DEK ist nur phosphoryliert auf Hancock-Chromatin zu finden

Nun sollte die DEK-Chromatin-Assoziation mit einer anderen Methode untersucht werden. Dafür wurde sogenanntes „Hancock-Chromatin“ hergestellt (Hancock, 1974). Diese Methode beruht auf der salzfreien Gewinnung von Zellkernen und schlussendlich von Chromatinkörperchen (chromatin bodies, Abbildung 4-32, A). Während der Präparation kommt es zu einer Größenzunahme der Kerne (bis zum Zehnfachen). Dadurch sind die Chromatinfasern einem erheblichen Torsionsstress unterworfen.

Erstaunlicherweise war nur ein sehr geringer Teil von DEK mit den Chromatinkörperchen aus asynchron proliferierenden Hela S3-Zellen assoziiert (Abbildung 4-32, C, DMSO, chromatin bodies, α-DEK). Der Hauptteil befand sich in den löslichen Fraktionen (S1, S2). Im Gegensatz dazu verhält sich MCM3 wie in der Literatur beschrieben (z. B. (Ritzi et al., 1998), (Richter et al., 1998). Eine Erklärung hierfür könnte die Präparationsmethode sein. In einem Szenario, in dem dephosphoryliertes DEK durch seine beiden DNA-Bindedomänen, an verschiedene Chromatinfasern oder Bereiche bindet, wäre es möglich, dass DEK durch den Torsionsstress während der Präparation vom Chromatin „abgesprengt“ wird. Dieser Effekt müsste sich noch verstärken, wenn die Phosphorylierung von DEK durch den Einsatz von TBB unterdrückt werden würde. Daher wurden die Zellen vor der Chromatinpräparation für drei Stunden mit TBB behandelt. Tatsächlich reduziert sich die chromatingebundene DEK-Population (Abbildung 4-32, C, chromatin bodies, TBB, α-DEK), wohingegen MCM3 von dieser Behandlung unbeeinflusst bleibt (C, chromatin bodies, TBB, α-MCM3).

Durch diese Methode konnte gezeigt werden, dass die CK2-Phosphorylierung die Art der DEK-Bindung an Chromatin modelliert. Jedoch muss hier angeführt werden, dass dies auch ein elektrostatischer Effekt sein könnte. Durch das salzfreie Milieu sind die sauren Boxen des DEK-Proteins negativ geladen, und es könnte so zu einer Ablösung von Chromatin kommen. Dennoch bestätigt dies die vorherigen Daten, dass die CK2-Phosphorylierung die Art der DEK-DNA-Bindung modelliert.

Abbildung 4-32 Hancock-Chromatin-Präparation

Asynchrone HeLa S3-Zellen wurden für drei Stunden mit 50 µM TBB oder einer gleichen Menge an DMSO behandelt. Die Zellkerne wurden nun durch eine Inkubation in einem salzfreien Puffer gewonnen. Der Überstand stellt das Cytosol dar (S1). Anschließend wurden die Kerne mit NP-40 behandelt, um Reste der Kernmembran zu entfernen (S2). Nach zwei Zentrifugationen über ein Sucrosekissen erhielt man die Chromatin-Körperchen (chromatin-bodies). Diese wurden durch Lichtmikroskopie und Hoechst-Färbung auf ihre Qualität hin überprüft (A). Der DNA Gehalt wurde bestimmt. 5, 10 und 20 µg DNA und die entsprechenden Aliquote von S1 und S2 wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Membran transferiert und mit Poinceau gefärbt (B). Die Analyse des selben Blots erfolgte durch Western-Blot mit DEK und MCM3 spezifischen Antikörpern (α-DEK, α-MCM3).

5 Diskussion

Das DEK-Protein ist mit 4-6 x10⁶ Kopien/HeLa-Zellkern ein sehr häufiges, chromatinassoziiertes Protein höherer Eukaryoten, das in den letzten Dekaden der Chromatinforschung nur wenig Beachtung erfahren hat. Die genaue Funktion von DEK ist bisher weitgehend unbekannt. Jedoch wurde es seit der Entdeckung, 1992, als potenzielles Protoonkogen mit verschiedenen funktionellen Aspekten in Zusammenhang gebracht, wovon einige Beobachtungen mittlerweile an Gültigkeit verloren haben.

