Funktionelle Domänen des DEK-Proteins

Durch die Herstellung einer Serie von DEK-Deletionsmutanten sollten die Domänen, die für die DNA-bindenden und Topologie-verändernden Eigenschaften des DEK-Proteins verantwortlich sind, untersucht werden. Wie schon in Kapitel 4.2 beschrieben, wurde wtDEK im Baculovirus-System exprimiert. Dieses System wurde auch für die Expression der DEK-Deletionsmutanten gewählt. In Abbildung 4-15 sind alle klonierten und überexprimierten DEK-Deletionsmutanten gezeigt.

Abbildung 4-15 Schematische Darstellung aller klonierten und überexprimierten DEK-Deletionsmutanten

Rote Boxen stellen die sauren Bereiche, die grüne Box stellt die potenzielle DNA-Bindedomäne SAF-Box (oder SAP-Box) dar. In der rechten Spalte ist die Expression dargestellt, wobei die Menge an überexprimiertem Protein durch + dargestellt ist. Mutanten die mit +/? gekennzeichnet sind, wurden entweder nicht exprimiert, oder waren bis zur Beendigung dieser Arbeit nicht charakterisiert.

Bei der Herstellung der Deletionsmutanten wurde folgende Kriterien berücksichtigt:

-Bereich, der bei der DEK-CAN Fusion fehlt (aa 350-375)

-homologe Bereiche zu DEK-Proteinen aus anderen Spezies (aa 87-187 und 310-375)

-potenzielle DNA-bindende Bereiche (SAF-Box, 149-187)

-Saure Domänen

-Bereiche für potenzielle Protein-Protein-Interaktionen

-Ergebnisse aus „Yeast-Two-Hybrid“-Analysen (Scholten, 2004) (Kappes et al., 2004)

-Bereich der den Phänotyp von ATM aufheben kann (310-375) (Meyn et al., 1993)

Nach diesen Kriterien wurden N- und C-terminale Bereiche des Proteins deletiert. Die potenzielle DNA-Bindedomäne, SAF-Box, wurde ebenfalls vom N- und C-terminalen Bereich her eingegrenzt (Klonierung der Mutanten durch Ingo Scholten).

Die Reinigung der verschiedenen Deletionsmutanten wurde auf Reinheit und Expressionsmenge hin optimiert. Die Vorgehensweise bei der Reinigung war analog zu der von wtDEK (Kapitel 4.2). Beispielhaft sind in Abbildung 4-16 repräsentative Reinigungen gezeigt. Der Reinheitsgrad der verschiedenen Mutanten war bei ca. 90-95%. Die Deletionsmutante 87-187 stellte mit 70 % Reinheitsgrad die schlechteste Präparation dar.

Abbildung 4-16 Darstellung einer Auswahl an gereinigten Deletionsmutanten aus dem Baculovirus-System

Die verschiedenen Mutanten und wtDEK wurden auf einem 10-18 % SDS-PAGE aufgetrennt und durch eine Comassie Färbung sichtbar gemacht. Die Position eines Proteinstandards ist in kDa angegeben.

Bevor mit den biochemischen Studien der DEK-Deletionsmutanten begonnen werden konnte, wurde wtHis-DEK auf seine Eigenschaften bezüglich der DNA-Bindung und im Topologieassay untersucht. Im folgenden Kapitel erfolgt ein Vergleich von His-DEK mit den beschriebenen Eigenschaften des gut

charakterisierten GST-DEKs. Da His-DEK phosphoryliert aus dem Baculovirus-System gereinigt wird, wurde diese Tatsache besonders berücksichtigt.

4.4.1 Nur dephosporyliertes His-DEK führt, wie GST-DEK, zur Bildung einer Topoisomerleiter und bindet an DNA

In den folgenden Experimenten sollte untersucht wurden, ob His-DEK alle bisher von GST-DEK bekannten Eigenschaften wie Supercoiling-Aktivität und DNA/Chromatin-Bindung (Alexiadis et al., 2000; Waldmann et al., 2002;

Waldmann et al., 2003) aufweist.

