Biochemische Charakterisierung von DEK
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
der Fakultät für Biologie Universität Konstanz
vorgelegt von Tanja Waldmann Konstanz, im Juni 2003
Tag der mündlichen Prüfung: 15. September 2003 Referent: Priv. Doz. Dr. Claudia Gruss
Referent: Prof. Dr. Rolf Knippers
Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht:
Waldmann, T., Eckerich, C., Baack, M. and Gruss, C. (2002). “The ubiquitous chromatin protein DEK alters the structure of DNA by introducing positive supercoils.”
J Biol Chem 277(28): 24988-94
Waldmann, T., Baack, M., Richter, N. and Gruss, C. (2003). “Structure specific binding of the proto-oncogen protein DEK to DNA.” Nucl. Acid Res. 31(21): in press.
Alexiadis, V., Waldmann, T., Andersen, J., Mann, M., Knippers, R. and Gruss, C.
(2000). “The protein encoded by the proto-oncogene DEK changes the topology of chromatin and reduces the efficiency of DNA replication in a chromatin- specific manner.” Genes Dev 14(11): 1308-12
Veröffentlichungen, die in dieser Arbeit nicht berücksichtigt sind:
Vestner, B., Waldmann, T. and Gruss, C. (2000). “Histone octamer dissociation is not required for in vitro replication of simian virus 40 minichromosomes.” J Biol Chem 275(11): 8190-5.
In Vorbereitung:
Waldmann, T., Kappes, F., Scholten, I., Richter, N. and Gruss, C. (2003).“Functional domains of the DEK protein.”
Diese Doktorarbeit wurde an der Universität Konstanz am Lehrstuhl für Molekulare Genetik angefertigt. Herrn Prof. Dr. Knippers möchte ich für die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe danken.
Bei Priv. Doz. Dr. Claudia Gruss-Hegge möchte ich mich bedanken für die Bereitstellung des Themas, die ständige Unterstützung meiner Arbeit, die Durchsicht des Manuskripts und vor allem die gute Zusammenarbeit während der letzten fünf Jahre.
Mein ganz herzlicher Dank gilt meinen Mitstreitern im DEK-Labor Nicole Richter, Ferdinand Kappes, Ingo Scholten und Hong Gang Hu für die endlosen, aber sehr fruchtbaren Diskussionen in der Raucherecke, die ständige Hilfsbereitschaft, die gute Zusammenarbeit bei unserem Mutanten-Projekt, die Durchsicht dieses Manuskripts und nicht zuletzt für die einzigartige freundschaftliche Stimmung im Labor.
Besonders möchte ich an dieser Stelle die großartige Hilfe von Nicole Richter hervorheben. Sie hat mir vor allem im letzten Jahr sehr geholfen, indem sie nahezu alle meine praktischen Arbeiten übernahm und es mir so ermöglichte dieses Manuskript zu schreiben.
Bei Martina Baack möchte ich mich für die elektronenmikroskopischen Analysen in dieser Arbeit bedanken. Sie hat alle Arbeiten am EM durchgeführt und ihr ist es zu verdanken, dass diese Bilder in dieser Qualität jetzt in meiner Doktorarbeit zu bewundern sind. Außerdem bedanke ich mich für ihre unzähligen Tipps und Tricks, die sehr viel zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Sandra Kreitz gilt mein Dank für die kritische Durchsicht des Manuskripts, die vielen hilfreichen Diskussionen und ihre große Hilfsbereitschaft in allen Bereichen.
Thomas Kapitza möchte ich für die Hilfe mit dem Baculovirussystem danken.
Allen ehemaligen und jetzigen technischen Assistenten sei mein Dank ausgesprochen für die vielen scheinbar selbstverständlichen Arbeiten, wie die Bereitstellung der Glaspipetten, den Autoklavendienst und die Organisation der Zellkultur.
Meinem Freund Uwe Brieske möchte ich für seine Unterstützung in allen Lebenslagen danken und natürlich für das Ertragen meiner Launen, wenn´s mal wieder nicht so gut lief. Stefanie Litjens danke ich für den ersten, Josef Blum für den letzten Schliff dieser Arbeit und die korrekte Verteilung meiner Kommas.
Nicht zuletzt möchte ich meinen Eltern danken, die mir dieses Studium ermöglicht haben.
Abkürzungen
A Ampere
ACF Accessibility of chromatin factor
AMP Ampicilin
bp Basenpaare
C Grad Celsius
CA Chloramphenicol
CBP Creb–binding–protein
CHRAC Chromatin accessibility complex
Ci Curie
cpm counts per minute
Da Dalton
DMEM Dulbecco´s modified Eagle medium DNA Desoxyribonucleinsäure
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraacetat
FCS Fötales Kälberserum
g Gramm
GST Glutathion-S-Transferase
h Stunde
Hepes N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-2-Etansulfonsäure HMG High mobility group
IPTG Isoporpylthio-β-glactoside
l Liter
LB Luria Broth Bakterienmedium
M Molar
m Meter
min Minute
NURD Nucleosome remodeling and histone deacetylation NURF Nucleosome remodeling factor
PA Polyacrylamid
PBS phophatgepufferte Salzlösung PCAF p300/CBP associated factor
PNK Polynucleotid Kinase
RNA Ribonukleinsäure
s Sekunden
SAGA Spt-Ada-Gcn5-Acetylase Komplex
SDS Natriumdodecylsulfat
SV40 Simian Virus 40
SWI/SNF Switching/Sucrose-non-fermenting
U units
V Volt
für Maßeinheiten werden als Vorsatz Kurzzeichen verwendet:
k kilo (103)
m milli (10-3)
µ mikro (10-6)
n nano (10-9)
p pico (10-12)
f femto (10-15)
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 DER ZELLKERN 1
1.2 CHROMATIN 2
1.2.1 ORGANISATION DER DNA IM ZELLKERN 2
1.2.2 NUKLEOSOMEN 3
1.2.3 HISTONE 4
1.3 VERÄNDERUNGEN DER CHROMATINSTRUKTUR 5 1.3.1 POSTRANSLATIONALE MODIFIKATIONEN DER HISTONE 6
1.3.2 CHROMATINREMODELING 7
1.3.3 NICHT–HISTON–PROTEINE 9
1.3.3.1 HMGB-Proteine (HMG–1/-2) 10
1.3.3.2 HMGA-Proteine (HMG–I/-Y) 11
1.3.3.3 HMGN-Proteine (HMG-14/-17) 12
1.4 DNA TOPOLOGIE 12
1.4.1 DNA-STRUKTUR IM NUKLEOSOM 14
1.4.2 DNA-TOPOISOMERASEN 15
1.5 DAS PROTOONKOGEN-PROTEIN DEK 15
1.5.1 ALLGEMEIN 15
1.5.2 LOKALISIERUNG UND CHROMATINBINDUNG 16
1.5.3 DEK IM RNA-METABOLISMUS 17
1.5.4 DEK INTERAGIERT MIT LANA 18
1.5.5 DEK UND TRANSKRIPTION 19
1.5.5.1 Daxx als Interaktionspartner 19
1.5.5.2 AP-2α als Interaktionspartner 20
1.5.6 DEK-BINDUNG IM ENHANCER-BEREICH VON HIV-2 20 2 ZIELSETZUNG 22
3 MATERIAL UND METHODEN 23
3.1 ALLGEMEINE LÖSUNGEN 23
3.2 ALLGEMEINE METHODEN 24
3.2.1 DENATURIERENDE POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE 24
3.2.2 SILBER FÄRBUNG 24
3.2.3 COMASSIEFÄRBUNG 25
3.2.4 NATIVE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 25 3.2.5 NEUTRALE AGAROSE GELELEKTROPHORESE 25
3.2.6 RADIOAKTIVE MARKIERUNGEN 25
3.2.6.1 Markierung mit α-32P dATP 25
3.2.6.2 Markierung mir γ-32PATP 25
3.2.7 DNA-FÄLLUNG 26
3.2.8 PROTEINFÄLLUNG NACH WESSEL-FLÜGGE 26
3.2.9 WESTERNBLOT-ANALYSE 26
3.2.10 SOUTHERNBLOT-ANALYSE 27
3.3 ZELLKULTUR 27
3.3.1 CV1-ZELLEN 27
3.3.2 HI-5 ZELLEN UND SF9 ZELLEN 28
3.4 SV40 28
3.4.1 PRÄPARATION VON SV40 DNA 28
3.4.2 PRÄPARATION VON SV40 MINICHROMOSOMEN 28 3.5 HERSTELLUNG VON KURZEN DNA-FRAGMENTEN UND DER 4WJ DNA 29
3.6 STÄMME UND PLASMIDE 30
3.6.1 GST-DEK IM BAKTERIELLEN EXPRESSIONSSYSTEM 30 3.6.2 HIS-DEK IM BACULOVIRUS EXPRESSIONSSYSTEM 30
3.7 DEK 31
3.7.1 REINIGUNG VON GST-DEK 31
3.7.2 REINIGUNG VON HIS-DEK 31
3.8 TOPOLOGIEASSAY 32
3.9 BANDSHIFTASSAY 32
3.10 GLYCERINGRADIENTEN 32
3.11 REINIGUNG VON E. COLI TOPOISOMERASE I 33 3.12 ZWEI-DIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE 33
3.13 ELEKTRONENMIKROSKOPIE 33 3.14 CHROMATINZUSAMMENBAU IM DROSOPHILAEMBRYOEXTRAKT 34
