Biochechemische Charakterisierung von DEK in vivo DEK wurde in früheren Studien als chromatingebundenes Protein identifiziert,

dessen Lokalisierung, Menge und Chromatinbindung keiner zellzyklusspezifischen Schwankung unterliegt (Kappes et al., 2001). Hier sollten im Anschluss an die biochemischen Charakterisierungen die DEK mRNA-Menge, die Neusyntheserate, die Halbwertszeit und die Phosphorylierung von DEK während des Zellzyklus studiert werden.

4.1.1 DEK mRNA während des Zellzyklus

Verschiedene Studien zeigten, dass DEK in stark proliferierenden Zellen und in Krebszellen eine erhöhte Expression aufweist, jedoch war nicht bekannt, ob die Expression innerhalb eines Zellzyklus einer Regulation unterliegt. Diese Fragestellung wurde im Folgenden behandelt.

Zur Ermittlung der DEK-mRNA-Menge während des Zellzyklus wurden HeLa S3-Zellen mittels eines doppelten Thymidinblocks synchronisiert und die Gesamt-mRNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Release gewonnen und mittels reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Um Histon-mRNAs und rRNAs, die den Hauptbestandteil der Gesamt-RNA bilden, zu eliminieren, wurden zum Umschreiben in cDNA oligo-dT Primer verwendet. Dadurch erfolgte die ausschließliche Amplifikation von proteinkodierenden mRNAs mit einem polyA-Ende. Eine Analyse der so gewonnenen c-DNAs durch RealTime-PCR mit DEK-spezifischen Primern erfolgte im Anschluss. Als interne Kontrolle diente β-Aktin, dessen mRNA-Menge zu allen Zeitpunkten im Zellzyklus konstant vorliegt. Die Spezifität der RealTime-PCR für DEK und β-Aktin wurde durch Schmelzpunktanalysen und Agarosegelelektrophorese überprüft (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 4-1 DEK m-RNA während des Zellzyklus

HeLa S3 Zellen wurden mittels eines doppelten Thymidinblocks synchronisiert. Zu den angegebenen Zeiten nach dem Release (0h: G1/S-Phase-Übergang, 3h: frühe S-Phase, 6h: max. S-Phase, 9h:

G2/Mitose, 12h: frühe G1-Phase, 15, 18h : Mitte- und späte G1-Phase, 21h: G1/S-Phase-Übergang) wurde Gesamt-RNA extrahiert und durch reverse Transkiptase in cDNA umgeschrieben. Die cDNA wurde mittels RealTime-PCR quantifiziert (Daten wurden gegen β-Aktin normiert). Gezeigt sind gemittelte Werte aus 2 unabhängigen Experimenten. Die Zellzyklusstadien wurden parallel durch FACS analysiert.

In Abbildung 4-1 ist zu erkennen, dass die DEK-mRNA-Menge zu allen gemessenen Zeitpunkten im Zellzyklus konstant ist. In der G1-Phase ist ein leichter, jedoch nicht signifikanter Anstieg der mRNA-Menge zu beobachten (15 h release).

4.1.2 Neusynthese des DEK-Proteins während des Zellzyklus

Da die mRNA-Menge von DEK keiner oder nur einer geringen zellzyklusabhängigen Schwankung unterliegt, war es in diesem Zusammenhang interessant, die Neusynthese von DEK zu untersuchen. Dafür wurden HeLa S3 Zellen, wie in 4.1.1 beschrieben, synchronisiert und mit [³⁵ S]-Methionin für je drei Stunden vor der Ernte markiert (Abbildung 4-2, Zeitpunkt der Ernte = 3h Markierung). So erreicht man eine Markierung der neusynthetisierten Proteine in diesem Zeitfenster. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet und DEK mittels Immunfällung aus den 450 mM NaCl-Extrakten präzipitiert, wobei die Fällung von DEK aus den einzelnen Proben immer quantitativ war (Daten nicht gezeigt). Die Analyse der gewonnenen Immunkomplexe erfolgte über SDS-PAGE, Autoradiographie und Immunblot (Abbildung 4-2).

