt wurde, inhibiert die Phosphorylierung durch die CK2 die DEK-Chromatin-Bindung.

Dieser Befund steht in einem offensichtlichen Widerspruch zu vorherigen Daten, denn zu keinem Zeitpunkt im Zellzyklus konnte lösliches DEK detektiert werden (Kappes et al., 2001). Da DEK aber über den ganzen Zellzyklus phosphoryliert vorkommt, scheint auch phosphoryliertes DEK chromatingebunden vorzukommen. In Kappes et al. (2001) wurde weder eine

Lokalisations- noch eine Mengenänderung von DEK im Zellzyklus festgestellt.

Hier wurden die Zellfraktionierungen in großen NaCl-Schritten durchgeführt. Um nun die Möglichkeit nicht außer Acht zu lassen, dass die Phosphorylierung von zellulärem DEK doch zu einer veränderten Lokalisation führt, wurden im Folgenden Zellfraktionierungen in kleineren NaCl-Schritten durchgeführt.

4.5.4.1 Eine stärkere Phosphorylierung in der G1-Phase des Zellzyklus führt zu keiner Lokalisationsänderung von DEK

Für die Zellfraktionierungen wurden Zellen verwendet, die 12 oder 15,5 Stunden aus dem doppelten Thymidinblock entlassen wurden (G1-Phase des Zellzyklus). Mit diesen HeLa S3-Zellen wurde zum einen eine konventionelle Zellfraktionierung durchgeführt (Abbildung 4-30, A), das heißt nach Abtrennen des Cytosols und des Nukleosols wurde die Chromatinfraktion mit 100, 150, 250, 300, 350, 400 und 450 mM NaCl extrahiert und zum anderen in kleineren NaCl-Schritten (Abbildung 4-30, B). Wie bei den salzgewaschenen SV40-Minichromosomen beobachtet, würde man durch eine stärkere Phosphorylierung von DEK eine schwächere oder gar inhibierte Chromatinbindung von DEK vermuten. In beiden Fällen konnte man keine signifikanten Unterschiede in der Bindungsstärke von endogenem DEK detektieren (Abbildung 4-30, A, B)

Abbildung 4-30 Zellfraktionierung von G1-Phase-Zellen

A. HeLa S3-Zellen wurden durch einen doppelten Thymidinblock synchronisiert und für 12 und 15,5 Stunden aus dem Block entlassen. Die Zellen wurden mit hypotonem Puffer inkubiert um das Cytosol freizusetzen (C). Nach einer Zentrifugation wurden die Kerne mit NP-40 lysiert. Dies führt zu einer Freisetzung des Nuleosols und nicht NP-40 resistenten Proteine (N). Die gewonnene Chromatinfraktion wurde nun in einer Reihe mit steigenden NaCl-Mengen extrahiert. Die Proteine aus allen Fraktionen (entsprechende Aliquote) wurden durch eine Wessel-Flügge-Fällung präzipitiert und durch SDS-PAGE (10 %) und Immunblot mit DEK-spezifischen Antikörpern analysiert.

B. Wie in A. Die verwendeten NaCl-Schritte sind angegeben. Als Kontrolle wurden asynchron proliferierende HeLa S3 Zellen parallel untersucht („interphase“).

Dieses Ergebnis bestätigt einerseits die früheren Arbeiten, andererseits lässt sich dieser Befund mit den Beobachtungen der DEK-DNA- und DEK-Chromatin Interaktionen in einem phosphorylierten Zustand nur schwer in Einklang bringen. Diesem Widerspruch wird im folgenden Abschnitt nachgegangen.