3.15 MIKROKOKKENNUKLEASE-VERDAU 34
3.16 PRÄPARATION DER MONONUKLEOSOMEN 35
3.17 SLIDINGASSAY 35
4 ERGEBNISSE 36
4.1 EXPRESSION UND REINIGUNG VON REKOMBINANTEM DEK 36
4.1.1 GST-DEK 36
4.1.2 HIS-DEK 37
4.2 CHARAKTERISIERUNG DER DEK-DNA-BINDUNG 38
4.2.1 BANDSHIFT-ASSAY 38
4.2.2 TOPOLOGIE-ASSAY 40
4.3 SEQUENZSPEZIFITÄT 40
4.3.1 BANDSHIFT UND TOPOLOGIE-ASSAY MIT ANDEREN DNA-SEQUENZEN 40
4.3.2 BANDSHIFTANALYSE DER PET-SEQUENZ 41
4.4 STRUKTURSPEZIFITÄT 43
4.4.1 BANDSHIFT MIT VERSCHIEDENEN DNA-TOPOISOMEREN 43
4.4.2 BANDSHIFT MIT KREUZFÖRMIGER DNA 44
4.5 KONTROLLEN MIT HIS-DEK 47
4.5.1 BANDSHIFT- UND TOPOLOGIE-ASSAY 47
4.6 MODELL 48
4.6.1 REVERSIBILITÄT 49
4.6.2 EINFÜHRUNG VON POSITIVEN SUPERCOILS 53
4.7 MECHANISMUS DER BINDUNG 56
4.7.1 DNA-BIEGUNG 56
4.7.2 DNA-„WRAPPING“ 58
4.7.3 MULTIMERISIERUNG 60
4.8 STRUKTURVERÄNDERUNG DURCH DEK 63
4.8.1 SEDIMENTATIONSANALYSE 63
4.8.2 ANALYSE IM ELEKTRONENMIKROSKOP 66
4.8.3 ANALYSE DER STRUKTUR ÜBER MIKROKOKKENNUKLEASE-VERDAU 68 4.9 EINFLUSS VON DEK AUF ACF1 UND ISWI IM NUKLEOSOMEN SLIDINGASSAY 72
5 DISKUSSION 75
5.1 SEQUENZUNSPEZIFISCHE BINDUNG AN DNA UND CHROMATIN 75 5.2 DEK BINDET BEVORZUGT AN ÜBERKREUZTE DNA-STRUKTUREN 79 5.3 DEK FÜHRT POSITIVE SUPERCOILS EIN 81 5.4 MÖGLICHE MECHANISMEN FÜR DIE EINFÜHRUNG DER SUPERCOILS 82
5.4.1 WRAPPING 82
5.4.2 INTERKALIERUNG 83
5.4.3 LOOPING 84
5.5 FUNKTIONEN VON POSITIVEN SUPERCOILS IN VIVO 85 5.6 STRUKTURVERÄNDERUNGEN DURCH DEK 87 5.7 EINFLUSS VON DEK AUF CHROMATINREMODELING 90
5.7.1 NUKLEOSOMEN „SPACING-ASSAY“ 91
5.7.2 NUKLEOSOMEN-„SLIDING-ASSAY“ 92
6 ZUSAMMENFASSUNG 95 7 LITERATUR 96
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: Eukaryotische Zelle und Zellkern 1
Abbildung 1.2: Organisation von Chromatin. 3
Abbildung 1.3: Struktur der Histone 5
Abbildung 1.4: Mögliche Mechanismen der Chromatin Remodeling Faktoren 9 Abbildung 1.5: Topologische Probleme einer langen linearen und einer ringförmigen DNA 13
Abbildung 1.6: Domänen des DEK Proteins 16
Abbildung 4.1: Reinigung von GST-DEK 37
Abbildung 4.2: Reinigung von his-DEK 38
Abbildung 4.3: Bandshift und Topologie-Assay 39
Abbildung 4.4: Bandshift und Topologie-Assay mit verschiedenen DNA-Sequenzen 41
Abbildung 4.5: Bandshiftanalysen mit den PET-Sequenzen 42
Abbildung 4.6: Bandshift mit Form I-, Form II- und Form III-DNA 43 Abbildung 4.7: Bandshiftanalysen mit Duplex- und Kruziform-DNA 45 Abbildung 4.8: Kompetitionsanalysen mit Duplex und Kruziform-DNA 46
Abbildung 4.9: Bandshift- und Topologie-Assay mit his-DEK 47
Abbildung 4.10: Modell 49
Abbildung 4.11: Behandlung von DEK-depletierter DNA mit Topoisomerase I 50 Abbildung 4.12: Topologie nach Entfernung von DEK von Minichromosomen 52 Abbildung 4.13: Behandlung von DEK-depletierten Minichromosomen mit Topoisomerase I 53
Abbildung 4.14: Einführung von positiven Supercoils 55
Abbildung 4.15: „Bending“-Assay in Gegenwart von DEK 57
Abbildung 4.16: Interaktion von DEK mit linearer DNA 58
Abbildung 4.17: Bandshift-Assay in Gegenwart von Etidiumbromid 60 Abbildung 4.18: Sedimentationsanalyse von freiem ungebundenen GST-DEK 62
Abbildung 4.19: Sedimentationsanalysen 65
Abbildung 4.20: EM-Analyse 67
Abbildung 4.21: Mikrokokkennuklease-Verdau von SV40 DNA und Minichromosomen 69 Abbildung 4.22: Mikrokokkennuklease-Verdau von im Drosophila-Chromatin 72
Abbildung 4.23: Slidingassay 74
Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Der Zellkern
Die eukaryotische Zelle besteht aus verschiedenen Kompartimenten, die alle eine bestimmte Funktion in der Zelle übernehmen. So dienen die Mitochondrien als Energielieferanten, die Ribosomen sind die Orte, an denen die mRNAs in Proteine umgeschrieben werden, und das Endoplasmatische Retikulum ist für den intra- und interzellulären Transport verschiedenster Stoffe zuständig. Das Erbgut aller Eukaryoten ist im Zellkern lokalisiert und liegt dort als eine hoch regulierte Struktur aus DNA und Proteinen vor, die als Chromatin bezeichnet wird. Es gibt unterschiedlich dicht gepackte Chromatinstrukturen. Euchromatin ist relativ locker gepacktes Chromatin, wird früh in der Synthese-Phase (S-Phase) repliziert und stellt den transkriptionsaktiven DNA-Bereich im Zellkern dar. Dem gegenüber steht das Heterochromatin, das erst in der späten S-Phase repliziert wird und aus sehr dicht gepacktem Chromatin besteht.
Abbildung 1.1: Eukaryotische Zelle und Zellkern
A: Darstellung einer eukaryotischen Zelle. B: Darstellung des eukaryotischen Zellkerns. Aus (Knippers 2001).
Der Zellkern selbst wird durch die Kernhülle, bestehend aus zwei Lipid- Doppelmembranen, vom Cytoplasma abgegrenzt. Die äußere Membran setzt sich in
Einleitung 2
das Endoplasmatische Retikulum fort, während sich unter der inneren Membran ein Maschenwerk fadenförmiger Proteinstrukturen befindet. Diese Strukturen werden als die Kernlamina bezeichnet, die im Wesentlichen aus zwei Proteinen besteht, die Typ- A und die Typ-B Laminae. Um einen Stoffaustausch zwischen Kern und Cytoplasma zu ermöglichen, ist die Kernhülle durch die Kernporen-Komplexe an mehreren Stellen unterbrochen (Knippers 2001).
1.2 Chromatin
1.2.1 Organisation der DNA im Zellkern
In jedem eukaryotischen Zellkern befinden sich mehrere DNA-Fäden, die aneinandergelegt eine Gesamtlänge von zwei Metern haben würden. Demgegenüber steht der Durchmesser des Zellkerns von 10-5 Metern. Die DNA muss demnach sehr stark kompaktiert sein, um im Zellkern Platz zu finden. Die Zelle erreicht dies, indem sie diesen langen DNA-Faden in höhere Strukturen organisiert und stufenweise kompaktiert. Die erste Kondensationsstufe wird durch die Organisation der DNA in Nukleosomen erreicht. Dabei sind ca. 146 bp DNA um einen von Histonen (1.2.3) gebildeten Proteinkomplex gewunden, hierdurch wird eine 6- bis 7-fache Kompaktierung des DNA-Fadens erreicht. Diese Struktur wird als die 10 nm-Faser oder Perlenkettenstruktur bezeichnet (Abbildung 1.2, B). Der nächste Schritt ist die Bindung des Histons H1 an die Ein- und Austrittsstelle der DNA (Abbildung 1.2 C).
Dabei winden sich 6 bis 8 Nukleosomen zur so genannten 30 nm-Faser. Das Histon H1 befindet sich bei diesem Modell, dem Solenoidmodell, im Inneren der Helix (Graziano et al. 1994), dadurch erfährt die DNA eine 40-fache Kompaktierung (Abbildung 1.2 C).
Diese 30 nm-Faser wiederum ist in geordneten Schleifen organisiert, die über spezielle AT-reiche DNA-Sequenzen, die SAR/MAR-Bereiche, mit der Kernmatrix verknüpft sind. Auf dieser Stufe verdichtet sich das Chromatin noch einmal um das 600- bis 800-fache (Abbildung 1.2, D) (van Holde 1989; Knippers 2001).
Einleitung 3
Abbildung 1.2: Organisation von Chromatin.
Schematische Darstellung der Organisationsformen von Chromatin. A: Proteinfreie DNA. B: 10 nm Faser (Perlenkettenstruktur). Die Bindung der Histonoktamere bewirkt eine 6- bis 7-fache Kondensation. C: 30 nm Faser (Solenoidmodell). Die Anlagerung von H1 vermittelt eine Helixbildung der 10 nm-Faser. Das Histon H1 liegt in diesem Modell im Inneren der Helix. D: Chromatinschleifen.