GST-DEK bindet an DNA und führt zu großen DNA-Protein-Komplexen, die in den Geltaschen liegen bleiben (Waldmann et al., 2002; Waldmann et al., 2003).

Diese Eigenschaft wurde durch EMSAs für His-DEK untersucht (Abbildung 4-17, A). His-DEK wurde sowohl unbehandelt (DEKphos.), als auch dephosphoryliert (DEKdephos.) in den Assay eingesetzt. Zu erkennen ist nun, dass die beiden Populationen unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, wobei die dephosphorylierte His-DEK-Form wie GST-DEK zu großen Nukleoproteinkomplexen führt. Eine veränderte DNA-Bindung für unbehandeltes His-DEK wurde auch in South-Western-Untersuchungen gefunden (Abbildung 4-17, B). Hier weist die unbehandelte His-DEK-Form eine wesentlich geringere DNA-Bindung als dephosphoryliertes His-DEK auf. Es scheint sich hier, abhängig von der Untersuchungsmethode, einmal um eine andere Art der DNA-Bindung (Abbildung 4-17, A) und einmal um eine inhibierte DNA-Bindung zu handeln (Abbildung 4-17, B).

Die Inkubation von zirkulär geschlossener, proteinfreier DNA-Substrate mit GST-DEK führt zu einer Topologieveränderung durch die Einführung von positiven Supercoils (Waldmann et al., 2002). Wurden nun unbehandeltes

(DEKphos.) und dephosphoryliertes His-DEK (DEKdephos.) in einem

Topologieassay (DEK-Assay) getestet, so wies nur die dephosphorylierte Form topologieverändernde Eigenschaften auf (Abbildung 4-17, C).

In allen untersuchten Punkten erfüllte die dephosphorylierte His-DEK-Form die Eigenschaften von GST-DEK und wurde folglich für alle weiteren Untersuchungen verwendet.

Als Kontrolle wurden die Untersuchungen ebenfalls mit Reinigungen aus mock-transfizierten Zellen durchgeführt. Hier zeigte sich weder eine Aktivität in der DNA-Bindung noch in der Topologieveränderung, und es wurden weder DNasen noch Topoisomerasen mitgereinigt (Daten nicht gezeigt).

A. EMSA. Steigende Mengen unbehandeltes (DEKphos.) und dephosphoryliertes His-DEK (DEKdephos.) wurden mit Form III SV40 DNA (linear) inkubiert. Die Produkte wurden auf einem 0.6 % Agarosegel aufgetrennt und durch Ethidiumbromid-(EtBr) Färbung sichtbar

Nach Blocken der Membran erfolgte eine Inkubation mit radioaktiv markierter, HinfI His-DEK wurden mit 175 ng Form I SV40 DNA (supergecoilt) in der Anwesenheit von Topoisomerase I inkubiert. Die Ansätze wurden deproteinisiert, die DNA gefällt und auf einem 0.8 % Agarosegel und EtBr. Färbung analysiert. (–) kennzeichnet die Probe ohne DEK.

Abbildung 4-17 EMSA, South-Western und Topologieassay mit wtHis-DEK

4.4.2 Dephosporyliertes His-DEK bindet wie GST-DEK an SV40 Minichromosomen

Eine weitere beschriebene Eigenschaft von GST-DEK ist die Bindung an SV40-Minichromosomen, die zum einem zu einer Topologieveränderung und zum anderen zu einem veränderten Sedimentationsverhalten führt (Waldmann et al., 2002). Dieser Aspekt wurde hier durch Sedimentationsanalysen mit unbehandeltem (Abbildung 4-18, -λ PPase) und dephosphoryliertem His-DEK

(+ λ PPase) in der Gegenwart von salzgewaschenen SV40-Minichromosomen untersucht.

