Zellkultur, Synchronisation, Radioaktive Markierung mit [ 32 P]-Orthophosphat und [ 35 S]-Methionin (Pulse- und

Pulse Chase Experimente), S-20 Extrakte, Hancock-Chromatin und Immunpräzipitation

3.9.1 HeLa und CV1 Zellen

HeLa S3 Zellen (menschliche Zervixkarzinomzellen) und CV1- Zellen (Zellen der afrikanischen grünen Meerkatze) wurden auf 145 mm Petrischalen als Monolayerkultur in DMEM mit 5 % FCS (3,75 g/L NaHCO3, 4,5 g/L Glucose) bei 37°C, 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 kultiviert. Dem Kulturmedium waren 40 µg/ml Penicillin-G und 80 µg/ml Streptomycin-Sulfat zugesetzt. Die Zellen wurden alle 2-3 Tage mit Trypsin (5 mg/ml in PBS) von der Platte gelöst und in einem Verhältnis 1:5 umgesetzt. Zellen, die für Experimente zur Verwendung kamen, wurden am Vortag im Verhältnis 1:2 umgesetzt, damit sie am Folgetag subkonfluent waren.

3.9.2 Insektenzellen

High-5 Zellen (Eizellen aus Trichoplusia ni) und SF-9 Zellen (Ovarienzellen aus Spodoptera frugiperda) wurden in Zellkulturflaschen als Monolayerkulturen in Grace`s Insect Medium (Gibco BRL) mit 10 % FCS bei 28°C kultiviert. Die Zellen wurden zum Umsetzten vom Flaschenboden geklopft und im Verhältnis 1:3 oder 1:5 umgesetzt. Floater (bei SF-9) wurden regelmäßig abgesaugt.

3.9.3 Synchronisation und in vivo Pulse-Markierung mit [³² P]-Orthophosphat und [³⁵S]-Methionin

Für die Arretierung von HeLa S3 Zellen im Übergang G1/S-Phase wurde die Methode des doppelten Thymidin-Blocks gewählt. Es wurden je 2 x 10⁶ HeLa Zellen in 10 ml Medium auf 94 mm Zellkulturschalen (für FACS Analysen: 8 x 10⁵ in 2,5 ml Medium auf 64 mm Zellkulturschalen) ausgesät. Nach 4 h wurden 2 ml (0,5 ml) einer 13,2 mM Thymidin-Stammlösung (in Medium, sterilfiltriert, äquilibriert) den Zellen gegeben (Endkonzentration 2,2 mM). Nach einer Inkubation für 14-16 h (1.Block) wurden die Platten 2 x mit Medium gewaschen und erneut mit der entsprechenden Menge Medium aufgefüllt und für 9 h inkubiert (Release). Im Anschluss daran wurde wieder Thymidin zugegeben und für weitere 12-14 h inkubiert (2. Block). Ein weiterer Release folgte. Die Zellen befanden sich nun im G1/S Phase Übergang und laufen synchron durch den Zellzyklus. Die Zellen wurden zu bestimmten Zeiten nach dem Release geerntet.

Tabelle 3-1 Synchronisierung

I II

Tag 1

6:00 Aussaat

10:00 Thymidin (1.Block)

18:00 Aussaat

22:00 Thymidin (1.Block)

24:00 Release

Tag 2

9:00 Thymidin (2.Block)

12:00 Release

21:00 Release Thymidin (2.Block)

Tag 3

9:00 Frühe G1 Release (G1/S Phase)

Für die Untersuchung der Phosphorylierung von DEK wurden die Zellen mit [³²P]-Orthophosphat markiert. Die synchronisierten Zellen wurden dafür zweimal mit 1x SSC (150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat) und einmal mit phosphatfreiem Medium gewaschen. Es folgte eine Inkubation in 5 ml phosphatfreiem Medium mit 200 µCi [³²P]-Orthophosphat.

Für die Untersuchung der Neusynthese und Halbwertszeit von DEK wurden die Zellen gleich behandelt und in methioninfreiem Medium mit 200 µCi [³⁵ S]-Methionin markiert. Für die Ermittlung der Halbwertszeit wurden die Zellen nach der Markierung in Medium mit einem zehnfachen Überschuss an Methionin entlassen (Pulse-Chase).