Die 30 nm-Faser legt sich in weitere Schleifen, die mit der Kernmatrix assoziiert sind. (aus (Knippers 2001)
1.2.2 Nukleosomen
Das Nukleosom ist die kleinste Einheit und die erste Kompaktierungsstufe des Chromatins. Es besteht aus einem Histonoktamer, um das 146 bp DNA in 1,75 Windungen gewunden sind. Die Bindung von Histon H1 an der Ein- und Austrittsstelle der DNA vervollständigt das Nukleosom zum Chromatosom, um das nun 168 bp DNA in zwei vollen Windungen gewickelt sind (Thoma et al. 1979;
Thoma 1988). Das Histonoktamer wird von den „core“-Histonen H2A, H2B, H3 und H4 gebildet, wobei ein Tetramer aus je zwei Molekülen H3 und H4 auf beiden Seiten
Einleitung 4
von je einem H2A/H2B-Dimer flankiert wird. Die einzelnen Nukleosomen sind durch die „linker“-DNA voneinander getrennt, deren Länge bei unterschiedlichen Zelltypen und Organismen sehr verschieden sein kann (Richmond et al. 1984).
1.2.3 Histone
Die Histone sind kleine, basische, hoch konservierte Proteine, die im Wesentlichen aus zwei verschiedenen Proteindomänen bestehen. Zum einen einer globulären Domäne, die für die Wechselwirkung der Histone untereinander und mit der DNA verantwortlich ist, und zum anderen aus ein bis zwei flexiblen Armen, die posttranslational modifiziert werden können. Zudem haben diese Proteindomänen einen Einfluss auf die Wechselwirkung der Histonen mit der DNA und mit anderen Proteinen (Luger and Richmond 1998).
Die Aminosäuresequenzen der Histone haben sich während der Evolution wenig verändert, so unterscheidet sich das Histon H3 von Tier- und Pflanzenzellen nur an vier Stellen, das Histon H4 sogar nur an zwei Stellen. Die stärker konservierten Histone H3 (135 aa, 15,27 kDa) und H4 (102 aa, 11,24 kDa) verdanken ihren basischen Charakter vor allem der Aminosäure Arginin.
Die Histone H2A (129 aa, 13,96 kDa) und H2B (125 aa, 13,77 kDa) sind weniger stark konserviert, denn bei ihnen kann man schon innerhalb der Säugetiere bis zu acht unterschiedliche Aminosäuren finden. In ihren globulären Domänen kommt vor allem die basische Aminosäure Lysin vor. Der Lysinanteil der geladenen flexiblen Arme ist sowohl bei H3 und H4 wie auch bei H2B und H2A sehr hoch (Abbildung 1.3).
Das am wenigsten konservierte und zugleich größte Histon ist das sogenannte
„linker“-Histon H1 (210–230 aa, 22,5 kDa), das vor allem dazu dient, die Bindung der
„core“-Histone an die DNA zu stabilisieren. Das „linker“-Histon H1 von verschiedenen Organismen kann sich sehr stark voneinander unterscheiden. Ebenso wie die anderen Histone besitzt auch H1 flexible Arme, die posttranslational modifiziert werden können und mit der „linker“-DNA zwischen den Nukleosomen interagieren (Pruss et al. 1995; Wolffe 1998).
Einleitung 5
Abbildung 1.3: Struktur der Histone
Alle Histone bestehen aus einer zentralen globulären Domäne und ein bis zwei flexiblen Armen mit einem hohen Anteil der basischen Aminosäuren Arginin (R) und Lysin (K). N: Aminoterminales Ende.
(aus (Knippers 2001)).
1.3 Veränderungen der Chromatinstruktur
Die Chromatinstruktur ist eine wichtige Komponente bei der Regulation der verschiedenen DNA-Transaktionen wie Replikation, Transkription, Rekombination und DNA-Reparatur. Chromatin ist eine sehr dynamische und veränderbare Struktur, die durch verschiedene Mechanismen beeinflusst wird. Dazu zählen die posttranslationalen Modifikationen der flexiblen Arme der Histone und die Chromatinremodelingfaktoren. Darüber hinaus kennt man sogenannte Nicht-Histon- Proteine, die ebenfalls einen erheblichen Einfluss auf die Chromatinstruktur und deren Regulation haben. Im Gegensatz zu den Histonen, die in allen Zelltypen als Nukleosomen zu finden sind, unterscheidet sich das Chromatin verschiedener Zelltypen vor allem in der Zusammensetzung der Nicht-Histon-Proteine. In den letzten Jahren wurden einige Fakten gesammelt, die Aufschluss darüber geben, dass
Einleitung 6
diese verschiedenen Mechanismen in komplexen Netzwerken zusammenarbeiten, wobei die genauen Funktionsweisen noch weitgehend unbekannt sind.
1.3.1 Posttranslationale Modifikationen der Histone
Die posttranslationalen Modifikationen der Histone waren die ersten Mechanismen, die bekannt waren, durch die die Chromatinstruktur verändert werden kann.
Angriffspunkte dieser Modifikationen sind die flexiblen Arme der Histone, die an bestimmten Aminosäureresten acetyliert, phosphoryliert oder methyliert werden können. Die Acetylierung der Histone H3 und H4 ist der am besten charakterisierte Mechanismus. Sie wird von den Histonacetyltransferasen (HAT) katalysiert, die immer in großen Proteinkomplexen mit vielen verschiedenen, meist regulatorischen Untereinheiten vorkommen (Wolffe 1998; Berger 2002). Durch die Acetylierung eines Histons wird eine negative Ladung eingeführt. Dadurch wird eine positive Ladung neutralisiert, die Histon-DNA-Wechselwirkung wird geschwächt und die Chromatinstruktur wird aufgelockert (Bode et al. 1983; Ausio et al. 1986).
Eine weitere Gruppe der Histon-modifizierenden Enzyme sind die Histonkinasen, die die Arme der Histone H3 und H4 sowie H1 phosphorylieren. Wie für die Acetylierung beschrieben, wird die Chromatinstruktur auch durch die Phosphorylierung aufgelockert und wird somit mit transkriptionsaktiven Chromatin in Verbindung gebracht. Allerdings ist auch bekannt, dass die Phosphorylierung der Histone bei der Chromosomenkondensation während der Mitose eine Funktion hat. Hierbei wird deutlich, dass weitere Faktoren neben den Histon-modifizierenden Enzymen in die Regulation der Chromatinstruktur involviert sein müssen (Wolffe 1998; Berger 2002).
Die Methylierung von Histonen wurde in den letzten Jahren intensiv untersucht. Sie wird von speziellen Enzymen, den Histon-Methylasen durchgeführt. Wie die Phosphorylierung kann auch die Methylierung der Histone zum einen eine Auflockerung und zum anderen ein Verschließen von Chromatin zur Folge haben (Kouzarides 2002).
Es ist mittlerweile klar, dass nicht eine einzelne Modifikation über die Chromatinstruktur entscheidet. Vielmehr scheint das Modifikationsmuster von H3 an den Stellen K9, S10, K14 entscheidend dafür zu sein, welche weiteren Faktoren an
Einleitung 7
diesen Chromatinbereich rekrutiert werden, die ihrerseits die Chromatinstruktur beeinflussen können (Berger 2002).
1.3.2 Chromatinremodeling
Chromatinremodeling ist ein weiterer Mechanismus, über den die Chromatinstruktur verändert und reguliert werden kann. Wie die Histonmodifikationen sind auch die Remodelingfaktoren in alle DNA-Transaktionen involviert. Grundsätzlich werden Chromatinremodelingaktivitäten als Faktoren beschrieben, die die Energie der ATP- Hydrolyse verwenden, um die Histon-DNA-Wechselwirkung derart zu verändern, dass das Chromatin zugänglicher wird. Es sind mittlerweile sehr viele verschiedene Remodelingfaktoren bekannt, die alle aus einer ATPase und weiteren verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt sind (Steger and Workman 1996; Tsukiyama and Wu 1997). Es sind drei verschiedene ATPasen bekannt, die als Untereinheiten bei den Remodelingfaktoren vorkommen, dabei handelt es sich um die Swi2/Snf2-, die ISWI- und die Mi-2-ATPase. Nach diesen ATPasen werden die Remodelingfaktoren in drei verschiedene Familien unterteilt (Varga-Weisz 2001).
Der am besten charakterisierte Remodelingkomplex ist der SWI/SNF-Komplex aus S. cerevisiae, der der Familie der Swi2/Snf2-ATPasen angehört. Nach und nach wurden auch in anderen Organismen Chromatinremodelingkomplexe gefunden. Aus Drosophila kennt man die Komplexe CHRAC (Varga- Weisz et al. 1997), NURF (Tsukiyama and Wu 1995) oder ACF (Ito et al. 1997) mit der ATPase ISWI. Beim Menschen wurden unter anderen die Komplexe NURD (Mi-2-ATPase) (Xue et al.
1998), RSF (Swi2/Snf2-ATPase) (LeRoy et al. 1998), hsACF und hsCHRAC (Poot et al. 2000) identifiziert, die sich alle in der Zusammensetzung ihrer Untereinheiten unterscheiden. Die ATPase-Untereinheiten besitzen alle eine Domäne, die mit modifizierten Histonen interagieren kann. So haben die Swi2/Snf2-ATPasen eine Bromodomäne, die acetylierte Histone erkennt, die Mi-2-ATPasen besitzen eine Chromodomäne, die mit methylierten Histonen interagieren kann, die ISWI-ATPase besitzt die SANT-Domäne, von der vermutet wird, dass sie für die DNA-Bindung verantwortlich ist (Varga-Weisz 2001; Berger 2002). Die verschiedenen Remodelingfaktoren sind teilweise an sehr unterschiedlichen Prozessen beteiligt, während SWI/SNF die Chromatinstruktur spezifisch und lokal an Promotoren verändert, können CHRAC und ACF Nukleosomen über einen großen DNA-Bereich
Einleitung 8
positionieren, dies wird als Nukleosomen-„Spacing“-Aktivität bezeichnet. Alle ISWI Remodelingfaktoren aus Drosophila wirken eher global, um eine dynamische Chromatinstruktur zu gewährleisten, als dass sie spezifisch spezielle Promotoren regulieren (Langst and Becker 2001). Daher wird vermutet, dass die ISWI- Remodelingfaktoren auch eine wichtige Funktion bei der Bildung der Chromatinfaser und beim Nukleosomenassembly haben (Tyler and Kadonaga 1999).