Abbildung 4-18 Bindung von unbehandeltem und dephosphoryliertem His-DEK an salzgewaschene SV40 Minichromosomen

Unbehandeltes (-λ PPase) und dephosphoryliertes (+λ PPase) wurde mit SV40-Minichromosomen in der Anwesenheit von Topoisomerase I inkubiert. Die molaren Verhältnisse sind angegeben. Die Ansätze wurden auf 5-30 % Sucrose Gradienten aufgeschichtet, für 3 h bei 36.000 rpm sedimentiert und fraktioniert. Die DNA der einzelnen Fraktionen wurde nach Deproteinisierung gefällt und auf 0.8 % Agarosegelen aufgetrennt und durch EtBr-Färbung sichtbar gemacht (jeweils obere Abbildung). Die Proteine der einzelnen Fraktionen wurden präzipitiert und durch Immunblot mit DEK-spezifischen Antikörpern analysiert (jeweils untere Abbildung). Als Kontrollen wurden Gradienten nur mit SV40-Minichromosomen allein (MC without DEK) und nur DEK allein (-, + λ PPase, free DEK) durchgeführt.

Wie schon für proteinfreie DNA gezeigt, kann nur dephosphoryliertes His-DEK an die Minichromosomen binden und somit auch die Topologie verändern.

Phosphoryliertes His-DEK dagegen bindet nicht an die Minichromosomen (DEK/MC 15). Bei höheren DEK-Mengen allerdings (DEK/MC 30, -λ PPase) findet sich eine Subpopulation an DEK, die mit den Minichromosomen

ko-lokalisiert. Dies könnte auf eine inhomogene DEK-Population, bei der nicht alle Moleküle gleich stark phosphoryliert vorkommen, zurückzuführen sein. Im Falle von dephosphoryliertem His-DEK ist eine Bindung an die Minichromosomen und eine damit verbundene Topologieveränderung deutlich erkennbar.

Freies unbehandeltes und dephosphoryliertes His-DEK befinden sich nach 3 Stunden Zentrifugation in den gleichen Fraktionen (Abbildung 4-18, free DEK) des Gradienten. Nach einer Zentrifugation von 14 Stunden fällt das phosphorylierte DEK jedoch komplett aus (Daten nicht gezeigt).

Unbehandeltes His-DEK scheint nicht immer den gleichen Phosphorylierungsstatus aufzuweisen, denn sowohl in den EMSA-Experimenten (Abbildung 4-17, A) als auch in den Sedimentationsanalysen zeigten sich Subpopulationen, die an DNA binden können. Es handelt sich in Folge dessen immer um eine Mischpopulation von vollständig phosphorylierten und unter- oder dephosphorylierten DEK-Molekülen. Selbst nach einer Dephosphorylierung mit λ Phosphatase blieben einige Phosphatgruppen erhalten (siehe Abbildung 4-13). Diese resistenten Phospatgruppen beeinflussen die DEK Aktivität in den hier untersuchten Assays jedoch nicht.

Aus diesem Kapitel lässt sich schließen, dass sich dephosphoryliertes His-DEK in Bezug auf Topologieveränderung und DNA/Chromatin-Bindung wie das gut charakterisierte GST-DEK verhält. Deshalb konnte für alle weiteren DNA-Bindungs- und Topologiestudien das rekombinante, dephosphorylierte His-DEK verwendet werden. Alle DEK-Deletionsmutanten wurden ebenfalls vor Gebrauch, analog zu wtDEK, dephosphoryliert.

4.4.3 DNA-Bindung und Toplologierveänderung von DEK und DEK-Deletionsmutanten

Die DEK-Aminosäuresequenz weist eine Homologie zu dem DNA-Bindemotiv SAF-Box (oder SAP-Box) auf. Da DEK als sequenzunspezifisches DNA-Bindeprotein identifiziert wurde (Alexiadis et al., 2000; Waldmann et al., 2003), könnte dieser Bereich für die Vermittlung der DNA-Bindung verantwortlich sein.

