Baculovirus-System und Proteinreiniung

3.4.1 Klonierung von His-DEK

Die DEK cDNA (open reading frame) wurde aus dem pRSET–A Vektor (Ingo Scholten, Universität Konstanz) durch EcoRI und BamHI-Verdau gewonnen (Fragment von 1,2 kb). Dieses Fragment wurde in einen durch EcoRI und BamHI linearisierten pBacBlueHis2 A subkloniert und amplifiziert. Der Vektor wurde in den E.coli Stamm XL-1 Blue mittels Hitzeschock transformiert. Klone wurden gepickt, der Vektor durch Plasmidpräparation aufgereingt und durch erneuten Restriktionsverdau und Sequenzierung auf die Richtigkeit überprüft.

Um genügend Material zu bekommen, wurden Maxipräparationen mit anschließender Cäsiumchlorigradienten Reinigung durchgeführt.

Abbildung 3-1 pBlueBacHis2

A. Multiple Clonig Site von pBlueBacHis2. Es wurden die BamHI und EcoRI Schnittstellen zum Subklonieren der DEK cDNA verwendet. B. Nukleotidsequenz der Multiple Clonig Site.

Ko-Transfektion und Plaque-Assay

Um einen rekombinanten Virus im Baculovirus-System herzustellen, wurde linearisierte BAC-N-Blue DNA (AcMNPV DNA) zusammen mit dem pBacBlueHis2A–DEK Vektor in SF-9 Zellen kotransfiziert.

Für eine Transfektion wurde folgender Ansatz gewählt:

0,25µg BAC-N-Blue-DNA 5µl

4µg pBlueBacHis2 A-DNA Max. 10µl

20µl Cellfectin

15 min RT (ab und zu schnippen)

+ 1 ml Hämolymphe -und Serum-freies Medium -Infektion der Zellen für 1 h

SF-9 Zellen wurden 4 h vor der Transfektion auf kleine Zellkulturflaschen (5 ml) umgesetzt, damit sie ca. 50 % konfluent waren. Das Medium wurde abgesaugt, der DNA-haltige Ko-Transfektionsansatz wurde dazugegeben und für 1 h bei 27°C inkubiert. Während der Inkubation wurde alle 15 min die Flasche geschwenkt. Das Medium wurde dann abgesaugt und mit 5 ml Serum - und hämolymphehaltigem Medium aufgefüllt. Die so behandelten Zellen wurden nun für 6-8 Tage bei 27°C inkubiert. Es erfolgte eine tägliche Kontrolle der Zellen.

Bei sichtbaren „Höfen“ und beginnendem Schwimmen der Zellen wurden diese geerntet. Nach einer Zentrifugation (500 g, 5 min) stellt der Überstand den virushaltigen „P0“ Stock dar. Da die Möglichkeit nicht auszuschließen ist, dass Wildtyp-Viren vorhanden sind, wurde mit dem P0 Stock ein „Plaque Assay“

durchgeführt. Die Kontamination durch Wt-Viren würde den Virusstock unbrauchbar machen, da der Wt-Virus in den nächsten Amplifikationsrunden überhand nehmen würde.

Zur Durchführung des „Plaque Assays“ wurden 5x10⁶ SF-9 Zellen auf eine 94 mm Zellkulturschale ausgesät und sich mindestens 4 h absetzen lassen. Es wurden Verdünnungen des P0 Stocks hergestellt (10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7), und die SF-9 Zellen wurden damit für 1 h unter regelmäßigem Schwenken infiziert. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen mit einer Mischung aus low-melting-Agar (50°C), Serum mit X-Gal (RT) und Serum bei 50°C (je 3 ml) überschichtet. Nach dem Aushärten unter der Sterilbank (Kontrolle im

Lichtmikroskop) wurden die Platten in 145 mm Petrischalen überführt, die mit einem in 5 mM EDTA getränkten Glasfaserfilter ausgelegt waren, um Kontaminationen zu vermeiden. Nach 4-8 Tagen konnte man blaue Plaques erkennen, die mittels einer Pasteurpipette gepickt wurden und in 1 ml Medium aufgenommen wurden. Es wurde versucht, nur Plaques zu picken, die räumlich nicht in der Nähe von Wt-Virus-Plaques (weissliche, stark lichtbrechende Struktur) lagen. Die so erhaltenen Plaque-gereinigten rekombinanten Viren sind bei 4°C und Dunkelheit über Jahre hinweg haltbar. Um nun „High-Titer“

Virusstöcke anzulegen, wurden SF-9 Zellen mit den gepickten Plaques infiziert.