3.9.4 FACS Analyse

Zur genauen Bestimmung der Zellzyklusphase von Zellen wurde die FACS (fluorescence activated cell sorting)-Analyse verwendet. Mit dieser Methode lässt sich der DNA-Gehalt einer Zelle bestimmen und damit das Stadium der Zelle im Zellzyklus ermitteln. Die Zellen wurden dreimal mit eiskaltem PBS/5 mM EDTA gewaschen und mit 5 ml PBS/5 mM EDTA über Nacht bei 4°C auf der Platte inkubiert. Die Zellen lösen sich durch das EDTA (Chelierung divalenter Kationen, Zerstörung der Zell-Zell Kontakte) von der Platte ab und wurden in Zentrifugenröhrchen gesammelt. Die Zellzahl wurde durch Zellzählung mit dem Coulter-Counter (Beckmann) bestimmt. Für eine Messung wurden 4x10⁵ Zellen abzentrifugiert und in 50 µl PBS/5 mM EDTA aufgenommen. Nun wurde die Propidiumiodid (PI) Färbelösung hergestellt. Für 4 x 10⁵ Zellen benötigt man 18 µg PI. Es wurde eine PI Stocklösung hergestellt (1,4 mg/ml bidest H2O). Für einen Ansatz wurden 12,8 µl PI (= 18 µg) und 0,5 % Triton X-100 verwendet. Der Ansatz wurde auf 250 µl mit PBS/5 mM EDTA aufgefüllt und der Zellsuspension beigefügt (Endvolumen 300µl). Die Proben wurden für 30 min auf Eis und im Dunkeln inkubiert und anschließend in einem FACS Gerät (FACS-Calibur, BD Bioscience) vermessen. Die Auswertung erfolgte mit dem Programm CellQuest (BD Bioscience).

3.9.5 Herstellung von Hanckock Chromatin

Die Präparation von Chromatin nach Hancock (Hancock, 1974) beruht auf der salzfreien Extraktion von Kernen. Deshalb mussten alle verwendeten Glaswaren ausgiebig mit bidest H2O gespült werden, da schon geringste Salzspuren zum Platzen der Kerne führen würden. Alle Arbeiten wurden im Kühlraum und auf Eis durchgeführt. Eine HeLa S-3 Platte (145 mm, 2-4 10⁷ Zellen) wurde dreimal mit je 50 ml EDTA-Puffer (0,25 mM EDTA, pH 8, 0,2 mM Tris) gewaschen und beim letzten Schritt für 2 min inkubiert. Jetzt wurde die Platte mit 40 ml EDTA-Puffer für 30 min auf Eis inkubiert (Zellen lösen sich von der Platte). Der Überstand wurde abgezogen und die Zellen sehr vorsichtig von

der Platte geklopft. Beides wurde in einem Zentrifugenröhrchen gesammelt und pelletiert (600 g, 10 min, 4°C, Jouan). Der Überstand wurde abgezogen und stellt den EDTA-Überstand dar (S1). Das Pellet wurde durch sanftes Schütteln resuspendiert, mit 10 ml EDTA-Puffer versetzt, mittels einer Pateurpipette in ein 13 ml Zentrifugenröhrchen überführt und erneut pelletiert. Der Überstand wurde mit S1 vereinigt. Das Pellet wurde resuspendiert, in 2 ml EDTA-Puffer aufgenommen und unter leichtem Schwenken wurden 2 ml einer 1 % NP-40 Lösung (in EDTA-Puffer) dazupippetiert und für 5 min auf Eis inkubiert. Die Chromatinkörperchen durften nicht klumpen oder kleben, denn dies wäre ein Zeichen für gescherte genomische DNA, die die Präparation unbrauchbar machen würde. Die Chromatin-Lösung wurde nun auf 12 ml einer Sucrose Lösung (100 mM Sucrose, 0,5 mM Tris, pH 8) aufgeschichtet (Corex-RG Glasröhrchen) und für 15 min bei 4000 rpm (HB-4) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen (NP-40 Überstand, S2), das Pellet erneut in 2 ml EDTA-Puffer aufgenommen und über ein zweites Sucrose-Kissen zentrifugiert. Die beiden Überstände wurden vereinigt. Das gallertartige, durchsichtige Pellet enthielt nun die Chromatinkörperchen (chromatin bodies). Diese wurden in 500 µl EDTA-Puffer resuspendiert und der DNA-Gehalt wurde bei OD260 nm vermessen. Die Proteine aus den entsprechende Überständen wurden gefällt und die Proben mittels Immunblot analysiert.

3.9.6 Immunpräzipitation

Für die Immunfällung von DEK wurde HeLa S-3 Zellen fraktioniert (siehe 3.14).

Die Kernfraktion wurde in einem Schritt mit 450 mM NaCl extrahiert. Extrakte wurden entweder frisch oder eingefroren verwendet. Nach dem Auftauen wurden die Extrakte bei 4°C, 10 min abzentrifugiert (14.000 rpm, Eppifuge) um Proteinpräzipitate zu entfernen. Im Falle von Synchronisierungsreihen wurde der Proteingehalt der Extrakte mittels einem Proteinbestimmungskit (Pierce, BCA) ermittelt. Die Extrakte wurden auf den gleichen Proteingehalt und auf 0,5

% NP-40 eingestellt. Für ca. 2-3 x 10⁶ Zellen wurden 3 µg monospezifischer, polyklonaler α-DEK Antikörper (rabbit) verwendet. Der Antikörper wurde zusammen mit den einzelnen Extrakten für 1 h und unter ständigem Rollen bei 4°C inkubiert. Nach Zugabe von 30 µl einer 50 % Protein A Sepharose Lösung zu den einzelnen Proben wurde eine weitere Stunde bei 4°C gerollt. Die Immunkomplexe wurden nun dreimal mit Extraktionspuffer (20 mM Hepes, pH 7,4, 0,5 mM MgCl2, 450 mM NaCl) gewaschen (5min, 4°C, 14.000 rpm, Eppifuge) und anschließend von der Protein A Sepharose mit 2 % SDS, 5 % β-Mercaptoethanol eluiert. Die Elution wurde bei 37°C für 1 h durchgeführt. Die Beads wurden dann je dreimal nacheluiert, die Eluate vereinigt und die Proteine mittels der Wessel und Flügge Fällung präzipitiert. Die Proteinpellets wurden bei 55°C für mindestens 30 min getrocknet. Für die Analyse in der SDS-PAGE wurden sie zuerst mit 2 % SDS versetzt und für 30 min bei 55°C inkubiert. Es

erfolgte dann die Zugabe von 200 mM DTT (Endkonzentration) und Inkubation für 10 min bei RT. Zuletzt wurde den Proben ein 10 x Lämmli-Ergänzungspuffer (10x, 50 % Glycerin, 40 % β-Mercaptoethanol, 10 % 1M Tris, pH 7,6) beigemischt und für 10 min bei 95°C gekocht. Diese Prozedur verhindert große Antikörperkomplexe im Gel, die zu Fehlinterpretationen in der nachfolgenden Analyse führen würden. Die Proben wurden nun durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Membran transferiert und mittels Autoradiographie und Immunblot analysiert.

3.9.7 Herstellung von S-20 Extrakten

Für die Herstellung von S-20 (S-100) Extrakten wurden 10-20 HeLa S-3 Platten (145 mm Ø) verwendet. Alle Arbeiten wurden im Kühlraum und auf Eis durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, mit einem Gummischaber von der Platte entfernt und in 13 ml Zentrifugenröhrchen gesammelt. Nun wurden sie pelletiert (164 g, 10 min, 4°C, Jouan) und in 5 ml hypotonem Puffer plus Sucrose aufgenommen (20 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 5 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 250 mM Sucrose, 0,1 mM DTT (kurz vor Gebrauch zugeben) ) und erneut pelletiert. Das Zellpellet wurden nun in 10 ml hypotonem Puffer ohne Sucrose aufgenommen und erneut pelletiert. Das Volumen des Pellets verdoppelt sich bei diesem Schritt. Falls bei der Pelletierung keine eindeutige Grenze zwischen Pellet und Überstand zu sehen war, wurde erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde nun in einen Douncer überführt (5 ml, S- Fit) und für 10 min auf Eis inkubiert (weitere Schwellung der Kerne). Anschließend wurde 12 mal gedounct (Brechen der Zellmembran) und die Zellsuspension wurde für weitere 30 min auf Eis inkubiert (Elution der Kernproteine). Die Suspension wurde dann in Ultrazentrifugenröhrchen überführt und für eine Stunde zentrifugiert (z.B TLA-45, 20.000 g (20.000 rpm), 100.000 g (45.000 rpm), 4°C), der Überstand abgenommen, vereinigt und in vorgekühlte Reaktionsgefäße aliquotiert und bei – 70°C gelagert. Die Pelletfraktion wurde bei Bedarf mit steigenden NaCl Mengen, oder SDS nacheluiert und wie oben beschriebenen behandelt. Es folgte eine Proteinbestimmung mit BSA als Standard (Biorad- Assay). Die gelagerten Extrakte wurden maximal 3 Monate verwendet.