4.4.4 Das SAF-Box enthaltende Fragment 87-187 bindet DNA

Diese Vermutung sollte durch EMSA-Studien untersucht werden. WtHis-DEK bindet, wie GST-DEK auch, an DNA und führt zu großen DNA-Protein Komplexen, die in den Geltaschen liegen bleiben (Abbildung 4-19; A, wt, Spur 3 und 4) (Waldmann et al., 2002), (Waldmann et al., 2003). Diese Eigenschaft wurde auch für die Fragmente 1-250 und 1-187 beobachtet (Spur 6,7 und 9,10).

Der Bereich um die SAF-Box wurde weiter eingegrenzt und das kleinste zur Verfügung stehende Fragment 87-187 zeigt eine vergleichbare DNA-Bindeaktivität wie wtDEK. Das SAF-Box enthaltende Fragment ist folglich für die DNA-Bindung verantwortlich.

Wie schon in der Einleitung erwähnt (Kapitel 1.4.2) konnte eine Multimerisierungsdömäne in dem Protein identifiziert werden (Kappes et al., 2004), die sich von Aminosäure 270-350 erstreckt (Abbildung 4-19, B).

Durch das Fehlen dieser Domäne (270-350) in allen hier untersuchten Fragmenten kann eine Beteiligung der Multimerisierungsdomäne bei der Generierung der großen Nukleoproteinkomplexe ausgeschlossen werden.

Abbildung 4-19 EMSAs mit wt-His-DEK und verschiedenen DEK Deletionsmutanten

A. 0,5 pmol linearisierte SV40-DNA wurde mit je 9, 28, und 46 pmol der dephosphorylierten DEK-Fragmente (Spuren 2-4; 5-7; 8-10; 11-13) oder ohne (Spur 1) für 1 h bei 37°C inkubiert. Die Nukleoprotein-Komplexe wurden auf 0.6 % Agarosegele 175 ng in 0.5 x TBE aufgetrennt und durch EtBr-Färbung sichtbar gemacht. Das jeweilige Fragment ist angegeben.

B. Schematische Darstellung des DEK Proteins. Das DNA-bindende Fragment (87-187) und die Multimerisierungsdomäne sind dargestellt (270-350).

4.4.5 Das SAF-Box-Fragment (87-187) ist für die Topologieveränderung verantwortlich

Bisher wurde gezeigt, dass 87-187 das SAF-Box beinhaltende Fragment die DNA Bindung vermittelt. Nun stellt sich die Frage, welcher Bereich des DEK-Proteins für die Topologieveränderung notwendig ist. Dazu wurden die verschiedenen Deletionsmutanten in einen Topologieassay (DEK-Assay) eingesetzt. Das wtDEK-Protein zeigt die bekannte Topologieveränderung (Abbildung 4-20, wt, Spur 2-4). Durch Teilung des wt-Proteins in den Bereich von 1-187 und 187-375 ist zu erkennen, dass die topologieverändernde Aktivität auf dem Fragment 1-187 lokalisiert ist (1-187, Spur 6-8). Testet man nun das Fragment 87-187, so ist dieses ebenfalls zur Topologieveränderung fähig (87-187, Spur 14-16). Wird dieser Bereich aus dem Gesamtprotein deletiert (∆87-187, Spur 18-20), so geht die topologieverändernde Aktivität verloren. Das DNA-bindende Fragment 87-187 ist folglich auch für die Generierung von Supercoils verantwortlich. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, dass dieses Fragment auch die intermolekulare Wechselwirkung zwischen verschiedenen DNA-Molekülen stimuliert (Kappes et al., 2004). Das Fragment 87-178 ist deshalb für drei funktionelle Aspekte verantwortlich. Erstens für die Vermittlung der DNA-Bindung, zweitens für die Generierung von Supercoils und drittens für die Stimulierung von intermolekularen Wechselwirkungen („end-to-end“-joining von DNA-Molekülen), wobei dieses Fragment keine DNA-Biegung verursacht (Waldmann et al., 2003; Kappes et al., 2004).

Abbildung 4-20 Topologieassay mit verschiedenen DEK-Deletionsmutanten

A. Form I SV40 DNA (10 ng, 0.003 pmol) wurde ohne (-, Spuren 1, 5, 9, 13, 17) oder mit steigenden Mengen der angegebenen DEK Fragmente (Spuren 2-4, 6-8, 10-12, 14-16, 18-20; je 1,8, 2,4 und 3 pmol Protein) in der Anwesenheit von 1unit Topoisomerase I inkubiert. Die einzelnen Proben wurden nach 1 h mittles Proteinase K deproteinisiert, die DNA wurde gefällt und auf einem 0.8 % Agarosegel aufgetrennt. Der Nachweis erfolgte durch Sybr-Gold Färbung.

B. Schematische Darstellung des DEK Proteins mit den bisher identifizierten funktionellen Bereichen.

4.4.6 Identifizierung einer zweiten DNA-Bindedomäne (270-350) des DEK-Proteins

In weiteren Experimenten sollten alle hergestellten DEK-Deletionsmutanten auf deren DNA-Bindung getestet werden. Interessanterweise stellte sich heraus, dass das Fragment 187-375 (Abbildung 4-21, A, Spur 3-4) ebenfalls eine DNA-bindende Aktivität aufweist. Allerdings ist die Art der Bindung anderer Natur als die des 1-187 Fragmentes, denn hier entstehen keine hochmolekularen Komplexe. Bei Deletion der SAF-Box (∆ 87-187, Spur 6-7) zeigte sich das gleiche Bild. Wurde das Fragment 310-375 eingesetzt, sieht man selbst bei der höchsten Menge an Protein keine DNA-Bindung. Im Gegensatz dazu ist das Fragment 270-350 zu einer Bindung fähig. Folglich konnte eine neue, zweite DNA-Bindungsdomäne des DEK-Proteins zwischen den Aminosäuren 270-350 lokalisiert werden. Diese Domäne scheint eine duale Funktion auszuüben, denn dieser Bereich konnte auch als Multimerisierungsdomäne identifiziert werden.

Weiterhin befinden sich in diesem Bereich die meisten kartierten CK2-Phosphorylierungsstellen (4.3.3.4). Um die Multimerisierungsdomäne zu charakterisieren, wurden Far-Western-Studien durchgeführt (Kappes et al., 2004). Diese Experimente wurden mit unbehandeltem wtDEK und Deletionsmutanten durchgeführt. Wie schon in Kapitel 4.2.1 dargestellt, wurden diese Proteine phosphoryliert eingesetzt. Auch die Sonde, das PKA-DEK, stammt aus dem Baculovirus-System und ist deshalb ebenfalls phoshoryliert.

Auf diesen Aspekt der Multimerisierung in Zusammenhang mit der Phosphorylierung wird in Abschnitt 4.5.1 eingegangen.

Abbildung 4-21 EMSA mit C-terminalen DEK Fragmenten

A. 175 ng (0.05 pmol) linearisierte SV40-DNA wurde mit 9, 28 und 46 pmol der angegebenen, dephosphorylierten DEK-Fragmente (Spuren 2-4; 5-7; 8-10; 11-136) oder ohne Protein (Spur 1, input) für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Auftrennung und der Nachweis der DNA-Protein-Komplexe erfolgte auf einem 0.6 % Agarosegel in 0.5 x TBE mit EtBr- Färbung.

B. Schematische Darstellung des DEK-Proteins mit der neu identifizierten zweiten DNA-Bindedomäne.