DEK wird durch die Protein-Kinase CK2 in vitro und in vivo phosphoryliert

Im folgenden Kapitel werden die potenziellen DEK-Kinasen in vitro auf ihre DEK-phosphorylierende Aktivität hin getestet.

4.3.3.1 Filter-Bindungsassays mit gereinigten Kinasen

Die drei möglichen Proteinkinasen wurden in Standard-Filterbindungsassays untersucht. Zu diesem Zweck wurde rekombinantes His-DEK dephosphoryliert und mit gleichen Mengen an CK2, PKC und GSK-3 (jeweils gleiche units) in der Anwesenheit von [³²P]γ-ATP inkubiert. Nach verschiedenen Zeitpunkten wurden die Reaktionen gestoppt und die Ansätze auf Nitrocellulosefilter überführt und ausgewertet. In Abbildung 4-9, A ist zu sehen, dass CK2 die stärkste DEK-phosphorylierende Aktivität aufweist (A, CK2). PKC kann DEK auch phosphorylieren, allerdings mit einer wesentlich geringeren Effizienz (A, PKC). 3 dagegen, zeigt keine DEK-phosphorylierende Aktivität (A, GSK-3). Um eine unspezifische Adhäsion von [³²P]γ-ATP an die Membran auszuschließen, wurden die Ansätze parallel über SDS-PAGE aufgetrennt. In Abbildung 4-9, B ist zu sehen, dass es sich tatsächlich um eine spezifische DEK-Phosphorylierung handelt (vergleiche Autoradiographie (³²P) mit Immunoblot (α-DEK)), denn es wurden keine weiteren Signale in der Autoradiographie detektiert. Dies schließt auch eine Autophosphorylierung der Kinasen selbst aus.

Abbildung 4-9 Filterbindungs-Assay mit gereinigten Kinasen

A. Dephosphoryliertes, rekombinantes His-DEK (5 pmol) wurde mit den gereinigten Kinasen (CK2, PKC, GSK-3, je 10 units) in der Anwesenheit von [³²P]γ-ATP für 0, 10 oder 30 min bei 30°C inkubiert. Für die jeweiligen Kinasen wurde der geeignete Puffer (siehe Material und Methoden 3.12) verwendet. Einzelne Aliquote wurden nach den angegebenen Zeitpunkten entnommen und in Na-Pyrophosphat Puffer (5 ml) überführt, um die Reaktion zu stoppen. Die Proben wurden durch Nitrocellulose-Filter filtriert, mit definierten Mengen an Na-Pyrophosphat Puffer gewaschen, getrocknet und in einem Szintilationszähler vermessen. Dargestellt sind die cpm (counts per minutes x 10 ⁴).

B. Aliquote aus dem Ansatz in A (10 min Wert) wurden parallel auf einem SDS-Polyacrylamidgel (10

%) aufgetrennt und durch Immunblotting und Autoradiographie analysiert.

Mit den Filterbindungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass hauptsächlich gereinigte CK2 und in geringem Maße auch gereinigte PKC an der DEK-Phosphorylierung in vitro beteiligt sind.

4.3.3.2 „In-Gel-Kinaseassay“

Im Folgenden sollte festgestellt werden, ob diese beiden Kinasen für die beobachtete DEK-Phosphorylierung mit Zellextrakt (Abbildung 4-7) verantwortlich sind. Hierfür wurde ein „In-Gel-Kinaseassay“ durchgeführt. Der Vorteil dieser Methode ist, dass man das zu phosphorylierende Protein kovalent an eine Gelmatrix koppelt und anhand der Proteingrößen und der Signale in der Autoradiographie die phosphorylierende(n) Kinase(n) ermitteln kann (z. B (Liu et al., 1997), (Hibi et al., 1993). Das mit rekombinantem, dephosphorylierten His-DEK kovalent gekoppelte Gel wurde mit steigenden Mengen S-20-Extrakt von asynchronen HeLa S3 Zellen und mit je 10 units der gereinigten CK2, PKC und GSK-3 beladen. Nach einer Standard-Gelelektrophorese wurde das Gel, wie in Kapitel 3.11 beschrieben, weiter behandelt. Die Analyse erfolgte durch Comassie-Färbung (Abbildung 4-10, links) und durch Autoradiographie (Abbildung 4-10, rechts).