Es folgten drei Runden der Virusamplifikation (P1 (5 ml), P2 (15ml), „high-titer“-P3 Virusstock (30 ml)), die je 4-8 Tage dauerten (27°C, normale Luftzusammensetzung und Feuchtigkeit). Geerntet wurden die Überstände immer dann, wenn sich die Zelllyse andeutete (500 g, 5 min). Falls schon Zellen lysiert waren, wurde mehrmals zentrifugiert. Die P1-P3 Stöcke wurden bei 4°C und Dunkelheit aufbewahrt.

Abbildung 3-2 Prinzip der homologen Rekombination zur Gewinnung von rekombinanten Viren A. Prinzip der homologen Rekombination zur Herstellung von rekombinanten Viren. B. verwendete Bac-N-Blue-DNA.

Abbildung 3-3 „Plaque“-Assay Prinzip des „Plaque Assays“.

3.4.2 Infektion, Reinigung und Dephosphorylierung von His-DEK und His-DEK Deletionsmutanten

High-5 Zellen wurden 4 h vor der Infektion ausgesät (50 % Konfluenz) und mit 150 µl eines P3 Stockes infiziert. Nach 3 Tagen Infektion wurden die Zellen von der Platte abgeschabt und in 50 ml Röhrchen überführt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS (Jouan, 500g, 5 min, 4°C) wurden die Zellpellets bei –70°C gelagert. Die Lyse erfolgte mit 2 ml Lysepuffer (100 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM MgCL2, 5 mM KCl, 5 mM Imidazol, 1 % NP-40, 1x Complete) für das Pellet einer großen Zellkulturflasche. Nach einer Inkubation von 30 min auf Eis wurde das Lysat auf 1,3 M NaCl eingestellt und für 20 min bei RT gerollt.

Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation (100.000 g, SW-40, 10min, 4°C) entfernt. Der Überstand wurde mit Lysepuffer auf 750 mM NaCl verdünnt danach die äquilibrierte Ni-NTA Agarose dazugegeben (20µl, 50 % Lösung für 4 ml Lysat). Nach der Bindung (1h, 4°C, rollen) wurden die Beads abzentrifugiert (Jouan, 3500 rpm, 50 sec, 4°C) und zweimal mit je 20 ml WP-150 (50 mM Tris, pH 7,5, WP-150 mM NaCl, 50 mM Imidazol) gewaschen. Die Beads wurden dann in eine Minisäule überführt und je zweimal mit WP-300 (50 mM Tris, pH7,5, 300 mM NaCl, 50 mM Imidazol) und je zweimal mit WP-150 gewaschen. Die Elution erfolgte im Elutionspuffer (100 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazol) mit doppeltem Säulenvolumen in zehn Schritten.

Die verschiedene Elutionen wurden auf einem SDS-PAGE mit folgender Comassie Färbung auf ihren Proteingehalt untersucht. Die Fraktionen mit dem meisten Proteingehalt (Fraktion 2-5) wurden vereinigt, RNAse verdaut und in

Aliquoten bei –70°C gelagert. Der Proteingehalt der verschiedenen Deletionsmutanten wurde an wt-His-DEK abgeglichen.

Zur Entfernung der Phosphatreste von gereinigtem His-DEK wurde die Protein Phosphatase λ verwendet. 10 pmol rekombinantes Protein wurde mit 400 units λ-Phosphatase in Dephosphorylierungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM MnCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,01 Brij 35) für mindestens 90 min bei 30°C inkubiert.

Abbildung 3-4 Reinigung über Ni-NTA-Agarose

A. Prinzip der Reinigung von überexprimierten His-getaggten Proteine über Ni-NTA Agarose. B. Bindung des His-Tags an die Ni-NTA Matrix . C. Struktur von Imidazol und Histidin.