So ist z.B. die Assoziation von DEK mit dem EJC-Komplex und die damit postulierte Rolle in post-Spleißprozessen auf eine Kreuzreaktion des verwendeten Antikörpers zurückzuführen und dadurch nicht mehr haltbar (Le Hir et al., 2000; McGarvey et al., 2000; Le Hir et al., 2001; Lykke-Andersen et al., 2001; Devany et al., 2004; Scholten, 2004). Jedoch wurde in Experimenten, unabhängig von diesem Antikörper, eine RNA-assoziierte DEK-Population identifiziert, deren Funktion noch nicht geklärt ist (Kappes et al., 2001).

Die Rolle von DEK in der DNA-Reparatur, wie von Meyn et al. (1993) postuliert, konnte in Experimenten in unserem Labor nicht gefunden werden (Meyn et al., 1993a; Scholten, 2004).

Auch eine sequenzspezifische DNA-Bindung von DEK an die pets-site oder die Y-Box, wie von der Markovitz-Gruppe (Fu and Markovitz, 1996; Fu et al., 1997;

Adams et al., 2003) beschrieben, konnte bisher weder in unserem Labor noch in dem Labor von G. Grosveld (Grosveld, 2002) weiter bestätigt werden. Im Gegensatz dazu zeigten Waldmann et al. (2003), dass DEK eher strukturspezifisch als sequenzspezifisch an DNA bindet, da eine bevorzugte Bindung an kruziform und supergecoilte DNA-Formen beobachtet wurde. Diese Art der Bindung ist eine Eigenschaft die von Architekturproteinen erfüllt wird (Zlatanova and van Holde, 1998). Viele dieser Proteine, wie z.B die HMG-Proteine, spielen neben der Funktion in der Zellkernarchitektur auch eine Rolle in der Transkription (siehe Kapitel 1.3.2). Auch für DEK wurde eine noch unbekannte Rolle bei der Transkriptionsregulation postuliert, wobei die beiden Beobachtungen von Hollenbach et al. (2002) und Campillos et al. (2003) unterschiedliche Funktionsweisen für DEK postulieren.

Eine Beobachtung, die von meherern Autoren gemacht wurde, ist die Überexpression von DEK in malignen Zellen, und eine damit einhergehende klinische Relevanz als potenzieller Tumormarker. Die Mechanismen, die der unterschiedlichen DEK-Expression zu Grunde liegen, sind bisher jedoch noch nicht verstanden.

5.1 DEK-mRNA, DEK-Neusynthese und Halbwertszeit von DEK in HeLa Zellen

Neben der Überexpression von DEK in malignen Zellen konnte jedoch gezeigt werden, dass innerhalb des HeLa-Zellzyklus die DEK-Protein-Menge keiner Schwankung unterliegt (Kappes et al., 2001). Um diesen Befund zu erweitern, wurden in dieser Arbeit weitere Studien zur DEK-Expression in HeLa-Zellen durchgeführt.

Bei der Untersuchung der DEK-mRNA-Menge während des Zellzyklus konnten in allen Zellzyklusphasen identische DEK-mRNA-Mengen detektiert werden (Abbildung 4-1). Die Neusyntheserate von DEK wurde ebenfalls als konstant vorgefunden (Abbildung 4-2). Die Expression und Neusynthese von DEK in HeLa-Zellen ist demnach keiner offensichtlichen zellzyklusspezifischen Regulation unterworfen und bestätigt weiterhin die Arbeit von Kappes et al.

(2001). Die vorhandenen DEK-Transkripte scheinen gleichmässig translatiert zu werden, denn bisher gibt es keine Hinweise, dass die DEK-mRNA einer speziellen Regulation unterliegt. Dies ist die erste Untersuchung der DEK-Expression während des Zellzyklus. Alle bisherigen Studien verglichen die DEK-Expression zwischen Krebszellen und dem dazugehörigen untransformierten Gewebe auf mRNA-Ebene (Hamaguchi et al., 1998; Kondoh et al., 1999; Kroes et al., 2000; Larramendy et al., 2002; Makita et al., 2002;

Savli et al., 2002; Takahashi et al., 2002; Sanchez-Carbayo et al., 2003;

Daibata et al., 2004; Evans et al., 2004). Diese Studien zeigen alle eine Überexpression von DEK in den untersuchten Krebsarten auf. Jedoch gibt es in diesen Arbeiten auch Hinweise darauf, dass eine veränderte DEK-Expression in nicht-transformierten Zellen in Abhängigkeit zum Proliferationsstatus der Zelle steht. Generell scheint in stark proliferierenden Zellen die DEK-mRNA erhöht zu sein, wohingegen eine Inhibition der Proliferation zu einer Abnahme führt.