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Abbildung 4-10 „In-Gel-Kinaseassay“

Rekombinantes, dephosphoryliertes His-DEK wurde vor dem Gießen des Gels der Gelmatrix beigemischt (40µg/ml Gelmatrix). Nach dem Auspolymerisieren wurden 5, 10 und 20 µg Gesamtprotein (S-20 Extrakt aus asynchronen HeLa S3 Zellen) und je 10 units von gereinigter CK2, PKC und GSK-3 auf diesem Gel unter Standardbedingungen aufgetrennt. Nach dem Lauf wurde das SDS entfernt, die Proteine erneut denaturiert (6 M Guanidinium-HCl) und über Nacht renaturiert. Dieser erneute Denaturierungsschritt ist zwingend notwendig um die Aktivität der Kinasen wieder herzustellen (Geahlen et al., 1986), (Lacks and Springhorn, 1980), (Kameshita and Fujisawa, 1989). Nach erfolgter Inkubation in Kinasepuffer in der Anwesenheit von [³²P]γ-ATP wurde das Gel gewaschen, Comassie gefärbt (linke Seite) und getrocknet.

Die Analyse erfolgte durch Autoradiographie (rechte Seite). Die Positionen der gereinigten Kinasen sind mit Punkten gekennzeichnet (links). Die Untereinheiten der CK2 sind durch Sternchen gekennzeichnet (*, α-Untereinheit, ** α`-Untereinheit). Die Position eines Proteinstandards ist in kDa angegeben.

In den S-20 Extrakten (Abbildung 4-10, extract, rechte Seite) tritt deutlich eine Kinase-Aktivität hervor, die der CK2 zuzuordnen ist. Die geringere Mobilität der CK2 in den Extrakten im Vergleich zu gereinigter CK2, lässt sich auf eine limitierte Proteolyse der α-Untereinheit vom C-Terminus zurückführen (α-UE oben*, α`-UE unten**). Das Laufverhalten dieser deletierten α-UE ist ähnlich dem der α`-UE und wurde für die hier verwendete gereinigte CK2 beschrieben (Sarno et al., 2002). Die Proteolyse hat keinen Einfluss auf die Aktivität (Sarno et al., 2002). Darüber hinaus konnte noch eine zweite, schwächere Kinaseaktivität bei 94 kDa detektiert werden, die wahrscheinlich auf die PKC zurückzuführen ist (Abbildung 4-10, <). Es gibt verschiedene Isoformen der PKC, die sich durch Ca²⁺-Abhängigkeit, strukturelle Eigenschaften und Molekulargewicht (80-97 kDa) unterscheiden (PKC Isoformen: α, β1, β1, γ , δ, ε, η, θ, µ, ξ, λ, ι). Hier scheinen mehrere PKC-Isoformen DEK zu phosphorylieren, wovon eine PKCε sein könnte, da sie bei 97 kDa läuft. Die Kontrolle mit gereinigter PKC weist allerdings keine Aktivität auf. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass sie, wie schon gezeigt, DEK nur schwach phosphoryliert (Abbildung 4-9, PKC) oder dass die DEK-phosphorylierenden PKC-Isoformen hier nicht vorhanden sind. Denn die gereinigte PKC besteht aus einer Mischung von α, β, und γ Isoformen.

Die verwendeten S-20-Extrakte bestehen aus cytosolischen und nukleosolischen Proteinen. Um auszuschließen, dass weitere, chromatingebundene Kinasen für die DEK-Phosphorylierung verantwortlich sind, wurden die Pellets der S-20 Präparationen mit 500 mM NaCl nachextrahiert. Mit diesen Extrakten wurde das Experiment wiederholt (Daten nicht gezeigt). Es konnten keine weiteren Signale wie die in Abbildung 4-10 detektiert werden. In einer weiteren Kontrolle, die dazu diente, Artefakte durch Autophosphorylierungen der Kinasen auszuschließen, wurde das Experiment wiederholt, diesmal ohne kovalent gekoppeltes DEK in der Matrix. Selbst nach längerer Exposition waren keine signifikanten Signale in der Autoradiographie zu erkennen (Daten nicht gezeigt).

Aus diesem Experiment lässt sich schließen, dass die im S-20-Extrakt enthaltene Protein-Kinase CK2 DEK phosphoryliert. Des Weiteren könnten noch verschiedene Isoformen der PKC an der DEK-Phosphorylierung beteiligt sein. Die CK2 allerdings weist eine weitaus höhere Aktivität auf.