Abbildung 4-2 Neusynthese von DEK während des Zellzyklus

HeLa S3 Zellen wurden durch einen doppelten Thymidinblock synchronisiert und vor den angegebenen Zeitpunkten für 3 Stunden mit je 200 µCi [³⁵S]-Methionin markiert. Nach einer Zellfraktionierung wurde DEK mittels monospezifischen, polyklonalen Antikörpern aus dem 450 mM-NaCl-Extrakt gefällt. Die Extrakte der einzelnen Zeitpunkte wurden in ihrem Gesamtproteingehalt angeglichen. Die Immunkomplexe wurden durch Immunblot (DEK) und Autoradiographie (³⁵S) analysiert. Oben sind die Zellzyklus-Phasen angegeben (durch FACS analysiert, Daten nicht gezeigt). IgGHc kennzeichnet die Position der schweren Immunglobulin-Kette. Die erhaltenen Banden wurden mittels eines Densitometrie-Programmes (NIH-Imager) ausgewertet und in einem Balkendiagramm dargestellt (unten), wobei das Verhältnis von Immunblot/Autoradiographie gezeigt ist.

Die Neusynthese von DEK erfolgt während des ganzen Zellzyklus und ist keiner signifikanten Schwankung unterworfen, was mit der mRNA-Menge korreliert (Abbildung 4-1). In den Proben 15, 18 und 21 wurde weniger DEK gefällt, was

auf den Proteinabgleich zurückzuführen ist, denn die Gesamt-DEK-Menge ändert sich innerhalb des Zellzyklus nicht (Kappes et al., 2001).

Diese beiden Beobachtungen (Abbildung 4-1, Abbildung 4-2) zeigen, dass DEK während des ganzen Zellzyklus neu synthetisiert wird. Da es jedoch zu keiner Zunahme oder Akkumulation kommt (Kappes et al., 2001), stellt sich die Frage, wie stabil ein neu synthetisiertes DEK-Molekül in der Zelle ist. Um diesen Punkt näher zu untersuchen, wurden „Pulse-Chase“-Experimente durchgeführt.

4.1.3 Halbwertszeit des DEK-Proteins in vivo

Zur Untersuchung der Halbwertszeit von DEK wurden asynchron wachsende HeLa S3-Zellen für drei Stunden mit radioaktivem [³⁵S]-Methionin markiert („pulse“), dann in Medium mit zehnfachem Überschuss an Methionin entlassen und bis zu 72 Stunden weiter kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet, eine Zellfraktionierung durchgeführt und DEK quantitativ über Immunfällungen aus den 450 mM-NaCl-Extrakten gewonnen. Nach der Analyse der Immunkomplexe durch Autoradiographie und Immunblot wurden die Signale densitometrisch verglichen und als Funktion der Zeit aufgetragen (Abbildung 4-3, unten). Der 0-Wert (nach 3h Markierung) wurde als 100%

gesetzt. Nach 24 h waren noch 47% der anfänglich markierten DEK-Population detektierbar. Daraus lässt sich eine relative Halbwertszeit von 20 h errechnen.

Es scheinen verschiedene DEK-Populationen vorzukommen, da bei 60 h nur noch 12,5 % der DEK Population markiert sein sollten, eine Halbwertszeit von 20 Stunden vorausgesetzt. Tatsächlich sind noch 21 % der DEK Population markiert. Dies könnte ein Hinweis auf die Existenz von verschiedenen DEK-Populationen sein, die vielleicht abhängig von ihrer posttranslationalen Modifikation oder ihren Bindungspartnern verschieden schnell abgebaut werden.

Abbildung 4-3 Halbwertszeit von zellulärem DEK

A. Asynchron wachsende HeLa S3 Zellen wurden für drei Stunden mit 200 µCi [³⁵S]-Methionin markiert („pulse“). Die Zellen wurden anschließend in Medium mit einem 10-fachen Überschuss an Methionin kultiviert („chase“) und zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet. Nach einer Zellfraktionierung und Abgleich der Proteinmengen wurde DEK mittels monospezifischen, polyklonalen Antikörpern aus dem 450 mM-NaCl-Extrakt gefällt. Die Immunkomplexe wurden durch Immunblot und Autoradiographie analysiert. IgGHc kennzeichnet die Position der schweren Immunglobulin-Kette. Als Kontrolle wurde HeLa S3-Extrakt aufgetragen.