Unter der Nukleosomen-„Spacing“-Aktivität der Remodelingfaktoren versteht man, dass die Remodelingfaktoren in der Lage sein müssen, Nukleosomen auf der DNA zu verschieben. Tatsächlich können alle Remodelingfaktoren Histonoktamere, die auf einem kurzen DNA-Fragment rekonstituiert sind, auf der DNA verschieben (Hamiche et al. 1999; Langst et al. 1999; Jaskelioff et al. 2000). Der Schlüssel für mögliche Mechanismen könnte darin liegen, dass die meisten Remodelingfaktoren die superhelikale Spannung der DNA ATP-abhängig verändern können (Guyon et al.
2001). Die beiden einfachsten Modelle sind der „Twisting“- und der „Writhing“- Mechanismus (Abbildung 1.4, A) (Flaus and Owen-Hughes 2001). Beides setzt die Veränderung des Twists durch den Remodelingfaktor voraus. Das „Twisting“-Modell (Abbildung 1.4, A a) beinhaltet, dass der veränderte Twist nicht statisch an einer Stelle liegen bleibt, sondern dass er über die DNA vom „linker“-Bereich in die nukleosomale DNA hinein diffundiert. Dadurch verändert sich die DNA-Histon- Wechselwirkung und die DNA verändert ihre Lage relativ zum Nukleosom, sie wird über das Nukleosom gezogen. Das „Writhing“-Modell (Abbildung 1.4, A b) könnte den Zustand beschreiben, wenn die DNA-Histon-Wechselwirkung sehr stark ist. In diesem Fall kann sich der Twist nicht einfach über das Nukleosom fortsetzen, sondern wird durch einen Supercoil (writhe) im „linker“-Bereich ausgeglichen. Dieser Supercoil könnte sich dann auch in die nukleosomale DNA fortsetzen und die DNA so vom Nukleosom wegdrücken, somit werden DNA-Sequenzen kurzfristig freigesetzt. Wenn nun die DNA nicht an der exakt gleichen Stelle wieder am Histonoktamer bindet, wird auch hier die DNA über das Nukleosom gezogen. Es ist sehr wahrscheinlich, dass es sich um eine Kombination von beiden Mechanismen handelt (Flaus and Owen-Hughes 2001; Varga-Weisz 2001).
Einleitung 9
Abbildung 1.4: Mögliche Mechanismen der Chromatinremodelingfaktoren
A: a, Twisting Modell. b, Wirthing Modell.(aus (Flaus and Owen-Hughes 2001)). B: „Bulgin“-Modell. a, der Remodelingfaktor bindet an das Nukleosom. b, Abschälen der DNA von der Histonoktamer Oberfläche durch eine Konformationsänderung des Proteins. c, das freigewordene DNA-Segment bindet an ein benachbartes Nukleosom und bildet somit das Dinukleosom. d, das Histonoktamer wird auf ein anderes DNA-Segment verschoben (trans-displacement). e, der Remodelingfaktor geht in seine ursprüngliche Konformation zurück, dabei entsteht eine lokale Schleife, die sich über die Histonoktamer-Oberfläche fortsetzt (aus (Becker and Horz 2002).
Der „Bulge“-Mechanismus (Abbildung 1.4, B) wird als ein dritter Mechanismus diskutiert. Der erste Schritt hierbei ist das Ablösen eines DNA-Segments an der Ein- und Austrittsstelle der DNA am Nukleosom. Die Remodelingfaktoren könnten die Energie der ATP-Hydrolyse für eine Konformationsänderung verwenden und dadurch das Ablösen der DNA katalysieren (Abbildung 1.4, B a und b). Wenn das Protein dann wieder seine ursprüngliche Konformation einnimmt (Abbildung 1.4, B e), entsteht eine lokale DNA-Schleife, die sich über das Histonoktamer fortsetzt (Langst and Becker 2001; Becker 2002; Becker and Horz 2002). Die Veränderung des Twists durch einen Remodelingfaktor oder ein anderes Protein könnte dieses Abschälen der DNA stimulieren oder erleichtern. In Abbildung 1.4, B sind noch zwei weitere Möglichkeiten dargestellt, die nach dem Ablösen des DNA-Segments auftreten könnten, zum einen die Ausbildung von Dinukleosomen und zum anderen das Transdisplacement des Histonoktamers auf ein anderes DNA-Fragment.
1.3.3 Nicht-Histon-Proteine
Zu der Gruppe der Nicht-Histon-Proteine zählen alle Proteine, die an Chromatin binden, aber nicht in die Klasse der Histone einzuordnen sind. Dazu zählen die DNA-
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und RNA-Polymerasen sowie die verschiedenen Replikations- und Transkriptions- faktoren. Die Zusammensetzung dieser Proteine kann in unterschiedlichen Zelltypen sehr verschieden sein, je nachdem, ob es sich um stark proliferierende Zellen, um transkriptionsaktive oder -inaktive Zellen handelt. Dagegen findet man bei einer weiteren Nicht-Histon-Proteingruppe, den HMG-Proteinen, eine generelle Verteilung in allen Zellen höherer Eukaryonten (Bustin et al. 1990). Bei den HMG-Proteinen handelt es sich um sehr kleine, konservierte Proteine, die alle nicht größer sind als 30 kDa und einen hohen Anteil an geladenen Aminosäuren besitzen. Ebenso wie die Aminosäuresequenz ist auch die assymetrische Ladungsverteilung sehr stark konserviert, durch die sie in der Lage sind, sowohl an negativ geladene DNA als auch an positiv geladene Proteine wie die Histone zu binden. Sie binden alle sequenzunspezifisch an DNA, weisen aber eine sehr starke Strukturspezifität auf. So haben diese Proteine eine sehr hohe Präferenz für verdrehte DNA-Strukturen, kruziforme DNA oder gebogene DNA (JR et al. 1998; Bustin 1999; Stros and Muselikova 2000).
Die HMG-Proteine lassen sich in drei Familien aufteilen, HMGB (alter Name: HMG- 1/-2), HMGA (alter Name: HMG-I/-Y) und HMGN (alter Name: HMG-14/-17), die sich hauptsächlich durch ihre DNA-Bindedomänen voneinander unterscheiden. Diese Domäne setzt sich bei den HMGB-Proteinen aus zwei HMG-Boxen zusammen. Die HMGN-Familie besitzt ein Nukleosomen-Bindemotiv, die HMGA-Proteine binden über einen sogenannten AT-hook an die DNA.
Neben den klassischen HMG-Proteinen wurde in den letzten Jahren das HMG-Motiv auch in anderen Proteinen gefunden, dabei handelt es sich um verschiedenste Proteine, die neben anderen Motiven auch eines oder mehrere der drei HMG-Motive besitzen. Diese Proteine sind nicht in allen Zelltypen zu finden, binden meist sequenzspezifisch an DNA, sind nicht so sehr verbreitet und besitzen neben dem HMG-Motiv auch noch andere funktionelle Proteindomänen.
1.3.3.1 HMGB-Proteine (HMG-1/-2)
HMGB-Proteine weisen zwei verschiedene Proteindomänen auf, zum einen die beiden HMG-Boxen, die für die DNA-Bindung verantwortlich sind, und zum anderen einen sehr sauren Bereich am C-Terminus. Bei den HMG-Boxen handelt es sich um
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homolog gefaltete Domänen von ca. 80 Aminosäuren, wobei die Faltung konservierter ist als die eigentliche Aminosäuresequenz (Baxevanis et al. 1995). Die Bindung an DNA erfolgt an der kleinen Rinne durch eine Interkalation von zwei aromatischen Aminosäureresten, wodurch die große Rinne zusammengedrückt und die kleine Rinne größer wird (Love et al. 1995; Werner et al. 1995). Dies hat zur Folge, dass die DNA gebogen wird. Durch diesen Bindungsmechanismus lässt sich erklären, dass HMGB-Proteine dazu in der Lage sind in vitro lineare DNA zu biegen und in zirkuläre DNA, Supercoils einzuführen (Sheflin and Spaulding 1989; Stros et al. 1994; Bustin 1999; Thomas 2001). Des Weiteren binden diese Proteine mit einer sehr hohen Präferenz an schon gebogene, verdrehte, supergecoilte oder kruziforme DNA (Bustin 1999; Thomas 2001). Es wird vermutet, dass diese Klasse der HMG- Proteine als „Architektur“-Transkriptionsfaktoren von sequenzspezifischen Transkriptionsfaktoren an bestimmte Promotoren rekrutiert werden. Die Bindung des HMG-Proteins hat dann die Biegung der DNA zur Folge, was wiederum die Interaktion von zwei weiter entfernt bindenden Faktoren erleichtern kann (Thomas 2001). Für den Prozess der V(D)J-Rekombination wurde tatsächlich schon nachgewiesen, dass die HMG-vermittelte DNA-Biegung eine große Rolle spielt (Aidinis et al. 1999; Fugmann et al. 2000; Thomas 2001).
1.3.3.2 HMGA-Proteine (HMG-I/-Y)
Das DNA-Bindemotiv der HMGA-Proteine ist der sogenannt AT-hook. Dieser besteht aus neun Aminosäuren, wobei das Peptid Arg-Glyc-Arg-Pro immer unverändert ist.