4.3.3.3 Inhibition der DEK-Phosphorylierung mit TBB, einem hoch spezifischen CK2-Inhibitor

In allen bisherigen Experimenten zeigte die CK2 starke DEK-phosphorylierende Aktivität. Um weitere Hinweise über die CK2-abhängige DEK-Phosphorylierung zu bekommen, wurde ein hoch spezifischer CK2-Inhibitor, 4,5,6,7 tetra-bromo-benzotriazol (TBB), eingesetzt. TBB wurde in der Arbeitsgruppe von Lorenzo A.

Pinna (Universität Padua, Italien) entwickelt und charakterisiert.

Selektivitätsstudien zu TBB zeigten, dass es bei quantitativer Hemmung der CK2 nur bei drei weiteren Kinasen zu einer leichten Inhibierung führt. TBB ist der zur Zeit selektivste CK2-Inhibitor (Sarno et al., 2001). Darüberhinaus ist TBB membrangängig und kann daher auch für in vivo Experimente verwendet werden (Sarno et al., 2001), (Ruzzene et al., 2002). Ein weiterer Vorteil ist, dass TBB bei kurzfristiger Inkubation (bis 5h) in der Zellkultur keine Auswirkung auf die Zellviabilität hat (Ruzzene et al., 2002).

Zuerst wurde die TBB-Menge, die zur quantitativen Hemmung der CK2 Aktivität nötig ist, ermittelt. Dazu wurden in Vorversuchen Filterbindungen mit gereinigter CK2, dephosphoryliertem His-DEK und steigenden Mengen TBB durchgeführt (Daten nicht gezeigt).

Zur quantitativen Hemmung der DEK Phosphorylierung in vitro waren 10 µM TBB nötig (Abbildung 4-11, A: DEK-CK2; DEK-CK2-TBB). Die Autophosphorylierung der CK2 war in diesen Ansätzen vernachlässigbar (Abbildung 4-11, A: CK2-CK2). Als Kontrolle für die Spezifität wurden die Phosphorylierungsansätze parallel über SDS-PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie und Immunblot analysiert (Abbildung 4-11, B). Es waren keine anderen markierten Produkte außer DEK zu sehen, was gegen eine unspezifische Adhäsion von [³²P]γ-ATP an die Membran spricht.

Abbildung 4-11 Filterbindungs-Assay und Inhibition der CK2 durch TBB

A. Dephosphoryliertes rekombinantes His-DEK wurde mit gereinigter CK2 in der Anwesenheit von [³²P] γ-ATP inkubiert. Ein Ansatz wurde mit 10 µM TBB vorinkubiert. Als Kontrolle diente ein Ansatz mit CK2 alleine. Aliquote wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen, in Na-Pyrophosphat abgestoppt und auf Nitrocellulosefilter transferiert. Nach dem Waschen und Trocknen der Filter wurden diese in Szintillationszähler vermessen. Dargestellt sind die cpm (counts per minute).

B. Die Ansätze von A wurden parallel über SDS-PAGE, Autoradiographie (³²P) Imunblot (α-DEK) analysiert

Da TBB zur Hemmung der CK2 und damit auch zur Hemmung der DEK-Phosphorylierung geeignet ist, sollte nun TBB in vitro und in vivo getestet werden. Dazu wurde wie in Kapitel 4.3.1 eine in vitro Phosphorylierung mit Zellextrakten aus S- und G1-Phase HeLa S3-Zellen verwendet (Abbildung 4-12, A). Vor der Phosphorylierungsreaktion wurden steigende Mengen an TBB zum Extrakt gegeben und für 10 min auf Eis vorinkubiert. Die Reaktion wurde nach 10 min gestoppt und das rekombinante His-DEK über Ni-NTA-Agarose

aufgereinigt. Die Analyse erfolgte über SDS-PAGE, Immunblot und Autoradiographie. Es zeigte sich, dass in S-Phase-Extrakt 5 µM TBB für eine vollständige Hemmung ausreichen (Abbildung 4-12, A, S), wohingegen 20 µM TBB in G1-Phase-Extrakt benötigt wurde (Abbildung 4-12, A, G1).

Die Beteiligung der CK2 an der DEK-Phosphorylierung in vivo sollte im nächsten Schritt durch den Einsatz von TBB in der Zellkultur untersucht werden. Asynchron wachsende HeLa S3-Zellen wurden für drei Stunden mit steigenden Mengen TBB in der Anwesenheit von [³²P]-Orthophosphat inkubiert.