B. Die erhaltenen Banden wurden densitometrisch (NIH-Image) ausgewertet und in einem Diagramm als Zeitfunktion aufgetragen Dargestellt ist das Verhältnis von Immunoblot zu Autoradiographie. Die Position eines Proteinstandards ist in kDa angegeben.

4.1.4 DEK wird während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert

Da weder die Lokalisierung noch die Neusynthese von DEK zellzyklusabhängig sind, sollten im Folgenden posttranslationale Modifikationen von DEK untersucht werden. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass transient exprimiertes DEK in vivo phosphoryliert werden kann (Fornerod et al., 1995), allerdings wurde die DEK-Phosphorylierung bisher nicht näher charakterisiert.

So sollte hier die Phosphorylierung von endogenem DEK während des Zellzyklus untersucht werden. Dafür wurden HeLa S3-Zellen synchronisiert und nach dem Entlassen aus dem Thymidinblock für je zwei Stunden mit [³² P]-Orthophosphat markiert. Nach einer Zellfraktionierung der einzelnen Ansätze erfolgte die quantitative Fällung von DEK aus den 450 mM-NaCl-Extrakten

mittels DEK-spezifischen Antikörpern. Die Immunkomplexe wurden anschließend durch SDS-PAGE, Autoradiographie und Immunblot analysiert.

Um die Zellzyklusphasen zu kontrollieren, wurden parallel zu der Markierung HeLa S3-Zellen, die gleich behandelt wurden, für die FACS-Analyse präpariert (Abbildung 4-4, oben). In Abbildung 4-4, A ist zu erkennen, dass im ganzen Zellzyklus radioaktives [³²P]-Orthophosphat in DEK inkorporiert wurde (³²P). Ein Vergleich von Immunblot (α-DEK) und Autoradiographie (³²P) zeigt, dass die Phosphorylierung von DEK in der G1-Phase ihr Maximum erreicht (unteres Balkendiagramm). Eine Behandlung der gefällten Immunkomplexe mit λ-Phosphatase (eine Serin/Threonin spezifische Protein-λ-Phosphatase) führte zu einem Verlust der radioaktiven Markierung (Abbildung 4-4, B). Infolgedessen muss es sich bei den in vivo Phosphoakzeptorstellen von DEK um Serine oder Threonine handeln (siehe dazu Kapitel 4.3.3).

Abbildung 4-4 Phosphorylierung von DEK in vivo

A. HeLa S3-Zellen wurden durch einen doppelten Thymidinblock synchronisiert und für zwei h mit 200 µCi [³²P]-Orthophosphat markiert. Angegeben ist der Zeitpunkt der Ernte. Die Zellen wurden fraktioniert und die Kerne mit 450 mM NaCl extrahiert. Aus den verschiedenen Extrakten wurde DEK mittels monospezifischer Antikörper präzipitiert. Die Immunkomplexe wurden durch SDS-PAGE, Immunblot (α-DEK) und Autoradiographie (³²P) analysiert. IgGHc kennzeichnet die schwere Kette des Antikörpers. Die Intensitäten der Autoradiographiesignale und des Immunblots wurden densitometrisch vermessen (NIH-Image) und als relative Phosphorylierung in einem Diagramm dargestellt (A, unten).

B. Die Immunkomplexe des 14 h-Wertes (A) wurden für 30 min bei 37°C mit λ-Phosphatase behandelt. Der Immunblot wurde mit monoklonalen DEK Antikörpern (unten) durchgeführt. Die Autoradiographie ist oben dargestellt.

Im weiteren Verlauf dieser Arbeit sollte die DEK-Phosphorylierung näher charakterisiert werden. Für dieses Vorhaben wurde rekombinantes Wildtyp (wt)DEK benötigt.

4.2 Expression, Reinigung und Charakterisierung von