Diese Sequenz wird auf beiden Seiten von positiv geladenen Lysin- und Argininresten flankiert (Reeves and Nissen 1990). Die HMGA-Proteine der HMG- Familie besitzen drei hintereinandergeschaltete AT-hooks, über die sie sich in die kleine Rinne der DNA lagern. Die Bindung erfolgt wie bei den HMGB-Proteinen eher struktur- als sequenzspezifisch, wobei die HMGA-Proteine AT-reiche Sequenzen bevorzugen (Reeves et al. 1987). Ebenso wie die HMGB-Proteine erkennen auch die HMGA-Proteine veränderte DNA-Strukturen wie kreuzförmige, supergecoilte oder gebogene DNA und binden bevorzugt an diese DNA-Strukturen. HMGA-Proteine sind ebenfalls in der Lage, die DNA-Struktur durch die Einführung von Supercoils und das Biegen der DNA zu verändern (Reeves 2001). Die Bindung des AT-hooks allein bewirkt keinerlei Veränderung der DNA-Struktur und beruht auch nicht auf einer Interkalation von aromatischen Aminosäuren. Es wird vermutet, dass die
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Strukturveränderungen durch das gleichzeitige Binden der drei AT-hooks eines HMGA-Moleküls an verschiedenen Stellen des DNA-Moleküls oder durch die Bindung von mehreren HMGA-Molekülen zustande kommen könnte (Reeves and Beckerbauer 2001). Interessanterweise findet sich der AT-hook auch bei einigen anderen Proteinen, die eine Funktion bei der Veränderung der Chromatinstruktur haben, dazu gehören das Histon H1 (globuläre Domäne), Histonacetylasen und einige Untereinheiten der Chromatinremodeling-Faktoren (1.3.2) (Aravind and Landsman 1998). Wie für die HMGB-Proteine beschrieben, werden auch die HMGA- Proteine als architektonische Transkriptionsfaktoren diskutiert (Bustin 1999; Reeves 2001).
1.3.3.3 HMGN-Proteine (HMG-14/-17)
Diese Gruppe der HMG-Proteine erkennt die Struktur des Nukleosoms. Im Wesentlichen besitzen die Mitglieder dieser Familie drei funktionelle Proteindomänen, die DNA-Bindedomäne am N-Terminus, die Transaktivierungsdomäne am C-Terminus und die zentral gelegene Nukleosomen- Bindedomäne (Bustin and Reeves 1996). Die Bindung der HMGN-Proteine verursacht eine strukturelle Veränderung des Nukleosoms, wobei noch nicht bekannt ist, wie diese Veränderungen genau aussehen (Postnikov et al. 1995). HMGN- Proteine dekompaktieren Chromatin und stimulieren damit sowohl Replikation als auch Transkription. (Bustin 1999). Ebenso wie für die anderen HMG-Proteine beschrieben, bindet auch HMGN sequenzunspezifisch an die DNA, daher wird auch hier ein Mechanismus vermutet, der die HMGN-Proteine über andere, sequenzspezifische Faktoren rekrutiert (Wu 1997).
1.4 DNA Topologie
Ein ringförmiges DNA-Molekül mit derselben Sequenz kann unterschiedliche Struk- turen annehmen. Diese Topoisomere kommen immer dann zustande, wenn die beiden Stränge der DNA-Doppelhelix über- oder unterwunden werden (Knippers
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2001).
Abbildung 1.5: Topologische Probleme einer langen linearen und einer ringförmigen DNA A: Entwindung einer langen linearen DNA.
B: Entwindung einer ringförmig geschlossenen DNA (aus (Knippers 2001))
Die energetisch günstigste Form der DNA-Doppelhelix ist die B-Form-DNA, bei der die beiden Stränge weder unter- noch überwunden sind, und somit liegt in diesem Fall eine vollständig relaxierte DNA vor. In der Natur allerdings ist das Vorkommen einer relaxierten DNA eher selten, denn bei allen Prozessen, bei denen ein Enzym an der DNA entlang wandert und die beiden Stränge voneinander trennt, wird die DNA über- oder unterwunden. Darüber hinaus gibt es Proteine, wie z. B. die HMG- Proteine, die den topologischen Status der DNA durch ihre Bindung verändern können.
Die Topologie eines gegebenen DNA-Moleküls lässt sich über die Verknüpfungszahl LK (linking number) beschreiben. Im relaxierten Zustand gilt für ein ringförmiges geschlossenes DNA-Molekül:
LK = N / 10,5 = Tw
N: Anzahl der Basenpaare des DNA Moleküls
Tw: Twisting number, Anzahl der Überkreuzungen der beiden Stränge
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Die Verknüpfungszahl LK ist eine konstante Größe für geschlossene DNA-Moleküle.
Während sich der Twist (Tw) ändern kann, muss die Verknüpfungszahl (LK) immer gleich bleiben.
Wird die Anzahl der Basenpaare pro Helixwindung durch zu- oder aufdrehen der Doppelhelix verändert, muss sich zwangsläufig der Twist verändern. Dabei entsteht eine topologische Spannung im Molekül, die mit einer Drehung der Helixachse selbst wieder ausgeglichen werden kann. Die Anzahl der Überkreuzungen der Doppelhelix beschreibt man mit der Größe Wr (writhe), und bezeichnet sie als Supercoils.
LK = Tw + Wr
Wr: Writhe, Anzahl der Überkreuzungen der Doppelstränge
Wird der DNA-Doppelstrang „zugedreht“, das bedeutet für die rechtsgängige B-Form DNA eine Drehung nach rechts, bekommt man weniger Basenpaare pro Windung und somit wird der Twist größer. Da sich der Wert der Verknüpfungszahl (LK) nie ändern darf, muss der Wert für den Writhe (Wr) negativ sein. Es handelt sich hierbei um negative Supercoils, die durch die Drehung der beiden DNA-Stränge entstanden sind. Wird der DNA-Doppelstrang nach links gedreht, also aufgedreht, entstehen zur Kompensation der topologischen Spannung positive Supercoils (Knippers 2001).
1.4.1 DNA-Struktur im Nukleosom
Der Twist der nukleosomalen DNA ist im Vergleich zur B-Form-DNA verändert. Denn durch die Windung der DNA um das Histonoktamer verändert sich die Anzahl der Basen pro Helixwindung. Im Schnitt sind dies 10,2 bp/Helixwindung bei nukleosomaler DNA, im Vergleich zu 10,5 bp/Helixwindung bei der B-Form. Somit werden bei der Bindung von Histonoktameren an DNA negative Supercoils eingeführt, die in diesem Fall fixiert sind, d.h. sie können nicht durch eine Topoisomerase relaxiert werden (Hayes et al. 1990; Wolffe 1998). Zur Kompensation dieser fixierten negativen Supercoils entstehen positive Supercoils an einer anderen Stelle im DNA-Molekül, die nicht fixiert sind und von Topoisomerasen entfernt werden können. Übrig bleibt also eine gewisse Anzahl fixierter negativer Supercoils (Keller 1975; Gruss 1995).
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1.4.2 DNA-Topoisomerasen
Die überwiegende Mehrzahl der in der Natur vorkommenden DNA-Moleküle ist negativ supergecoilt (Knippers 2001). Dies gilt sowohl für bakterielle Genome und Plasmide als auch für die DNA aus höheren Organismen, die sehr lang und nukleosomal organisiert ist (1.4.1). Während aller Prozesse, bei denen die beiden DNA-Doppelstränge voneinander getrennt werden, entstehen topologische Spannungen, die relaxiert werden müssen (Champoux 2001). Würden diese Spannungen nicht entfernt werden, so würden sie im Verlauf eines solchen Prozesses zu groß werden, sodass die Replikation oder Transkription nicht zu Ende geführt werden könnte.
Um diese Probleme des topologischen Stresses der DNA in der Zelle zu lösen, gibt es Enzyme, die die Verknüpfungszahl eines DNA-Moleküls verändern können, die Topoisomerasen. Sie lösen Supercoils auf, indem sie entweder einen Einzelstrangbruch (Typ I-Topoisomerasen) oder einen Doppelstrangbruch (Typ II- Topoisomerasen) in die DNA einführen. Nachdem sich die beiden Stränge entwinden konnten, sind die Topoisomerasen in der Lage, die DNA-Brüche wieder zu ligieren.
Während die Typ I-Topoisomerasen hauptsächlich Torsionsspannungen auflösen, wie sie bei der Replikation entstehen, spielen die Typ II-Enzyme eine wichtige Rolle bei der Trennung der beiden DNA-Ringe nach der bakteriellen Replikation und der Trennung der Schwesterchromatide am Ende der eukaryotischen Mitose.
1.5 Das Protoonkogen-Protein DEK
1.5.1 Allgemein
Das Protein DEK wurde ursprünglich als ein Fusionsprotein mit CAN bei Patienten mit akuter myeloider Leukämie (AML) identifiziert. Dieses Fusionsprotein entsteht durch eine Chromosomentranslokation, bei der der 3´-Bereich des can-Gens von Chromosom 6 (p23) in den 5´-Bereich des dek-Gens auf Chromosom 9 (q34) translokalisiert wird. Dabei entsteht ein Fusionsprotein aus DEK und CAN, bei dem die letzten 25 C-terminalen Aminosäuren des DEK-Proteins fehlen, und 812 Aminosäuren des N-Terminus von CAN (von Lindern et al. 1992). Solche Fusionsproteine sind bekannt bei verschiedenen Leukämiearten. So findet man
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beispielsweise ein can-set-Fusionsgen bei einigen Patienten, die an der akuten undifferenzierten Leukämie leiden (Fornerod et al. 1996). Darüber hinaus wurde DEK als Autoantigen in menschlichen Autoimmunkrankheiten identifiziert. Dazu gehören die juvenile rheumatoide Arthritis (Sierakowska et al. 1993; Forero et al. 1998; Dong et al. 2000) und der systemische Lupus Erythematosus (Wichmann et al. 2000). Des Weiteren kann DEK die Hypersensitivität gegen ionisierende Strahlung von Zellen, die aus Ataxia-Telangiectasia-Patienten isoliert wurden, aufheben (Meyn et al. 1993).
Bisher kennt man allerdings weder die Funktion von DEK noch die Funktion von CAN in vivo.
DEK ist ein 43 kDa-Protein und besteht aus 375 Aminosäuren. Während man DEK sowohl in allen untersuchten Säugern, in Drosophila als auch in Arabidopsis findet, konnten bisher keine Homologien zu anderen bekannten Proteinen gefunden werden. Allerdings findet man im Bereich der Aminosäuren 149 bis 183 einen Bereich, der Ähnlichkeiten mit der SAF-Box (scaffold attachment factor) (Kipp et al.
2000), einem bekannten DNA-Bindemotiv, hat. Außerdem weist DEK einige sehr saure Bereiche auf und besitzt eine nukleare Lokalisierungssequenz (Abbildung 1.6).
Abbildung 1.6: Domänen des DEK-Proteins
1.5.2 Lokalisierung und Chromatinbindung
Zellfraktionierungsstudien haben gezeigt, dass DEK ausschließlich im Zellkern lokalisiert ist und mit 250 mM Salz aus HeLa-Zellkernen eluiert (Kappes et al. 2001).
DEK verhält sich somit wie die gut charakterisierten Chromatin-gebundenen Proteine Cdc6 (Mendez and Stillman 2000) und ORC2 (Kreitz et al. 2001). Weder die Lokalisierung noch die Menge von DEK verändert sich im Verlauf des Zellzyklusses.
Immunfluoreszenzanalysen zeigen darüber hinaus, dass DEK in allen Stadien der Mitose an Chromatin gebunden ist. Eine kleinere Population von DEK dagegen ist mit RNA-Strukturen assoziiert. Nach der Behandlung von HeLa-Zellkernen mit
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RNase wurden ca. 10% der DEK-Population freigesetzt, während der Großteil am Chromatin gebunden bleibt (Kappes et al. 2001).
Die Arbeiten von Alexiadis et al. (Alexiadis et al. 2000) charakterisieren die Bindung von DEK an Chromatin in vitro. Im Zuge dieser Studien wurde DEK über mehrere konventionelle Säulen aus HeLa-Kernextrakt gereinigt. Dieses so gereinigte DEK- Protein verändert in Anwesenheit von Topoisomerase I die superhelikale Dichte von SV40 Minichromosomen. Es stellte sich heraus, dass die Anzahl der durch die Nukleosomen entstandenen negativen Supercoils durch DEK verringert wird. Eine Veränderung der Topologie von proteinfreier DNA dagegen konnte nicht detektiert werden.
Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Histone H2A und H2B essenziell für die Bindung von DEK an Minichromosomen sind (Alexiadis et al. 2000).
DEK kann die Topologie von Chromatin, das mit H3/H4-Tetrameren rekonstituiert wurde, nicht mehr verändern. Dagegen haben die flexiblen Arme der Histone keinerlei Bedeutung für die Aktivität von DEK, da die Topologie von trypsinierten Minichromosomen ebenso gut verändert werden kann wie die von unbehandelten Minichromosomen.
Die DEK-Bindung an Minichromosomen verringert darüber hinaus die Zugänglichkeit für Restriktionsenzyme, Mikrokokkennuklease und Replikationsproteine. Auf protein- freier DNA dagegen konnte kein Einfluss von DEK auf die Zugänglichkeit ver- schiedener Faktoren beobachtet werden (Alexiadis et al. 2000).
1.5.3 DEK im RNA-Metabolismus
DEK wurde von anderen Arbeitsgruppen als Bestandteil des Spleißosoms identifiziert. McGarvey et al. (McGarvey et al. 2000) konnten zeigen, dass DEK zusammen mit zwei SR-Proteinen (SR: Serin/Arginin), Hel 117 und Sc35, ko-reinigt.
SR-Proteine gehören zu einer RNA-bindenden Proteinfamilie, die durch verschiedene konservierte Proteindomänen ausgezeichnet ist und in die Regulation des RNA-Spleißens involviert ist (Knippers 2001).
Ein weiterer Hinweis, dass DEK in den RNA-Metabolismus involviert sein könnte, wurde von Le Hir et al. erbracht, indem sie zeigten dass DEK-Antikörper
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Proteinbestandteile des EJC (exon-exon junction complex) zusammen mit gespleißter RNA aus Spleiß-kompetenten Extrakten fällen (Le Hir et al. 2000; Le Hir et al. 2001). Beim EJC handelt es sich um einen Komplex, der nach dem Spleißen 20 bis 24 Nukleotide von der Exon-Exon-Grenze positioniert ist. Er besteht aus den Proteinen SRm160 und RNPS1, die beide in den Prozess des prä-mRNA Spleißens involviert sind (Blencowe et al. 1998; Mayeda et al. 1999; McGarvey et al. 2000), sowie REF und Y14, RNA-Bindeproteine, die am Transport der gespleißten RNA ins Cytoplasma beteiligt sind (Stutz et al. 2000; Zhou et al. 2000). Man vermutet, dass der EJC eine Plattform für die Bindung von mRNA-Exportfaktoren wie TAP/p15 und REF darstellt (Le Hir et al. 2001). Diese Daten beruhen alle auf Immunpräzipitationen mit dem selben Antikörper. In neueren Untersuchungen allerdings, mit anderen Antikörpern, konnte jedoch kein Zusammenhang zwischen DEK und Spleißen gezeigt werden (Lykke-Andersen et al. 2001; Lejeune et al. 2002; Reichert et al.
2002). Mittlerweile wird diskutiert, ob der DEK-Antikörper der ersten Untersuchungen ein anderes Protein des EJC erkannt hat. Tatsächlich kreuzreagiert der DEK- Antikörper mit einem bisher nicht identifizierten Protein von ca. 20 kDa (Reichert et al. 2002). In den Arbeiten von Kappes et al. (Kappes et al. 2001) und McGarvey et al.
(McGarvey et al. 2000) wurden keine Immunpräzipitationen mit diesem DEK- Antikörpern durchgeführt, und dennoch findet sich eine DEK-Population, die an RNA/Proteinstrukturen gebunden ist. Die Funktion dieser DEK-Population bleibt zu ermitteln und ist nicht Bestandteil dieser Arbeit, denn hier ist vor allem die DNA- bindende Eigenschaft von DEK von Interesse.
1.5.4 DEK interagiert mit LANA
In einer anderen Studie wurde ein weiterer potenzieller Interaktionspartner von DEK gefunden (Krithivas et al. 2002). Dabei handelt es sich um das Protein LANA (latency-associated nuclear antigen) des Kaposi´s Sarcoma-assoziiertem Herpesvirusses (KSHV). Die Infektion dieses Virusses ist zunächst latent, wobei sein Genom nicht in das der Wirtszelle integriert ist, sondern sich in einem extrachromosomalen Zustand hält. LANA ist ein 222 bis 234 kDa großes Phosphoprotein, von dem man bereits weiß, dass es für den Erhalt des episomalen Zustandes des Virusgenoms verantwortlich ist. In dieser Arbeit (Krithivas et al. 2002) wird ein Modell diskutiert, in dem LANA über seinen N-Terminus an das Protein MeCP2 (methyl CpG binding protein 2) bindet, das spezifisch in den „linker“-DNA-
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Bereichen an methylierte DNA bindet und über den C-Terminus mit DEK interagiert.
Des Weiteren ist bekannt, dass LANA über eine andere Proteindomäne mit dem viralen Genom in Wechselwirkung tritt. Auf diese Art und Weise könnte LANA die Virus-Episomen an das Wirtschromatin koppeln und somit gewährleisten, dass das virale Genom während des Zellzyklusses immer gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt wird (Krithivas et al. 2002).
1.5.5 DEK und Transkription
1.5.5.1 Daxx als Interaktionspartner
Neben LANA und den Proteinen des RNA-Metabolismus wurde DEK noch in Zusammenhang mit dem Transkriptionssupressor Daxx gefunden (Hollenbach et al.
2002). Bei Daxx handelt es sich um ein Kernprotein, das in allen Geweben und Zelltypen exprimiert wird. Es kommt in drei verschiedenen Formen vor, mit den Molekulargewichten 70 kDa, 97 kDa und 120 kDa, wobei die 120 kDa Form für die phosphorylierte Form des Proteins steht (Hollenbach et al. 1999). Bisher werden für Daxx zwei mögliche Funktionen diskutiert. Zum einen wird Daxx in Zusammenhang mit Apoptose gebracht. Hier wurde gezeigt, dass Daxx mit dem POD-Komplex (promyelocytic leukemia protein (PML) oncogenic domains) interagiert und somit die Fas-abhängige Apoptose unterstützt (Torii et al. 1999; Zhong et al. 2000). Zum anderen wurde Daxx als transkriptioneller Korepressor identifiziert. Auf der Suche nach Interaktionspartnern von Daxx wurde DEK, mit Hilfe von Koreinigungen und Immunfällungen, als Bindungspartner von Daxx identifiziert. Bei weiteren Interaktionspartnern von Daxx handelt es sich um die Histone H2A, H2B, H3, H4 und die Histondeacetylase II (Hollenbach et al. 2002). In diesem Zusammenhang wird ein Modell diskutiert, in dem Daxx über die Transkriptionsfaktoren Pax3 und ETS-1 an aktiv transkribiertes Chromatin rekrutiert wird. Daxx assoziiert darin über die Histone und DEK mit dem Chromatin, woraufhin HADAC II rekrutiert wird und die Histone deacetyliert werden. Die Chromatinstruktur wird dadurch für Transkription verschlossen und Transkriptionsfaktoren können nicht mehr binden (Hollenbach et al. 2002).
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1.5.5.2 AP-2 als Interaktionspartner
Ganz im Gegensatz zu den Untersuchungen mit Daxx (Hollenbach et al. 2002) konnte DEK in einer anderen Studie als Koaktivator der Transkription identifiziert werden (Campillos et al. 2003). Hier wurde DEK als Interaktionspartner des Transkriptionsfaktors AP-2α, einem zelltypspezifischen Protein, das eine Funktion bei der Embryonalentwicklung und bei der Regulation der Apoptose hat, identifiziert.
Die Fähigkeit von AP-2α, den APOE-Promotor zu aktivieren, wird von DEK stark stimuliert. Des Weiteren scheint DEK in diesen Versuchen die Bindung von AP-2α an DNA zu verbessern, während DEK selbst aber nicht an proteinfreie DNA binden kann. Daher wird vermutet, dass DEK die Chromatinstruktur so verändert, dass AP- 2α besser binden kann (Campillos et al. 2003).
1.5.6 DEK-Bindung im Enhancer-Bereich von HIV-2
Während Alexiadis et al. weder eine Bindung des DEK-Proteins an proteinfreie DNA noch eine sequenzabhängige Bindung an Chromatin feststellen konnten, wurde von der Markovitz-Gruppe eine sequenzspezifische-DNA Bindung an Elemente des HIV- 2 Enhancers beobachtet (Fu et al. 1997; Alexiadis et al. 2000; Faulkner et al. 2001).
Ebenso wie HIV-1 kann auch HIV-2 AIDS auslösen, allerdings meist mit einer viel längeren symptomfreien Phase bis zum Ausbruch der Krankheit. Obwohl beide HIV- Arten die Immunschwächekrankheit AIDS verursachen, sind ihre DNA-Sequenzen nur zu ca. 40% homolog (Guyader et al. 1987; Markovitz 1993). Der HIV-2 Enhancer wird im Wesentlichen durch vier Elemente reguliert, zwei Elf-1 Bindestellen, PuB1 und PuB2. Zwischen diesen beiden Stellen liegt ein TG-reiches Element, die sogenannte peri-ets site (pets site). Ein weiteres wichtiges regulatorisches Element ist die Bindestelle für den Transkriptionsfaktor NFκB. DEK wurde als Faktor gefunden, der in Bandshiftexperimenten spezifisch an diese pets-Sequenz bindet, nicht aber an eine mutierte Sequenz. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit wurde geschlossen, dass DEK im phosphorylierten Zustand an die pets-Sequenz im HIV-2 Promotor bindet. Durch eine Aktivierung (durch PKC) der Proteinphosphatase 1 oder 2A (PP1 oder PP2A) wird DEK dephosphoryliert, kann daraufhin nicht mehr an die pets site binden und wird durch einen noch unbekannten Faktor X ausgetauscht. Da ebenso gezeigt wurde, dass eine Überexpression von PP2A die Aktivierung des HIV-
Einleitung 21
2 Promotors zur Folge hat, wird nun vermutet, dass DEK im Enhancer-Bereich von HIV-2 eine Supressorfunktion haben könnte (Faulkner et al. 2001).
Die Daten, die zur Zeit über DEK verfügbar sind, kommen aus den unterschiedlichsten Bereichen und widersprechen sich teilweise erheblich, so wurde DEK zum einen als Transkriptionsrepressor (Fu et al. 1997; Faulkner et al. 2001;
Hollenbach et al. 2002) und zum anderen als Transkriptionsaktivator (Campillos et al.
2003) gefunden. DEK wird sowohl mit RNA-Spleißen (McGarvey et al. 2000) als auch mit DNA-Reparatur (Meyn et al. 1993) in Zusammenhang gebracht. Es ist durchaus denkbar, dass DEK in vivo mehrere Funktionen hat, es könnte aber auch durch eine eher generelle Funktion bei der Aufrechterhaltung oder Veränderung der Chromatinstruktur all diese Prozesse beeinflussen. Zusammengefasst spricht diese Fülle von Daten, ebenso wie die ubiquitäre Verteilung von DEK im Zellkern, für eine Multifunktionalität des Proteins in der Zelle.
Zielsetzung 22
2 Zielsetzung
Das Protooncogen-Protein DEK ist ein ubiquitär exprimiertes Protein, das in allen Eukaryonten außer den Hefen zu finden ist. Außer der SAF-Box, der potentiellen DNA-Bindedomäne, hat DEK keinerlei Homologien zu anderen bekannten Proteinen.
Es kommt in ca. 4–6 x 106 Kopien pro Zelle vor und ist strikt im Zellkern lokalisiert (Kappes et al. 2001). Entdeckt wurde DEK in Zusammenhang mit acuten myeoliden Leukämien. In bestimmten Unterarten dieser Leukämien kommt DEK als Fusionsprotein mit dem Nucleoporin CAN vor (von Lindern et al. 1992).
DEK wurde bisher mit den verschiedensten Prozessen im Zellkern in Verbindung gebracht (Kapitel 1.5), wobei für diese Arbeit vor allem die Diskrepanz bei den Daten der DNA-Bindung von Bedeutung waren. Während Alexiadis et al. eine sequenzunspezifische Bindung ausschließlich an Chromatin beobachteten (Alexiadis et al. 2000), fanden Fu et al. eine sequenzspezifische DNA-Bindung im Enhancerbereich von HIV-2 (Fu et al. 1997). Durch Verwendung verschiedener Substrate sollte die DNA-Bindung charakterisiert werden. Dafür war es zunächst von großer Bedeutung, DEK rekombinant zu exprimieren und zu reinigen.
Es war bekannt, dass DEK die Topologie von SV40 Minichromosomen in Gegenwart von Topoisomerase I verändern kann. Welche Art von Supercoils, positive oder negative, DEK einführt und durch welchen Mechanismus dies geschieht, sollte im Zuge dieser Arbeit aufgeklärt werden.
Darüber hinaus gab es Hinweise darauf, dass DEK die Struktur von SV40 Minichromosomen sehr stark verändert. Dies sollte auch für proteinfreie DNA, falls eine Bindung beobachtet werden kann, mit ausführlichen Sedimentationsanalysen und elektronenmikroskopischer Untersuchungen vertieft werden.
Material und Methoden 23
3 Material und Methoden
3.1 Allgemeine Lösungen
5x TBE 450 mM Tris Base
445 mM Borsäure 10 mM EDTA (pH8) ad 1l mit H2O
4x Tris-Glycin 200 mM Tris
1,53 M Glycin
6x Probenpuffer für Agarosegele 0,25% Bromphenolblau 0,25% Xylencyanol 15% Ficoll
2x Sammelgelpuffer für Laemmligele 0,25 M Tris-HCl pH 6,8 0,2% SDS
1 Spatelspitze Bromphenolblau 5x Trenngelpuffer für Laemmligele 1,875 M Tris-HCl pH 8,8
0,5% SDS
4x Probenpuffer für Laemmligele 200 mM Tris-HCl pH 6,8 8% SDS
40% Glycerin
1,43 M β-Mercaptoethanol 1 Spatelspitze Bromphenolblau Laufpuffer für Laemmligele 247 mM Tris
1,9 M Glycin 0,5% SDS
LB-Medium 10 g Trypton
5 g Hefeextrakt
Material und Methoden 24
10 g NaCl ad 1l mit H2O
2x YT-Medium 16 g Trypton
10 g Hefeextrakt 5 g NaCl
2% Glucose ad 1l mit H2O
PBS 137 mM NaCl
2,7 mM KCl 10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4
TE Puffer 10 mM Tris-HCl pH 8
1 mM EDTA pH 8
nE100 20 mM HEPES-KOH pH 7,6
100 mM NaCl
10 mM Natriumdisulfit 1 mM EDTA pH 8
3.2 Allgemeine Methoden
3.2.1 Denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese
SDS Polyacryamid-Gele wurden nach (Laemmli 1970), modifiziert nach Thoma (Thoma et al. 1979), durchgeführt. Die Prozentigkeit und die Laufdauer sind bei den jeweiligen Versuchen angegeben.
3.2.2 Silber Färbung
Die Silberfärbung von Proteingelen wurde nach Wray et al. (Wray et al. 1981) durchgeführt.
Material und Methoden 25
3.2.3 Comassiefärbung
Die Comassiefärbung wurde mit 0,1% Comassie Blue in 40%Methanol/10%
Essigsäure durchgeführt. Die Entfärbung erfolgte mit 40%Methanol/10% Essigsäure.
3.2.4 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Für native PA-Gele wurde als Gel- und Laufpuffer 1xTBE verwendet. Die Prozentigkeiten und Laufzeiten sind bei den jeweiligen Versuchen angegeben. Die Geldicke betrug 1,5 mm, die Länge des Gels war 15 cm, die Spannung betrug 200 V.
3.2.5 Neutrale Agarose Gelelektrophorese
Zur Analyse von DNA Proben wurde die Methode der Agarose Gelelektrophorese angewandt. Gel- und Laufpuffer waren 0,5x TBE. Für die Topologie Untersuchungen wurden 0,8% Gele verwendet, die mit 2 V/cm für 16 h liefen.
3.2.6 Radioaktive Markierungen
3.2.6.1 Markierung mit -32P dATP
5–10 pmol lineare DNA mit 5´-Überhang wurden mit je 7 mM dGTP, dTTP, dCTP, 20–50 µCi α-32P dATP (Amersham/Pharmacia) und Klenow-Polymerase (10 u, Biolabs) 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz über eine Sepadex G25-Spin-Säule (Roche) von den nicht eingebauten Nukleotiden gereinigt.
Die cpm wurde im Beckmann-Szintillationszähler nach Cherenkov ermittelt.
3.2.6.2 Markierung mir -32PATP
Die linearen DNA-Fragmente mit freiem 5´-Ende wurden mit 10 units T4-PNK im 1x PNK Puffer (Biolabs; 70 mM Tris-HCl pH 7,6; 10 mM MgCl2, 5 mM DTT) und 20–50 µCi γ-32PATP (Amershan/Pharmacia) für 30 min bei 37°C inkubiert. Für die weitere Behandlung siehe 2.4.1.
Material und Methoden 26
3.2.7 DNA-Fällung
Um DNA zu präzipitieren wurde zu den Ansätzen 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumen 100% Ethanol gegeben, gut gemischt und für mindestens 10 min bei –20°C gefällt. Die DNA wurde für 30 min in der Eppendorf-Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit bei 4°C zentrifugiert. Danach erfolgte ein Waschschritt mit 70%-igem Ethanol, die DNA-Pellets wurden im Exikator getrocknet, in 1x Probenpuffer aufgenommen und auf Agarosegelen analysiert.
3.2.8 Proteinfällung nach Wessel-Flügge
Um Proteine zu fällen wurden die Ansätze zuerst auf 1% SDS eingestellt und für 10 min bei 60°C inkubiert um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu zerstören. Dann wurden die Proben mit 1 Volumen 100% Methanol p.a. und _ Volumen 100%
Chloroform versetzt. Nach einer 5 minütigen Zentrifugation (Eppendorf-Zentrifuge) befinden sich die Proteine in der Interphase. Die obere wässrige Phase wurde abgenommen und verworfen. Nun wurde nochmals _ Volumen 100% Methanol zugegeben gut gemischt und wieder für 5 min zentrifugiert, die Pellet wurden 30 min bei 60°C getrocknet und dann in 1x Laemmli Probenpuffer aufgenommen und auf PA-Gelen analysiert (Wessel and Flügge 1984).
3.2.9 Westernblot-Analyse
Für die Durchführung eines Westernblots wurden die Proteine zuerst mit einer PA- Gelelektrophorese aufgetrennt, das Gel wurde dann mittels Semidry-Blotter auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Vor dem Transfer wurden die Filterpapiere und die Membran in Semidry-Puffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 0,037% SDS, 20%
Methanol) getränkt, dann wurde für 1 h bei 0,8 mA/cm2 transferiert. Für die Immunfärbung wurde die Membran 1 h in 1x Rotiblock (Roth) abgesättigt und danach 3x 5 min in TBST-Puffer (20 mM Tris HCl pH 7,6, 137 mM NaCl, 0,1% Tween) gewaschen. Dann erfolgte die einstündige Inkubation mit dem primären Antikörper (α-DEK Serum 1:40000 in TBST), die Membran wurde danach wieder 3x 5 min in TBST gewaschen. Die Inkubation mit dem sekundären Antikörper (α-rabbit (Peroxidase-gekoppelt), 1:10000 in TBST/0,5% Milchpulver) erfolgte ebenfalls für eine Stunde. Danach wurde die Membran 3x 10 min in TBST gewaschen. Der
Material und Methoden 27
Nachweis erfolgte mit dem ECL System von Amersham und wurde durch Röntgenfilme dokumentiert.
3.2.10 Southernblot-Analyse
Für den Nachweis von SV40 DNA mit radioaktiv markierten Sonden wurde SV40 DNA mit dem Restriktionsenzym Hinf II geschnitten und mit α-32PdATP markiert (2.4.1). Zunächst wurde die zu analysierende DNA auf einem Agarosegel aufgetrennt. Das Gel wurde dann 45 min in Puffer 1 (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) und weitere 45 min in Puffer 2 (1 M Tris, 1,5 M NaCl, pH 7) gewaschen. Um die DNA auf eine Nylonmembran zu transferieren wurde die Methode des Kapillartransfers verwendet. Nach dem Transfer in 10x SSC-Puffer (1,5 M NaCl, 150 mM NaCitrat) wurde die Membran 2 min in Puffer 3 (0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2, 1mM EDTA) gewaschen und dann für mindestens 10 min bei 80°C getrocknet. Um die DNA auf der Membran zu fixieren wurde sie für 2 min mit UV-Licht bestrahlt. Nun folgten weitere Waschschritte, 2x 10 min in Puffer 4 (0,2 M NaOH, 1 mM EDTA) und 2x 10 min in Puffer 3. Dann wurde die Membran in eine Hybridisierungsröhre überführt und in Hybridisierungspuffer (7 % SDS, 1 % BSA, 10 mM EDTA, 250 mM Phosphatpuffer pH 7, 2) bei 60°C im Ofen geblockt. Die radioaktiv markierte Hinf II DNA wurde mit 10 ml Hybridisierungspuffer gemischt und auf die Membran gegeben. Die Hybridisierung erfolgte bei 60°C über Nacht. Am nächsten Tag wurde die Membran mehrmals in Waschpuffer (20 mM Phosphatpuffer, 1 mM EDTA, 1 % SDS, 150 mM NaCl) gewaschen. Dann wurde eine Autoradiographie durchgeführt.
3.3 Zellkultur
3.3.1 CV1-Zellen
CV1-Zellen (Zellen der afrikanischen grünen Meerkatze) wurden in 145 mm Petrischalen als Monolayerkulturen in DMEM mit 5% FCS bei 37°C, 94%
Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden alle 2 – 3 Tage mit Trypsin/EDTA von der Platte gelöst und im Verhältnis 1:5 umgesetzt.
Material und Methoden 28
3.3.2 Hi-5 Zellen und SF9 Zellen
Hi-5 (Eizellen aus Trichoplusia ni) und SF9 (Ovarienzellen aus Spodoptera frugiperda) Zellen wurden in Zellkultur Flaschen (Greiner) als Monolayerkulturen in Grace´s Insect Medium (Gibco BRL) mit 10% FCS bei 28°C kultiviert. Die Zellen wurden alle 2 bis 3 Tage vom Flaschenboden abgeklopft und im Verhältnis 1:5 umgesetzt.
3.4 SV40
3.4.1 Präparation von SV40 DNA
Für eine Präparation wurden 10-20 konfluente CV1 Zellen (145 mm Platten) mit Wildtyp SV40 Virus infiziert. Nach 60 h wurde das Medium abgenommen und die Zellen wurden 3-4x mit PBS gewaschen. Dann wurden die Zellen für 20 min mit Hirt- Lösung (10 mM Tris-HCl pH 7, 5; 10 mM EDTA, 0,6% SDS) bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von _ Volumen 5 M NaCl wurden die Hirtüberstände über Nacht bei 4°C gefällt. Danach folgte eine Zentrifugation bei 20000 rpm, SS34, 1 h. Zu den Überständen wurden 0,6 Volumen 100 % Isopropanol gegeben. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (9000 rpm, GS3, 15 min) befindet sich die SV40 DNA im Pellet. Das Pellet wurde daraufhin in 11 ml MOPS-Acetat gelöst. Daraufhin wurde eine Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation durchgeführt. Die CsCl Konzentration im Gradienten war 1g/ml. Nach der Zentrifugation (37000 rpm, 50Ti, 60 h, 18°C) wurde nur die Form I-Bande abgezogen, mit NaCl-gesättigtem Isopropanol wurde das CsCl ausgetauscht. Die DNA wurde 1:2 verdünnt und nochmals gefällt. Die DNA-Konzentration wurde anhand eines Standards auf einem Agarosegel geschätzt oder photometrisch bestimmt (Gruss and Knippers 1995).
3.4.2 Präparation von SV40 Minichromosomen
Für die Reinigung von SV40 Minichromosomen wurden 30 konfluente CV1 Zellen (145 mm Platten) mit Wildtyp SV40 Virus infiziert. Nach 38 h wurden die Zellen 2x mit TSS (20 mM Tris pH 7,8, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 250 mM Sucrose) und dann 2x mit LS (20 mM Hepes KOH, pH 7,8, 5 mM KAc, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT) gewaschen. Die Zellen wurden abgeschabt und in einen 5
Material und Methoden 29
ml Douncer überführt. Nach 6-maligem douncen wurden die Kerne abzentrifugiert (2638 g, 5 min). Die Kerne wurden in 200 µl HS-Puffer (20 mM Hepes KOH, pH 7,8, 500 mM Kalium Acetat, 0,5 mM MgCl2) pro Platte aufgenommen und für 2 h bei 4°C eluiert. Danach wurden die Kerne abzentrifugiert (HB-4, 4000 rpm, 5 min), der Überstand wurde dann nochmals zentrifugiert (SS34, 13000 rpm, 5 min). Dieser zweite Überstand wurde einem RNaseA (100 µg/ml; Roche) Verdau unterzogen. Je 1 ml dieses RNase-behandelten Überstandes wurde über 5%-30%- Sucrosegradienten (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) gereinigt. Für salzgewaschene Minichromosomen wurden 500 mM NaCl, für native Minichromosomen wurden 150 mM zum Sucrosegradienten-Puffer zugegeben. Nach einer 3-stündigen Zentrifugation (SW40, 39000 rpm, 4°C) wurden die Gradienten fraktioniert. Die Fraktionen, die Minichromosomen enthielten, wurden vereinigt und über Nacht pelletiert (SW55, 55000 rpm, 16 h). Die Konzentration der Minichromosomen wurde mittels Standard auf einem Agarosegel bestimmt (Gruss and Knippers 1995).
3.5 Herstellung von kurzen DNA-Fragmenten und der 4WJ DNA
Für die Herstellung der PET- und PETmut-Fragmente wurden Oligos mit entsprechender Sequenz und der reversen Sequenz bei MWG bestellt:
PET: 5´- GAT CCA GCT ATA CTT GGT CAG GGC GAA TTC TAA CTA – 3´
PET mut: 5´- GAT CCA GCT ATA CTA GAT CTG GGC GAA TTC TAA CTA –3´
Die beiden Einzelstränge wurden 1:1 gemischt, auf 100°C erhitzt und dann durch langsames Abkühlen hybridisiert. Die entstandenen Doppelstränge wurden dann mit γ-32PATP radioaktiv markiert (3.2.6.2) und in die Bandshiftanalysen eingesetzt.
Für die Herstellung der 4WJ-DNA und der Kontroll Duplex wurden Oligos mit folgender Sequenz bestellt.
Oligo 1: 5´-CCC TAT AAC CCC TGC ATT GAA TTC CAG TCT GAT AA–3´
Oligo 2: 5´-CTA GTC GTG ATA GGT GCA GGG GTT ATA GGG–3´
Oligo 3: 5´-AAC AGT AGC TCT TAT TCG AGC TCG CGC CCT ATC ACG ACT A-3´