Die Zellen wurden geerntet und aus der Chromatinfraktion eine Immunfällung mit DEK-spezifischen Antikörpern durchgeführt. Die Analyse der Immunkomplexe erfolgte durch Immunblot und Autoradiographie (Abbildung 4-12, B). Es ist deutlich zu sehen, dass mit steigenden Mengen TBB die DEK-Phosphorylierung in vivo signifikant abnimmt. Bei der höchsten TBB-Menge (Abbildung 4-12, B, Spur 75) liegt die Restphosphorylierung von DEK bei etwa 20 % im Vergleich zur Kontrolle. Die verbleibende Phosphorylierung kann möglicherweise durch andere Kinasen, wie z. B PKC, verursacht werden.

Dieses Experiment zeigt eindeutig, dass die CK2 in vivo die dominierende Kinase für die DEK-Phosphorylierung ist.

Abbildung 4-12 Inhibition der DEK-Phosphorylierung durch Einstz von TBB in vitro und in vivo A. In vitro Phosphorylierung. Rekombinantes, dephosphoryliertes His-DEK (600 ng, 12.7 pmol)

wurde in S-20 HeLa S3 Extrakt (150 µg Gesamtprotein je aus G- und S-Phase Zellen, siehe Abbildung 4-7) in der Anwesenheit von [³²P] γ-ATP, Protease und Phosphataseinhibitoren und steigenden Mengen an TBB (0,5 –20 µM, gelöst in DMSO) für 10 min bei 30°C inkubiert. Die Extrakte wurden 10 min vor Reaktionsstart (= Zugabe von DEK und [³²P] γ-ATP) mit TBB auf Eis vorinkubiert. Als Kontrolle wurde DMSO (Spur DMSO) verwendet. Spur „control“ ist ohne Extrakt.

Die Reaktionen wurden gestoppt, und DEK wurde über Ni-NTA-Agarose aus den einzelnen Reaktionen gereinigt. Die Analyse erfolgte über SDS-PAGE, Immunblot (α-DEK) und Autoradiographie (³²P). Die Größe eines Proteinstandards ist in kDa angegeben.

B. In vivo Phosphorylierung. Asynchron proliferierende HeLa S3 Zellen wurden mit den angegebenen TBB Mengen für eine Stunde in phosphatfreiem Medium vorinkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit TBB und 200 µCi[³²P]-Orthophosphat für weitere zwei Stunden inkubiert. DEK wurde aus dem 450 mM-NaCl-Extrakt mittels monospezifischen, polyklonalen Antikörpern gefällt. Die Immunkomplexe wurden durch SDS-PAGE, Immunblot (α-DEK) und Autoradiographie (³²P) analysiert.

Alle bisherigen Experimente erbrachten eindeutige Evidenz dafür, dass die CK2 die Hauptkinase für die DEK-Phosphorylierung in vitro und in vivo ist. Hier soll festgehalten werden, dass dieser Befund eine Phosphorylierung durch andere Kinasen, wie z.B die PKC, nicht ausschließt.

4.3.3.4 Kartierung der CK2-Phosphorylierungsstellen in der DEK-Aminosäuresequenz

Im nächsten Schritt sollten die CK2-Phosphoakzeptorstellen im DEK-Molekül identifiziert werden. Dafür wurde rekombinantes His-DEK verwendet. Zuerst wurde gereinigtes His-DEK, das wie in Kapitel 4.2.1 beschrieben, hyperphosphoryliert ist, mittels λ-Phosphatase dephosphoryliert, dann mit gereinigter CK2 in vitro wieder aufphosphoryliert. Beide DEK-Präparationen wurden durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) in einem Quadrupol-Massenspektrometer auf phosphorylierte Aminosäuren hin untersucht. Die Arbeiten wurden von Catalina Damoc in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Przybylski, Universität Konstanz, durchgeführt. Die verwendete Methode erlaubt eine sofortige Sequenzierung der identifizierten phosphorylierten Peptide, ermöglicht also eine genaue Aussage über die phosphorylierte Aminosäure in einer Peptidkette.

Durch CK2-phosphoryliertes DEK wies folgende phosphorylierte Aminosäuren auf: S-32, S-243, S-244, S-251, S-301, S-303, S-306 und S-307. S-230, S-231 und S-232 wurden nur teilweise phosphoryliert vorgefunden und konnten deshalb nicht eindeutig identifiziert werden (Abbildung 4-13).

Interessanterweise liegen, außer S-32, alle ermittelten CK2-Phosphorylierungsstellen im C-terminalen Bereich von DEK. Es wurden auch einige Phosphorylierungsstellen gefunden, die gegenüber einer Dephosphorylierung resistent sind und dem Baculovirus-System entstammen.

Diese Phosphatreste üben allerdings keinen erkennbaren Effekt auf DNA-Bindung und Topologieveränderung aus (siehe dazu: 4.4.1 und 4.4.2). In weiteren Experimenten sollte nun der Phosphorylierungsstatus von endogenem DEK untersucht werden. Hierzu erfolgte ein tryptischer Verdau von immungefälltem DEK aus asynchron proliferierenden HeLa S3-Zellen.

Phosphopeptide wurden über IMAC (ion metal affinity chromatography) angereichert und massenspektrometrisch bestimmt. In vorläufigen Experimenten, die durch Martina Baack und Catalina Damoc durchgeführt wurden, zeigte sich eindeutig, dass Phosphopeptide identifiziert wurden, die mit den in vitro kartierten CK2-Stellen überlappen. Es wurden weiterhin noch andere Phosphopeptide gefunden (Abbildung 4-13).

Abbildung 4-13 Kartierung von CK2-Phosphorylierungsstellen durch ESI-MS

Identifizierte Phosphorylierungstellen des DEK-Proteins. Rekombinantes His-DEK wurde mittels λ-Phosphatase dephosphoryliert und mit gereinigter CK2 in vitro aufphosphoryliert. Phosphorylierungsstellen wurden durch nano-ESI-Q-Trap Messungen identifiziert. Gezeigt ist die Aminosäuresequenz des DEK-Proteins. Die potenzielle DNA-Bindedomäne SAF-Box ist grün, die sauren Boxen sind rot umrandet. Die potenziellen Phosphorylierungsstellen sind angegeben. Die Phosphatase-resistenten Stellen sind in grau, die kartierten CK2 Phosphorylierungsstellen sind in rot eingezeichnet. Phosphopetide, die in immungefälltem DEK in vivo gefunden wurden, sind schwarz unterstrichen.

Abbildung 4-14 zeigt die identifizierten Peptide und die Gesamtabdeckung zum Versuch in Abbildung 4-13. Aufgeführt sind die identifizierten Peptide und die kartierten Stellen des in vitro Versuches mit CK2-phosphoryliertem DEK.

A.

B.

C.

Phosphorylated peptides identified with nano-ESI-Q-Trap phosphorylated sites identified after fragmentation of the peptides

phosphatese treatment

30EESEEEEDEDDEEEEEEEKEK^{51 32}S dephosphorylation

159SICEVLDLER^{168 159}S ^resistant

199TCSKGSKKER^{208 199}T, ²⁰¹S, ²⁰⁴S ^resistant

241EESSDDEDKESEEEPPKKTAKR^{262 243}S, ²⁴⁴S, ²⁵¹S dephosphorylation 279SANVKKADSSTTK^{291 287}S, ²⁸⁸S, ²⁸⁹T, ²⁹⁰T ^resistant

293NQNSSKK^{299 296}S ^resistant

299KESESEDSSDDEPLIKK^{315 301}S, ³⁰³S, ³⁰⁶S, ³⁰⁷S dephosphorylation

Abbildung 4-14 Identifizierte Peptide und Gesamtabdeckung

A. Sequenzabdeckung des DEK Proteins nach in vitro Phosphorylierung mit gereinigter CK2 und Messung durch nano-ESI-Q-TRAP Massenspektroskopie. Phosphoryliert vorgefundene Peptide sind mit schwarzen Boxen gekennzeichnet. Unphosphoryliert vorgefundene Peptide sind in rot gekennzeichnet. Die Sequenzabdeckung dieser Peptide liegt bei 33 % des Gesamtproteins.

Wurden phosphorylierte und an Methioninen oxidierte Peptide in die Abdeckung eingerechnet, so lag diese bei 99 % des Gesamtproteins.

B. Sequenzabdeckung des DEK Proteins nach Dephosphorylierung mit λ-Phosphatase und Messung durch nano-ESI-Q-TRAP Massenspektroskopie. Die dephosphorylierten Peptide, die vorher phosphoryliert vergefunden wurden, sind in gestrichelten Boxen dargestellt. Mit Berücksichtigung der neu identifizierten dephosphorylierten Peptide, stieg die Gesamtabdeckung auf 45 %. Die vorgefundenen phosphorylierten Peptide, die resistent gegenüber der Dephosphorylierung waren, sind in roten Boxen dargestellt. Die Gesamtabdeckung stieg auf 70

%, wenn phosporylierte und an Methioninen oxidierte Peptide miteingerechnet wurden.

C. Darstellung der gefundenen phosphorylierten Peptide mit den vergefundenen phosphorylierten Aminosäuren.