Kondoh et al. (1999) konnten in proliferierenden HuH-7 (Leberkarzinomzellen) und HepG2 (Leberzellen)-Zellen eine hohe Präsenz von DEK-Transkripten beobachten. Eine Inhibition der Proliferation durch Serumentzug und durch Kontaktinhibition schlug sich in einer Abnahme der DEK-mRNA-Menge nieder und war in ausdifferenzierten Leberzellen nicht mehr zu detektieren. Durch Na-Butyrat-Behandlung von HuH-7-Zellen, die zu deren Ausdifferenzierung führt, wurde ebenfalls eine Abnahme der DEK-mRNA festgestellt (Kondoh et al., 1999). In einer weiteren Studie von Savli et al. (2002), die die Differenzierung von HL-60-Zellen (AML-Zelllinie) durch ein Vitamin D-Analogon induzierten, konnte ebenfalls eine differenzierungsabhängige Abnahme der DEK-mRNA festgestellt werden (Savli et al., 2002).

Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, bleibt in proliferierenden HeLa-Zellen die DEK-Menge konstant. Im Zusammenhang mit den oben genannten Befunden lässt sich daher eher eine proliferationsspezifische als eine

zellzyklusspezifische Funktion von DEK vermuten. Dies spiegelt sich auch in den Proteinmengen wider, denn ein Vergleich der DEK-Proteinmengen in primären Zellen und deren transformierter Form zeigte eine erhöhte DEK-Menge in den letzteren (Scholten, 2004). Auch in primären menschlichen B-Zellen ist nur ein Drittel der DEK-Menge im Vergleich zu HeLa-B-Zellen vorhanden (H.G. Hu, Persönliche Kommunikation).

Der DEK-Promotor wird potenziell über die Proteine YY1 (Yin Yang 1) und NF-Y (nuclear factor 1) reguliert (Sitwala et al., 2002). Die Beteiligung dieser beiden Transkriptionsfaktoren ist eine mögliche Erklärung für die erhöhte DEK-Expression in malignen Zellen, da beide Faktoren in transformierten Zellen einer unterschiedlichen Expression unterliegen (Sitwala et al., 2002b). Jedoch ist nicht auszuschließen, dass die DEK-Expression auch durch andere Faktoren kontrolliert wird, die durch die vorhandene Transformation der HeLa-Zellen einer unterschiedlichen Regulation unterworfen sind. Daher wäre es interessant auch in primären Zelllinien eine Untersuchung der DEK-Expression während des Zellzyklus durchzuführen.

Die beobachtete DEK-Halbwertszeit von 20 Stunden (Abbildung 4-3) spricht ebenfalls gegen eine zellzyklusspezifische Funktion von DEK, die durch kontrollierte Proteindegradation vermittelt wird. Bisher gibt es keine Hinweise, dass DEK z.B über den Proteasomenweg abgebaut wird. Wurden HeLa-Zellen mit dem Proteasomen-Inhibitor MG-132 behandelt, so konnte keine Akkumulation von DEK beobachtet werde (Daten nicht gezeigt).

In den „Pulse-Chase“-Experimenten zeigte sich, dass der Abbau von DEK bei den 60 und 72 Stunden-Werten nicht der errechneten Halbwertszeit von 20 Stunden entspricht. Dies lässt vermuten, dass es unterschiedlich stabile DEK-Populationen in einer Zelle gibt. DEK ist ein hochmobiles Protein (Scholten, 2004), jedoch konnten sogenannte „DEK-Microdomänen“, die über Minuten hinweg stabil bleiben, ermittelt werden. Dies könnte eine mögliche Erklärung für einen verzögerten Abbau sein, denn DEK könnte je nach Assoziation mit Chromatin (Kappes et al., 2001), RNA (McGarvey et al., 2000; Kappes et al., 2001) und der Kernmatrix (Kappes, 2000) einer unterschiedlichen Stabilität unterliegen.

Für DEK konnte hier weder eine veränderte mRNA-Menge noch eine veränderte Neusynthese und, wie schon früher beschrieben, auch keine veränderte Lokalisation innerhalb eines Zellzyklus gefunden werden (Kappes et al., 2001). Auch ein regulierter Abbau von DEK konnte nicht festgestellt werden.

Diese Daten sind ein Hinweis darauf, dass DEK keine Funktion in der Zellzykluskontrolle hat oder die DEK-Expression selbst Zellzyklus-abhängig kontrolliert wird. Vielmehr scheint DEK in den Ausdifferenzierungs- und Proliferationsstatus einer Zelle involviert zu sein.

5.2 DEK wird während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert