UNIVERSITÄT KONSTANZ
FACHBEREICH BIOLOGIE
Das Protein DEK im Chromatin menschlicher Zellen
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines
„Doktors der Naturwissenschaften“
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Hong-gang Hu
Konstanz, im Januar 2005
Referenten: Prof Dr. Rolf Knippers
Priv-Doz. Dr. Harald Illges
Termin der mündlichen Prüfung: 18.03.2005
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 2001 bis Dezember 2004 am Lehrstuhl für molekulare Genetik der Universität Konstanz angefertigt.
Neben dem selbstverständlichen Dank an Herrn Prof. Dr. Knippers für die Aufnahme in die Arbeitsgruppe, möchte ich ihm besonders für die direkte Betreuung meiner Arbeit nach dem Wechsel von Dr. Claudia Gruss zu ALTANA Pharma, seine Diskussionsbereitschaft, seine stete Interesse am Fortgang der Arbeit und seine Ermutigung und Unterstützung auch außerhalb des Labors, danken.
Ein ganz großes Dank geht an meine ehemalige Betreuerin Dr. Claudia Gruss für die ständige Unterstützung meiner Arbeit und ihre Diskussionsbereitschaft.
Dr. Harald Illges danke ich für die Bereitstellung der Lymphozyten, seine guten Vorschläge und Diskussionen während meiner Arbeit mit den B-Zellen und auch für seine Bereitschaft als Gutachter diese Dissertation zu beurteilen.
Herzlich bedanken möchte ich mich bei den (ehemaligen) Mitgliedern des DEK-Labors, Ferdinand Kappes, Ingo Scholten, Tanja Waldmann, Nicole Richter und Friederike Knoche, für die angenehme Atmosphäre und die ständige Hilfsbereitschaft.
Dr. Daniel Schaarschmidt, Dr. Christian Keller und Dr. Eva-Maria Ladenburger möchte ich für die Einführung in die Methode des ChIP-Assays danken.
Gedankt sei darüber hinaus allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe für die Hilfsbereitschaft und die freundschaftliche Arbeitsatmosphäre.
Weiterhin möchte ich mich bei der Arbeitsgruppe von Prof. Ullrich für die Benutzung des Light-Cyclers bedanken.
Ein herzliches Dankeschön an Dr. Ferdinand Kappes und Dr. Daniel Schaarschmidt für die kritische Durchsicht des Manuskriptes und ihre angebrachten Korrekturen.
Besonders möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir das Studium in Deutschland überhaupt ermöglicht haben.
Nicht zuletzt möchte ich mich bei meiner Frau Ping und meiner Tochter Qiuyue für ihre Liebe und Unterstützung bedanken.
Konstanz, im Januar 2005
Publikationen
Hong-gang Hu, Harald Illges, Claudia Gruss, and Rolf Knippers (2005). Distribution of the chromatin-protein DEK distinguishes active and inactive CD21/CR2 gene in pre and mature B lymphocytes. International Immunology, 17 (6), in press.
Tanja Waldmann, Ingo Scholten, Ferdinand Kappes, Hong-gang Hu and Rolf Knippers (2004). The DEK protein-an abundant and ubiquitous constituent of mammalian chromatin. Gene, 343, 1-9.
In Vorbereitung:
Hong-gang Hu, Ingo Scholten, Claudia Gruss, and Rolf Knippers (2004). The distribution of the DEK protein in mammalian chromatin.
Abkürzung
A Ampere
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin
ca. zirka
Ci Curie
cpm counts per minute
Da Dalton
DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium
DNA Desoxyribonucleinsäure
ECL Enhanced Chemiluminescence
EDTA Ethylendiamintetraacetat
FCS fötales Kälberserum
g Erdbeschleunigung
l Liter
LB Luria Broth Bakterienmedium
LMW Low Molecular Weight
M Molar
min Minute(n)
NP-40 Nonidetphenylpolyethylglycol
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung
RNA Ribonucleinsäure
rpm rounds per minute, Umdrehungen pro Minute
SDS Natriumdodecylsulfat
SV40 Simian Virus 40
TCA Trichloressigsäure
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
V Volt
Für Maßeinheiten werden als Kurzvorzeichen verwendet:
m milli (10-3)
µ mikro (10-6)
n nano (10-9)
p pico (10-12)
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG...1
1.1 Chromatin... 1
1.1.1 Histone ... 1
1.1.2 Nukleosomen... 3
1.1.3 Organisation von Chromatin... 4
1.2 Modifikation der Chromatinstruktur ... 6
1.2.1 Modifikation der Histone... 7
1.2.1.1 Die N-terminalen Domänen von Kern-Histone... 7
1.2.1.2 Histon-Acetylierung... 8
1.2.2 Nicht-Histon-Proteine: HMG-Proteine ... 9
1.2.2.1 HMGB-Proteine... 10
1.2.2.2 HMGA-Proteine... 10
1.2.2.3 HMGN-Proteine... 11
1.2.3 Chromatin-Remodeling-Komplexe ... 12
1.2.4 Chromatin-Silencer-Proteine ... 12
1.3 Das DEK-Protein ... 13
1.3.1 Allgemein... 13
1.3.2 Lokalisation und DNA-Bindung ... 14
1.3.3 Interaktionspartner von DEK ... 16
1.3.3.1 DEK im RNA-Metabolismus... 16
1.3.3.2 DEK bei der Transkription... 17
1.3.3.3 Interaktion mit LANA... 18
2 ZIELSETZUNG...20
3 MATERIAL UND METHODEN...21
3.1 Allgemeine Lösungen ... 21
3.2 Allgemeine Methoden... 23
3.2.1 Agarose-Gelelektrophorese ... 23
3.2.2 Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung von DNA ... 23
3.2.3 Denaturierende Proteinfällung (Wessel and Flugge, 1984) ... 24
3.2.4 SDS-Gelelektrophorese ... 24
3.2.5 Färbung von Protein-Gelen ... 24
3.2.5.1 Silberfärbung (Wray et al., 1981)... 24
3.2.5.2 Coomassie-Färbung (Sambrook, 1989)... 25
3.2.6 Western-Blot und Immunfärbung ... 26
3.2.6.1 Verwendete Antikörper und ihre Verdünnung... 26
3.3 Zellen und Zellkultur... 27
3.3.1 HeLa-Mel-Zellen ... 27
3.3.2 Prä- und reife B-Zellen ... 27
3.3.3 Hi5-Zellen ... 27
3.4 Expression und Reinigung von His-DEK ... 28
3.4.1 Expression von His-DEK im Baculovirus-Expressionssystem ... 28
3.4.2 Reinigung von His-DEK... 28
3.4.2.1 Reinigung unter denaturierenden Bedingungen... 28
3.4.2.2 Reinigung unter nativen Bedingungen... 29
3.5 Herstellung vom monospezifischen DEK Antikörpern... 30
Inhaltsverzeichnis
3.6 Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP-Assay)... 31
3.6.1 In vivo Crosslinking mit Formaldehyd und Vorbereitung der Nukleoproteinkomplexe (Gohring and Fackelmayer, 1997) ... 31
3.6.2 Chromatin-Immunpräzipitation ... 33
3.6.3 Proteinextraktion aus den Immunpräzipitaten... 34
3.6.4 DNA-Extraktion aus den Immunpräzipitaten ... 34
3.7 Quantitative Real-time PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) ... 34
3.8 Analyse der DEK-assoziierten DNA-Fragmente ... 37
3.8.1 Klonierung ... 37
3.8.2 Transformation ... 38
3.8.3 Sequenzierung ... 38
3.9 RT-PCR ... 38
3.10 Radioaktive Markierung von DNA ... 39
3.11 Bandshiftassay... 39
4 ERGEBNISSE ...40
4.1 Expression und Reinigung von rekombinantem His-DEK ... 40
4.1.1 Denaturiert gereinigtes His-DEK ... 40
4.1.2 Reinigung von nativem His-DEK ... 41
4.2 Herstellung von monospezifischen DEK-Antikörpern... 42
4.3 DEK-Lokalisation auf menschlichen Genen in HeLa-Zellen ... 43
4.3.1 Chromatin-Immunpräzipitation ... 43
4.3.2 Optimierung der ChIP-Bedingungen ... 45
4.3.3 DEK ist auf aktiven und inaktiven Gen-Bereichen lokalisiert ... 46
4.3.3.1 DEK und MCM4 als aktive Gene... 47
4.3.3.2 HBB als Beispiel für ein inaktives Gen... 49
4.3.4 DEK-Lokalisation im TOP1-Gen-Bereich ... 51
4.3.4.1 Die DEK-Anreicherung im Bereich der C4-Region ist verbunden mit der TOP1-Gen- Aktivierung... 53
4.3.4.2 In vitro findet keine bevorzugte Bindung von DEK an das C4-Element des TOP1- Gens statt 57 4.4 DEK-Lokalisation im Bereich des CD21-Gens in B-Zellen ... 62
4.4.1 CD21 ... 62
4.4.2 DEK ist angereichert im Promotor–Bereich des aktiven CD21-Gens ... 64
4.4.3 In Nalm-6 kann die CD21-Expression mit Aza-Deoxycytidine induziert werden ... 67
4.4.4 DEK ist leicht angereichert im Bereich der Promotor-Region des CD21-Gens in Nalm-6-Zellen nach Induktion der CD21-Expression ... 71
4.5 DEK-Lokalisation am Chromatin... 73
4.5.1 DEK kolokalisiert mehr mit acetyliertem Histon H4 als mit HP1α... 73
4.5.2 DEK-Klone... 75
5 DISKUSSION ...77
5.1 Die Methode der Wahl: der ChIP-Assay ... 77
5.2 DEK im Chromatin ... 79
5.2.1 DEK ist in aktiven und inaktiven Gen-Bereichen lokalisiert ... 80
5.2.2 DEK-Verteilung im Bereich des TOP1-Gens ... 81
5.2.3 DEK mit CD21-Gen ... 83
5.2.4 DEK-Lokalisation im Genom ... 84
Inhaltsverzeichnis
5.3 DEK - ein neues Architektur-Protein? ... 86
6 ZUSAMMENFASSUNG ...89 7 LITERATUR ...90
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1 Struktur der Histone...3
Abbildung 1.2 Schematische Darstellung des Nukleosoms...4
Abbildung 1.3 DNA-Verpackung und Organisationsstufen des Chromatins...6
Abbildung 1.4 Modifikationsstellen auf die Histone...7
Abbildung 1.5 Schematische Darstellung des DEK-Proteins mit seinen bisher bekannten funktionellen Bereichen...14
Abbildung 4.1 Reinigung von His-DEK unter denaturierenden Bedingungen ...41
Abbildung 4.2 Reinigung von His-DEK unter nativen Bedingungen...42
Abbildung 4.3 Gereinigte monospezifische DEK-Antikörper...43
Abbildung 4.4 Chromatin-Immunpräzipitation...44
Abbildung 4.5 Optimierung der ChIP-Bedingungen...46
Abbildung 4.6 DEK-Lokalisation im Bereich des DEK- und MCM4-Gens...49
Abbildung 4.7 DEK-Lokalisation im HBB-Gen-Bereich...50
Abbildung 4.8 DEK-Lokalisation im Bereich des TOP1-Gens...52
Abbildung 4.9 Behandlung der HeLa-Zellen mit 100 µg/ml α-Amanitin...55
Abbildung 4.10 Inhibition der Transkription des c-Myc-Gens durch α-Amanitin...56
Abbildung 4.11 DEK-Anreicherung auf dem aktiven und inaktiven TOP1-Gen...57
Abbildung 4.12 Analyse der PCR-Produkte für den Bandshift-Assay...58
Abbildung 4.13 Bandshift-Assay mit den DNA-Fragmenten C2, P, C4, In2 und M1 im Bereich des TOP1- Gens...59
Abbildung 4.14 Kompetitionsanalyse mit dem C4-Fragment...60
Abbildung 4.15 Eine mögliche kruziforme Struktur innerhalb des C4-Fragmentes...61
Abbildung 4.16 Schematische Darstellung des CD21-Gens...63
Abbildung 4.17 DEK in B-Lymphozyten...65
Abbildung 4.18 DEK-Bindung im Bereich des CD21-Gens in B-Zellen...66
Abbildung 4.19 Behandlung von Nalm-6-Zellen mit TSA...69
Abbildung 4.20 Behandlung der Nalm-6-Zellen mit 4 µM Aza-dc...71
Abbildung 4.21 DEK-Bindung im Bereich des CD21-Gens in unbehandelten und Aza-dc behandelten Nalm-6- Zellen...72
Abbildung 4.22 DEK-Kolokalisation mit AcH4 und HP1α...74
1. Einleitung
1. Einleitung
1.1 Chromatin
Das menschliche diploide Genom ist 3 x 109 Basenpaare groß. Diese insgesamt fast 2 m lange DNA liegt in einem Zellkern von 10 µm Durchmesser in einer hoch organisierten Art und Weise kompaktiert vor. In vivo ist die DNA der Eukaryoten kein
„nacktes“ Molekül, sondern ist mit einer Vielzahl von Proteinen von unterschiedlicher Funktion assoziiert. Diese Proteine machen in etwa die zweifache Masse der DNA aus.
Sie bestehen aus den Histonen, die zur Verpackung der DNA dienen, und einer weiteren Kollektion von Nicht-Histon-Chromatinproteinen, zu denen die HMG-Proteine (high mobility group), Topoisomerasen, RNA-Polymerasen und weitere Faktoren des Transkriptionsapparates gehören. Dieser im Interphasekern anfärbbare Protein-DNA- Komplex wird als Chromatin bezeichnet (Flemming, 1880) und stellt die Interphaseform des genetischen Materials in einem Zellkern dar. Das Chromatin kommt in zwei morphologisch unterscheidbaren Zuständen im Interphasekern vor. Die kondensierten und auffällig anfärbbaren Elemente nannte Emil Heitz Heterochromatin im Gegensatz zu dem weniger stark anfärbbaren, aufgelockerten Euchromatin (Heitz, 1928).
Euchromatin ist zur Transkription fähig, wohingegen stark kondensiertes Heterochromatin genetisch inaktiv ist.
Der Grundbaustein von Chromatin ist das Nukleosom. Dieses besteht aus den Histonen und DNA mit einer Länge von 165-245 bp.
1.1.1 Histone
Es gibt fünf Histonarten, Histon H1, H2A, H2B, H3 und H4, wobei Histon H1 als Linker- Histon und die anderen Histone als Kern-Histone bezeichnet werden. In Hefezellen fehlt das Histon H1. Die mRNA von Histonen hat keinen poly-A Schwanz.
Die Kern-Histone haben alle eine ähnliche Struktur bestehend aus einer basischen N- terminalen Domäne, einer zentralen globulären Domäne und oft auch einem C- terminalen Schwanz. Das Linker-Histon H1 hat eine tripartite Struktur, die aus einer zentralen Domäne und Lysin-reichen N- und C-terminalen Domänen besteht (Abbildung 1.1). Die Histone sind kleine basische Proteine mit einem relativ großen
1. Einleitung
Anteil an basischen, positiv geladenen Aminosäuren (Arginin und Lysin). Diese Aminosäuren kommen vor allem in den N- und C-terminalen Bereichen vor, welche bevorzugt posttranslational modifiziert werden, u.a. durch Phosphorylierung, Acetylierung, Methylierung und Ubiquitinierung. Die Interaktion zwischen den Histonen und der DNA erfolgt über Arginin-Reste, die eine elektrostatische Wechselwirkung mit dem Phosphatrückgrat der DNA-Doppelhelix eingehen (Luger et al., 1997; Wolffe, 1995).
Die Histone sind hoch konservierte Proteine, wobei die Histone H3 und H4 die am stärksten konservierten Histone sind. Zwischen Tier- und Pflanzenzellen unterscheiden sich H3 nur an 4 und H4 nur an 2 Stellen. H3 besteht aus 135 und H4 aus 102 Aminosäuren und beide Proteine besitzen einen hohen Anteil an Arginin (13% bzw.
14%). Sie haben eine zentrale globuläre Domäne mit vielen hydrophoben Aminosäuren und eine hydrophile N-terminale Domäne.
H2A besteht aus 129 und H2B aus 125 Aminosäuren. Im Vergleich zu H3 und H4 haben sie einen höheren Anteil an Lysin (11% bzw. 16%) und einen niedrigeren Konservierungsgrad. Ihr C-Terminus hat einen hydrophilen Charakter.
H1 ist das am wenigsten konservierte Histon. Es besteht aus ca. 215 Aminosäuren mit einer globulären zentralen Domäne und je einer N-terminalen und C-terminalen Domäne. H1 hat einen sehr hohen Anteil an Lysin (29%).
1. Einleitung
Abbildung 1.1 Struktur der Histone
Alle Histone bestehen aus einer zentralen globulären Domäne und flexiblen Armen mit vielen positiv geladenen Aminosäuren: R: Arginin; K: Lysin; ● andere Aminosäure; N: aminoterminales Ende. Die Histone H2A und H2B lagern sich als Dimere, die Histone H3 und H4 als Tetramere zusammen (Gruss and Knippers, 1996).
1.1.2 Nukleosomen
Ein Nukleosom besteht aus einem zwischen 165 bis 245 Basenpaaren langen DNA- Stück und den Histonen. Die DNA legt sich mit einer Länge von etwa 165 Basenpaaren in zwei vollen Windungen um ein Histon-Oktamer aus zwei Molekülen der Histone H2A und H2B, die zwei H2A/H2B-Dimere beiderseits bilden, und zwei Molekülen H3 und H4, die ein H3/H4-Tetramer im Zentrum bilden, herum (Abbildung 1.2). Am Beginn und am Ende der Windungen wird die DNA über jeweils 10 Basenpaare durch ein weiteres Histon, das Linker-Histon H1, stabilisiert. Diese Struktur wird als Chromatosom bezeichnet. Die für jeden Zelltyp charakteristisch überstehende DNA (0-80 Basenpaare) verbindet banachbarte Chromatosomen und wird daher Linker-DNA genannt. Mit Mikrokokkus-Nuklease kann die Linker-DNA eines Nukleosoms abgebaut werden, so dass nur das Chromatosom übrig bleibt. Nach Entfernung des Histons H1 können auch die durch H1 geschützten 2 x 10 Basenpaare enzymatisch entfernt werden. Es bleibt
1. Einleitung
dann der sogenannte Nukleosomen-Kern übrig, der aus dem Histon-Oktamer und einem DNA-Stück von 146 Basenpaaren besteht. Hier windet sich die DNA nur noch in 1.75 Umdrehungen um das Histon-Oktamer. Die Struktur des Nukleosomen-Kerns ist bei allen Organismen gleich.
A B
Abbildung 1.2 Schematische Darstellung des Nukleosoms
(A) Nukleosom-Kern. Die DNA ist in diesem Model als Schlauch dargestellt, der in etwa 1.75 Windungen um das Histon-Oktamer gewunden ist. Im Zentrum des Histon-Oktamers liegt das Histon H3/H4-Tetramer, beiderseits angelagert die Histon H2A/H2B-Dimere. Abmessungen: Durchmesser (von links nach rechts): 10-11 nm, Höhe ca. 5 nm (Kornberg and Klug, 1981).
(B) Modell des Nukleosoms. Im Vergleich zum Nukleosom-Kern enthält ein vollständiges Nukleosom das Linker- Histon H1 und ein DNA-Stück von etwa 200 Basenpaaren, das sich zweimal um das Histon-Oktamer windet. Die Eintritt- und Austrittstelle der DNA wird durch das Histon H1 zusammengehalten (Knippers, 1995).
1.1.3 Organisation von Chromatin
Das Histon H1 spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Aufrechterhaltung höherer Chromatinstrukturen. Die unterste Organisationsstufe ist die Verpackung der DNA in Nukleosomen, die sogenannte 10 nm-Faser, in der die Nukleosomen wie Perlen auf einer Kette angeordnet sind. Dies führt zu einer etwa siebenfachen Kondensierung der DNA im Vergleich zu proteinfreier DNA (Abbildung. 1.3). Mittels Elektronenmikroskopie kann diese Struktur unter Niedrigsalz-Bedingungen (0.1 mM NaCl, pH 7.0) und in Abwesenheit von bivalenten Kationen beobachtet werden.
1. Einleitung
Eine weitere Kondensierung der DNA um den Faktor 6 wird durch die schraubenförmige Verdrillung der 10 nm-Faser unter Mithilfe des Histons H1 erreicht. Der Durchmesser ist von der Anzahl der Nukleosomen pro Windung bzw. der Länge der Linker-DNA abhängig und beträgt in etwa 30 nm. Diese Chromatinfaser wird daher als 30 nm-Faser bezeichnet. Für die schraubenförmige Anordnung der Nukleosomen in der 30 nm-Faser werden verschiedene Modelle vorgeschlagen. Bevorzugt ist das Solenoid-Modell, in dem die Chromatosomen durch Biegung der Linker-DNA aneinander gebracht werden und die entstandene Kette dann schraubenförmig aufgewunden wird. Die Kette enthält 6-8 Nukleosomen pro Drehung. Histon H1 befindet sich im Inneren der Helix (Graziano et al., 1994) (Abbildung. 1.3). In dieser zweiten Organisationsstufe liegt die DNA 40- fach verdichtet vor.
Die 30 nm-Fasern sind weiter schleifenförmig angeordnet und über spezifische DNA- Regionen (SAR- oder MAR-Element) an die Kern-Matrix gebunden. Die dazwischen liegenden Chromatinbereiche ragen schleifenförmig ins Zellkernlumen hinein (Gasser et al., 1989; Paulson and Laemmli, 1977) (Abbildung 1.3), wodurch die DNA nochmal eine Verdichtung um den Faktor 600-800 erfährt.
Die Chromatinschleifen werden weiter verpackt. Nach einem vorgeschlagenen Modell bilden sechs verdrillte Chromatinschleifen eine Rosette, die das Grundelement der 300 nm-Faser darstellt. Damit ist die vierte Stufe der DNA-Verpackung erreicht. Eine schraubige Aufwindung der 300 nm-Faser mit etwa 30 Rosetten pro Windung führt schließlich zur letzten Stufe, die lichtmikroskopisch sichtbaren Chromatiden (Filipski et al., 1990; Pienta and Coffey, 1984).
1. Einleitung
Abbildung 1.3 DNA-Verpackung und Organisationsstufen des Chromatins
Darstellung der verschiedenen Verpackungsstufen ausgehend von proteinfreier DNA bis hin zum Metaphase- chromosom (Erklärung siehe Text) (Alberts, 1997).
1.2 Modifikation der Chromatinstruktur
Chromatin ist eine hoch dynamische Struktur. Für die Prozesse wie Replikation und Transkription wird die DNA im Chromatin durch mehrere Mechanismen zugänglich gemacht. Im Gegensatz dazu existieren auch Mechanismen, die DNA für viele Prozesse unzugänglich machen. Die Chromatinstruktur kann z.B. durch Modifikation der Histone, durch Assoziation mit Nicht-Histon-Proteinen, durch Chromatin- Remodeling-Komplexe und durch Chromatin-Silencer-Proteine verändert werden.
1. Einleitung
1.2.1 Modifikation der Histone
Es gibt eine Reihe von Modifikationen an den Histonen, die in vivo beobachtet werden können. Dazu gehören die Acetylierung, die Phosphorylierung, die Methylierung, die Ubiquitinierung und die ADP-Ribosylierung (Abbildung 1.4). Ziele der meisten Modifikation sind die N-terminalen Domänen der Kern-Histone mit der Ausnahme der Histon-Ubiquitinierung.
Abbildung 1.4 Modifikationsstellen auf die Histone
Die hier gezeigten Modifikationen sind Acetylierung (Ac), Methylierung (Me), Phosphorylierung (P) und Ubiquitinierung (Ub) (Spencer and Davie, 1999).
1.2.1.1 Die N-terminalen Domänen von Kern-Histone
Die Länge der N-terminalen Histon-Domänen variiert von 16 bis 44 Aminosäuren (H3, 44 Aminosäuren; H4, 26 Aminosäuren; H2B, 32 Aminosäuren; H2A, 16 Aminosäuren), wobei die N-terminalen Domänen der Kern-Histonen an der Interaktion mit anderen Histonen und Nicht-Histon-Proteinen beteiligt sind. Die N-terminale Domäne von H4 (K16 zu N25) bindet an das H2A-H2B-Dimer des Nachbar-Nukleosoms. Diese Interaktion könnte bei der Faltung der Chromatin-Faser helfen und an der Nukleosom- Positionierung beteiligt sein (Lenfant et al., 1996; Luger et al., 1997). Dieser Bereich von H4 aus Hefe hat auch eine wichtige Rolle bei der Telomer-Stillegung (Fisher- Adams and Grunstein, 1995). Nicht-Histon-Proteine können mit den N-terminalen
1. Einleitung
Domänen des H3 und/oder H4 interagieren. Dadurch entsteht eine transkriptionell aktive oder inaktive Chromatin-Struktur. HMG-14 und -17 (neue Nomenklatur:
HMGN1/2) können an die Nukleosomen binden, die Chromatin-Faser in eine höhere Ordnung bringen und die Transkription erleichtern (Spencer and Davie, 1999). Die C- terminale Domäne des HMG-14 (HMGN1), die an der Auffaltung der Chromatin-Struktur beteiligt ist, bindet an die N-terminale Domänen von H3 (Aminosäure-Rest 20-50) (Trieschmann et al., 1998). In Hefe können die N-terminalen Domänen von H3 und H4 an die Repressoren Sir3 und Sir4 binden. Dies führt zur Formation einer transkriptionell repressiven Chromatin-Domäne (Grunstein, 1998). Die N-terminalen Domänen von H3 und H4 aus Hefe können auch an den Repressor Ssn6/Tup1 binden (Edmondson et al., 1996).
1.2.1.2 Histon-Acetylierung
Die am intensivsten untersuchte posttranslationale Modifikation der Kern-Histone ist die Acetylierung. Die Kern-Histone werden an bis zu fünf Stellen an spezifischen ε- Lysinseitenketten ihrer N-terminalen Domänen reversibel acetyliert. Normalerweise sind hyperacetylierte Histone mit transkriptionell aktivem Chromatin und hypoacetylierte Histone mit inaktivem Chromatin assoziiert. Zusätzlich ist die Acetylierung der Histone auch an Prozessen wie Replikation, Chromatin-Verpackung und an der Interaktionen von Nicht-Histon-Proteinen mit Nukleosomen beteiligt (Grant and Berger, 1999).
Jede eingeführte Acetylgruppe neutralisiert eine positive Ladung. Dies kann somit die Wechselwirkung zwischen Histonen und DNA schwächen, die Interaktion zwischen Histonen benachbarer Nukleosomen und die Interaktion von Histonen und anderen regulatorischen Elementen verändern (Grant and Berger, 1999; Roth et al., 2001).
Dadurch könnten die Transkriptionsfaktoren einen besseren Zugang zu diesen Bereichen bekommen. Die Histonacetylierung könnte mit der Transkription von Chromatin zusammenhängen (Spencer and Davie, 1999).
Histon-Acetylierung ist ein dynamischer Prozess, wobei der Acetylierungszustand des Chromatins durch die beiden Enzym-Familien Histon-Acetyltransferase (HAT) und Histon-Deacetylase (HDAC) reguliert wird. Eine Reihe von Transkriptionskoaktivatoren wurden als Histon-Acetyltransferasen identifiziert (Armstrong and Emerson, 1998;
Brownell et al., 1996; Grant and Berger, 1999). Im Gegensatz dazu, üben viele Histon- Deacetylasen einen hemmenden Effekt auf die Transkription aus (Imai et al., 2000; Wu
1. Einleitung
and Grunstein, 2000). Mit dieser Beobachtung konnte ein Zusammenhang zwischen der Modifikation der Chromatinstruktur und dem Transkriptionsvorgang hergestellt werden.
1.2.2 Nicht-Histon-Proteine: HMG-Proteine
Eine weitere Möglichkeit, die Chromatinstruktur zu beeinflussen, ist die Einlagerung von Nicht-Histon-Proteinen in das Chromatin. Unter den Nicht-Histon-Proteinen kommen die HMG (high mobility group)-Proteine am häufigsten in den Zellkernen aller höheren Eukaryoten vor. Sie werden in drei Familien eingeteilt, nämlich HMGB (alter Name:
HMG-1/-2), HMGN (alter Name: HMG-14/-17) und HMGA (alter Name: HMG-I/Y/C). Sie haben Molekulargewichte zwischen 10 kDa und 20 kDa, einen hohen Anteil an geladenen Aminosäuren und eine assymetrische Ladungsverteilung (Bianchi, 1995;
Bustin et al., 1990; Bustin and Reeves, 1996), wodurch sie sowohl an negativ geladene DNA als auch an positiv geladene Proteine binden können.
Jede Familie von HMG-Proteinen hat ein charakteristisches funktionelles Sequenz- Motiv. Diese Sequenz-Motive sind die Hauptinteraktionsstellen zwischen HMG- Proteinen und DNA oder Chromatin. Das funktionelle Motiv von HMGB ist die HMG- Box, HMGN besitzt ein Nukleosomen-Bindemotiv, und ein sogenannter AT-Hook ist das funktionelle Motiv der HMGA-Familie. Alle funktionellen Motive können an spezifische DNA-Strukturen binden, weisen aber nur eine geringe Spezifität für DNA-Sequenzen auf. Alle HMG-Proteine agieren als Architektur-Elemente, die die Struktur von DNA und Chromatin modifizieren können. Die Menge von HMGB-Proteinen in einer Zelle ist ungefähr 10 fach weniger als die von einem Histon, HMGN ist wieder 10 fach weniger als HMGB, und die Menge von HMGA ist 10 fach weniger als die von HMGN (Johns, 1982).
Neben den klassischen HMG-Proteinen wurden die HMG-Motive auch in anderen Kern- Proteinen identifiziert, die mit DNA und Chromatin interagieren (Aravind and Landsman, 1998; Baxevanis and Landsman, 1995; Landsman and Bustin, 1993). Diese Proteine sind Zelltyp-spezifisch, binden die DNA sequenz-spezifisch und besitzen oft neben dem HMG-Motiv noch andere funktionelle Motive.
1. Einleitung
1.2.2.1 HMGB-Proteine
HMGB-Proteine haben zwei verschiedene Domänen: die beiden HMG-Boxen (HMG-1- Domänen) und eine saure C-terminale Domäne. Die beiden für die DNA-Bindung verantwortlichen HMG-Boxen sind homolog gefaltete Domänen von ca. 80 Aminosäuren. Die Struktur der HMG-Box ist mehr konserviert als ihre Aminosäuresequenz (Baxevanis et al., 1995) und wird durch drei α-Helices, die L- förmig gefaltet sind, charakterisiert (Read et al., 1993; Weir et al., 1993). Die HMG-Box bindet an die kleine Rinne der B-Form DNA durch Interkalation, wodurch die kleine Rinne vergrößert und die große Rinne zusammengedrückt wird (Allain et al., 1999;
Cerdan et al., 2001; Thomas, 2001). Dies führt zur Biegung der DNA. Weiterhin binden die HMGB-Proteine bevorzugt an gebogene, verdrehte, supergecoilte und kruziforme DNA in vitro (Teo et al., 1995; Thomas, 2001; Webb and Thomas, 1999). In vivo könnten sie als Architektur-Transkriptionsfaktoren funktionieren. Sie können von sequenz-spezifischen Transkriptionsfaktoren durch Protein-Protein-Interaktion an spezifische Stellen rekrutiert werden, aber ihre präzise Rolle ist noch nicht erschöpfend erklärt. Es könnte sein, dass durch die DNA-Biegung der Kontakt zwischen den Transkriptionsfaktoren und zwischen Transkriptionsfaktor und DNA verbessert wird (Thomas, 2001).
1.2.2.2 HMGA-Proteine
Die HMGA-Proteine binden an die DNA über das sogenannte AT-Hook-Motiv. Sie besitzen drei hintereinanderliegende AT-Hooks. Jeder AT-Hook besteht aus 9 Aminosäuren mit dem unveränderten Tetrapeptid ArgGlyArgPro (RGRP), das auf beiden Seiten von positiv geladenen Aminosäureresten flankiert wird. Über die AT- Hooks binden die HMGA-Proteine an die kleine Rinne AT-reicher DNA (Reeves and Nissen, 1990). Wie HMGB-Proteine binden sie eher struktur- als sequenzspezifisch und bevorzugt an verdrehte DNA-Strukturen. Durch Biegung und Loop-Formation von linearer DNA und Einführung von Supercoils in relaxierte DNA, können die HMGA- Proteine die DNA-Struktur verändern (Bagga et al., 2000; Chase et al., 1999; Nissen and Reeves, 1995).
In vivo können sie auch wie HMGB-Proteine die Transkription beeinflussen. Durch Erleichterung oder Verhinderung der Formation vom „Enhanceosom“ auf dem
1. Einleitung
Promotor-Bereich eines bestimmten Gens können sie zusammen mit anderen Faktoren die Transkription positiv oder negativ regulieren (Bustin and Reeves, 1996; Reeves, 2000; Thanos and Maniatis, 1995). Das am besten untersuchte Modell ist die Bildung eines Enhanceosoms auf dem Virus-induzierbaren menschlichen ß-Interferon (IFN-ß) Enhancer, bei dem die HMGA-Proteine die allosterische Veränderung in DNA induzieren, wodurch die Transkriptionsfaktoren NF-κB und ATF-2/c-Jun an den Enhancer rekrutiert werden können (Yie et al., 1999).
Die Expression von HMGA erreicht das höchste Niveau während der Embryonalentwicklung und in rasch proliferierenden Zellen. Aber das Expressionsniveau ist niedrig oder sogar nicht detektierbar in voll differenzierten oder nicht teilenden Zellen und Geweben (Bustin and Reeves, 1996). Fast in jeder Krebsart sind die HMGA-Proteine überexprimiert, daher wird eine Verbindung zwischen HMGA- Überexpression, neoplastischer Transformation und Tumor-Progression postuliert (Reeves and Beckerbauer, 2001).
1.2.2.3 HMGN-Proteine
HMGN-Proteine besitzen drei funktionelle Domänen: die DNA-Bindedmäne am N- Terminus, die Transaktivierungsdomäne am C-Terminus und die zentral liegende Nukleosomen-Bindedomäne (Bustin and Reeves, 1996). Über die Nukleosomen- Bindedomänen binden je zwei HMGN-Proteine, entweder zwei HMGN1 Moleküle oder zwei HMGN2 Moleküle, kooperativ an die Ein- und Austrittsstelle der nukleosomalen DNA (Postnikov et al., 1995). Die Nukleosomen-Bindedomäne besteht aus ca. 30 positiv geladene Aminosäuren mit einem extrem konservierten N-terminalen Bereich und einem C-terminalen Bereich, der mit Lysin- und Prolinresten hoch angereichert ist (Bustin and Reeves, 1996). Aber die Struktur dieser Domäne ist noch nicht bekannt.
Nachdem die HMGN-Proteine über die Nukleosomen-Bindedomänen an Nukleosomen gebunden sind, können sie über die C-terminale Domäne Chromatin dekompaktieren und damit die Transkription und Replikation aktivieren (Ding et al., 1997; Trieschmann et al., 1995).
1. Einleitung
1.2.3 Chromatin-Remodeling-Komplexe
Auch die sogenannten Chromatin-Remodeling-Komplexe können die Chromatinstruktur beeinflussen. Darunter werden Proteinkomplexe zusammengefasst, die ATP-abhängig die Chromatinstruktur so verändern können, dass sich Faktoren besser an die DNA binden können. Chromatin-Remodeling-Komplexe sind aus verschiedenen Organismen gereinigt worden. Diese Multiproteinkomplexe bestehen aus 2 bis 15 Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 0.5 bis 2 MDa und enthalten immer eine ATPase- Untereinheit. Die Chromatin-Remodeling-Komplexe können in vitro die Zugänglichkeit zu nukleosomaler DNA ohne Verlust des Nukleosoms erhöhen und die Position der DNA im Nukleosom verändern, Gleiten des Nukleosoms entlang der DNA verursachen und einen Histon-Oktamer-Transfer zu anderen DNA-Bereichen fördern (Kingston and Narlikar, 1999; Peterson and Workman, 2000).
Der erste gereinigte und charakterisierte Remodeling-Komplex ist der SWI/SNF (switching/sucrose non fermenting)-Komplex aus Hefe (Cairns et al., 1994; Cote et al., 1994). Der SWI/SNF-Komplex aus Hefe hat 11 verschiedene Untereinheiten und ein Molekulargewicht von ~2 MDa. Die SWI- und SNF-Gen-Produkte sind für die Transkription von einer Reihe von Genen verantwortlich.
1.2.4 Chromatin-Silencer-Proteine
Unter Chromatin-Silencing versteht man die langfristige Reprimierung der Genexpression, die mit der regulierten Kompaktierung von Chromatin zu Heterochromatin einhergeht (Hennig, 1999).
Die Bildung heterochromatischer Bereiche im Genom und ihre molekularen Grundlagen sind am besten bei Drosophila melanogaster und Saccharomyces cerevisiae untersucht.
Bei Drosophila melanogaster sind die Polycomb-Proteine (PcG) für die Repression der homeotischen Gene verantwortlich. Die PcG-Proteine interagieren miteinander und bilden Komplexe, die das Chromatin dicht verpacken und damit inhibierend auf die Anlagerung von Transkriptionsfaktoren wirken (Pirrotta, 1998). Die Chromo (chromatin organization modifier)-Domäne der PcR-Proteine ist wichtig für die Interaktion mit Chromatin. HP1 (Heterochromain Protein 1), das in heterochromatischen Bereichen von polytänen Chromosomen vorkommt, enthält ebenfalls eine Chromo-Domäne.
1. Einleitung
Bei Saccharomyces cerevisiae kommen heterochromatische Bereiche an den Telomeren und Genloci, die für den Paarungstypwechsel kodieren, vor. Die kompakte Chromatinstruktur wird durch die Bindung von SIR (silent information regulator)- Proteinen an das Chromatin verursacht. Dabei interagieren die Proteine SIR3 und SIR4 mit den N-terminalen Domänen der Histone H3 und H4. Eine Hyperacetylierung der Histone H3 oder H4 hemmt die SIR-Bindung (Grunstein, 1998).
1.3 Das DEK-Protein
1.3.1 Allgemein
Das DEK-Protein wurde zuerst in einer Fusion mit dem CAN Nucleoporin-Protein in einer Subform der akuten myeloiden Leukämie identifiziert. Das DEK-CAN Fusionsprodukt entsteht durch eine Chromosomentranslokation des 3’-Breiches des CAN-Gens auf Chromosom 9, auf den 5’-Bereich des DEK-Gens auf Chromosom 6.
Durch diese Translokation t(6;9) (p23;q34) fehlen dem Fusionsprotein 25 Aminosäuren des C-Terminus von DEK und 812 Aminosäuren des N-Terminus von CAN. Dieses Fusionsprotein hat ein Molekulargewicht von 165 kDa (von Lindern et al., 1992).
Darüber hinaus wurde DEK als Autoantigen in verschiedenen menschlichen Autoimmunkrankheiten identifiziert, wie zum Beispiel die juvenile rheumatoide Arthritis (Sierakowska et al., 1993) und dem systemischen Lupus Erythematosus (Dong et al., 1998; Wichmann et al., 1999). Weiterhin wird eine weitaus schwächere DEK- Expression in differenzierten Zellen im Vergleich zu undifferenzierten Zellen beobachtet (Savli et al., 2002). In vielen untersuchten Tumorzellen wird DEK überexprimiert (Casas et al., 2003; Kondoh et al., 1999; Larramendy et al., 2002; Sanchez-Carbayo et al., 2003). Aber bisher gibt es noch keine nachgewiesene direkte Verbindung zwischen DEK-Expression und Tumorentwicklung.
Das menschliche DEK-Gen liegt auf dem kurzen Arm des 6. Chromosoms (6; p23). Mit einer Länge von ca. 40 kb besteht das DEK-Gen aus 11 Exons. Eine CpG-Insel befindet sich rund um den Transkriptionsstart. Der DEK-Promotor enthält eine umgekehrt orientierte CCAAT-Box und eine Bindestelle für den Transkriptionsfaktor YY1 (Ying Yang 1) (Sitwala et al., 2002).
Das DEK-Protein besteht aus 375 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 43 kDa. Man findet DEK in allen untersuchten Säugern, Drosophila und Arabidopsis. Bis
1. Einleitung
jetzt konnten keine Homologien zu anderen bekannten Proteinen gefunden werden.
DEK enthält vier saure Bereiche, die sich jeweils von zwischen den Aminosäuren (aa) 30-49, 228-236, 241-254 und 300-310 erstrecken. Zwischen aa 205-221 befindet sich die potentielle Kernlokalisationssequenz. Weiterhin enthält DEK zwei DNA- Bindedomänen, eine SAP-Box (SAF-A/B Acinus and PIAS) (aa 149-183), ein DNA- Bindemotiv in Chromatin-assoziierten Proteinen (Aravind and Koonin, 2000), und eine zweite DNA-Bindedomäne, die zwischen aa 270-350 liegt (Kappes et al., 2004b) (Abbildung 1.5).
Abbildung 1.5 Schematische Darstellung des DEK-Proteins mit seinen bisher bekannten funktionellen Bereichen.
Die roten Boxen kennzeichnen die vier sauren Bereiche (aa 30-49, 228-236, 241-254 und 300-310), die schwarze Box stellt die NLS (Kernlokalisationssequenz, nuclear localization sequence, aa 205-221) dar. Die beiden DNA- Bindedomänen (aa 87-187 und aa 270-350) sind als Balken und die SAP-Box (aa 149-183) als grüne Box dargestellt (Kappes et al., 2004a; Kappes et al., 2004b).
1.3.2 Lokalisation und DNA-Bindung
DEK ist im Zellkern lokalisiert, weist eine Kopienzahl von > 1 x 106 Moleküle/Hela-Zelle auf und kann mit 250 mM Salz aus Hela-Zellkernen extrahiert werden. Weder die Lokalisation noch die Menge von DEK verändert sich im Verlauf des Zellzyklus.
Immunfluoreszenzanalysen zeigen, dass DEK in allen Stadien der Mitose an Chromatin gebunden ist. Nur ein kleiner Anteil von DEK ist mit RNA-Strukturen assoziiert (Kappes et al., 2001). DEK kann von der Protein-Kinase CK2 und der Protein-Kinase C (PKC) phosphoryliert werden. Darunter ist die CK2 für die Hauptphosphorylierung von DEK verantwortlich. In der G1-Phase des Zellzyklus ist DEK stärker phosphoryliert als in anderen Zellzyklusphasen (Kappes et al., 2004a).
1. Einleitung
Die Bindung von DEK an Chromatin in vitro wurde in mehreren Arbeiten gut charakterisiert (Alexiadis et al., 2000; Waldmann et al., 2002). In Anwesenheit von Topoisomerase I kann DEK die superhelikale Dichte von SV40 Minichromosomen verändern. Es stellte sich heraus, dass die Anzahl der durch die Nukleosomen entstandenen negativen Supercoils durch DEK verringert wird. Die Bindung von DEK an Minichromosomen verringert die Zugänglichkeit für Restriktionsenzyme und Replikationsproteine. Dadurch kann die Replikationseffizienz von SV40 Minichromosomen reduziert werden (Alexiadis et al., 2000). Weiterhin wurde gefunden, dass DEK die Topologie von sowohl Minichromosomen als auch von proteinfreier DNA durch Einführung von positiven Supercoils verändern kann (Waldmann et al., 2002).
Neben dem zentral gelegenen DNA-Bindemotiv SAP-Box hat DEK noch eine zweite DNA-Bindedomäne zwischen aa 270-350 (Kappes et al., 2004b). In vitro ist die DNA- Bindungsaktivität dieser Domäne abhängig vom Phosphorylierungszustand. Im phosphorylierten Zustand kann diese Domäne nicht an DNA binden. Nur wenn DEK dephosphoryliert ist, kann sie an DNA binden (Kappes et al., 2004b).
In einer Arbeit von Fu (Fu et al., 1997) wurde DEK als sequenzspezifisches DNA- Bindeprotein identifiziert. DEK kann spezifisch an das peri-ets (pets) Element im Enhancer von HIV-2 binden. Das pets Element ist ein TG-reiches Element (TTGGTCAGGG) und liegt zwischen zwei Bindestellen für den Transkriptionsaktivator Elf-1. Weiterhin könnte DEK in phosphorylierter Form ans pets Element binden und als ein Transkriptionsrepressor funktionieren. Nach der Dephosphorylierung könnte DEK durch einen anderen Faktor ersetzt werden und die Transkription eingeleitet werden (Faulkner et al., 2001). In weiteren Arbeiten dieses Laboratoriums wurde gezeigt, dass DEK sequenzspezifisch an die konservierte Y-Box-Sequenz der MHC-Klasse II Promotoren binden kann (Adams et al., 2003).
Im Gegensatz dazu konnten in identischen Experimenten von Waldmann (Waldmann et al., 2003) keine Sequenzspezifität gefunden werden. Jedoch konnte anschaulich gezeigt werden, dass DEK eher strukturspezifisch als sequenzspezifisch an DNA bindet, was sich in der bevorzugten Bindung von DEK an kruziforme und supergecoilte DNA widerspiegelt.
1. Einleitung
1.3.3 Interaktionspartner von DEK
Mit Hilfe des „Two-hybrid systems“ wurde gezeigt, dass DEK mit sich selber interagieren kann, was die Vermutung nahe legt, dass DEK zur Ausbildung von Homodimeren oder Homomultimeren neigt. Die Di- oder Multimerisierungsdomäne wurde mit Hilfe von Far-Western Untersuchungen auf den Bereich zwischen aa 270-350 festgelegt. Diese Domäne wird durch Phosphorylierung reguliert (Kappes et al., 2004a).
In weiteren Arbeiten wurden Interaktionen von DEK mit Proteinen des RNA- Metabolismus, der Transkriptionsregulation und dem viralen Protein LANA gezeigt, die im Folgenden näher erläutert werden.
1.3.3.1 DEK im RNA-Metabolismus
In einer Arbeit von McGarvey (McGarvey et al., 2000) wurde DEK zusammen mit zwei SR-Proteinen (Serine/Arginine-repeat proteins), Hel117 und SC35 gereinigt. SR- Proteine sind Spleißfaktoren mit ein oder zwei N-terminalen RNA-Erkennungsdomänen und einer C-terminalen RS-Domäne (Fu, 1995; Manley and Tacke, 1996). Weiterhin wurde bestätigt, dass DEK mit SR-Proteinen in vitro und in vivo interagiert. Über diese Interaktion kann DEK an das Spleißosom binden. Nach dem Spleißen bleibt DEK noch am Exon-Produkt-Komplex gebunden.
Ein weiterer Hinweis, dass DEK an den RNA-Metabolismus beteiligt sein könnte, wurde von Le Hir (Le Hir et al., 2001; Le Hir et al., 2000) erbracht. Hier wurde DEK über Immunpräzipitation mit DEK-Antikörpern als Bestandteil eines EJC (exon-exon junction complex) identifiziert. Der EJC ist ein Komplex von ca. 335 kDa, der nach dem Spleißen auf mRNA 20 bis 24 Nukleotide aufwärts von der Exon-Exon-Grenze positoniert ist. Er besteht aus mindestens 5 Proteinen: SRm160, DEK, RNPS1, Y14 und REF. Als Spleißaktivatoren sind SRm160 und RNPS1 in den Prozess des prä-mRNA Spleißens involviert (Blencowe et al., 2000; Eldridge et al., 1999; Mayeda et al., 1999). Mit ihrem RNA-Erkennungsmotiv RRM (RNA recognition motif) sind Y14 und REF am Transport der mRNA vom Nukleus ins Cytoplasma beteiligt (Kataoka et al., 2000; Stutz et al., 2000; Zhou et al., 2000). Weiterhin wurde vermutet, dass EJC eine Plattform für die Bindung von Faktoren wie TAP/p15 und REF, die am Export von mRNA beteiligt sind, dargestellt. Jedoch konnte in neueren Untersuchungen mit anderen DEK-Antikörpern kein Zusammenhang zwischen DEK und Spleißen gezeigt werden (Gatfield and
1. Einleitung
Izaurralde, 2002; Lejeune et al., 2002; Lykke-Andersen et al., 2001; Reichert et al., 2002). Es wird diskutiert, ob der DEK Antikörper in den ersten Untersuchungen auch ein anderes Protein im EJC erkannt hat. Tatsächlich kreuzreagiert dieser DEK-Antikörper mit einem noch nicht identifizierten Protein von ca. 20 kDa (Reichert et al., 2002).
In der Arbeit von Kappes (Kappes et al., 2001) wurde jedoch unabhängig von diesem Antikörper eine Assoziation von DEK mit RNA-Protein-Komplexen gezeigt. Die Funktion dieser DEK-Population bleibt weiterhin zu untersuchen.
1.3.3.2 DEK bei der Transkription
Neben der bisher noch nicht geklärten Funktion von DEK im RNA-Metabolismus wurde für DEK von mehreren Autoren auch eine Rolle bei der Transkription, durch die Interaktion mit meheren Faktoren postuliert.
1.3.3.2.1 Interaktion mit Daxx
Zuerst wurde DEK als Interaktionspartner von Daxx identifiziert (Hollenbach et al., 2002). Daxx ist ein Kernprotein, welches in drei verschiedenen Formen mit Molekulargewichten von 70 kDa, 97 kDa und 120 kDa vorkommt, wobei die 120 kDa Form die phosphorylierte Form des Proteins ist. Bisher hat Daxx mindestens zwei identifizierte Funktionen im Nukleus, wovon eine mit der Fas-abhängigen Apoptose zusammenhängt. Hier wurde Daxx als Bestandteil des POD-Komplex (promyelocytic leukemia protein (PML) oncogenic domains) identifiziert. Über diese Interaktion mit PODs wird Daxx mit der Apoptose verbunden (Torii et al., 1999; Villunger et al., 2000;
Zhong et al., 2000). Zweitens wurde Daxx als Transkriptionskorepressor charakterisiert, das die Transkriptionsaktivität von Pax3 und ETS-1, zwei Transkriptionsfaktoren, unterdrücken kann (Hollenbach et al., 1999; Li et al., 2000). Auf der Suche nach Daxx- Interaktionspartnern wurde zuerst gezeigt, dass DEK, zusammen mit HDAC II und acetylierten Histone H4, mit Daxx kofraktionieren. Weiterhin wurde DEK, HDAC II und Kern-Histone (H2A, H2B, H3 und H4) mittels Immunpräzipitation als Bindungspartner von Daxx identifiziert (Hollenbach et al., 2002). Durch diese Befunde wird ein Modell für die transkriptionelle Repressionsaktivität von Daxx aufgestellt, in dem Daxx über die Interaktion mit Transkriptionsfaktoren wie Pax3 und EST-1 auf die Stellen der aktiven Transkription rekrutiert wird. Dort assoziiert Daxx mit acetylierten Kern-Histonen und
1. Einleitung
DEK. Über Daxx wird HDAC II zu diesen Stellen rekrutiert. Als Konsequenz daraus werden die Histone deacetyliert und dadurch die Chromatinstruktur für die Transkription verschlossen (Hollenbach et al., 2002).
1.3.3.2.2 Interaktion mit AP-2α
In einer anderen Studie wurde DEK als Interaktionspartner des Transkriptionsfaktors AP-2α identifiziert. Hier könnte DEK als Koaktivator der Transkription agieren (Campillos et al., 2003). AP-2α bildet zusammen mit drei anderen Proteinen (AP-2ß, AP-2γ und AP-2δ) die Familie der Transkriptionsfaktoren AP-2. AP-2α ist an Prozessen wie Embryonalentwicklung und Apoptose beteiligt (Eilers et al., 1991; Schorle et al., 1996). In der Arbeit wurde die Interaktion von DEK und AP-2 durch Säulenchromatographie gezeigt. Weiterhin kann DEK die Transkriptionsaktivität von AP-2α auf den APOE-Promotor stimulieren. In vitro konnte gezeigt werden, dass DEK die Bindung von AP-2α an DNA stimuliert, ohne selbst an DNA zu binden. Dies lässt die Vermutung zu, dass DEK die Chromatinstruktur so verändert, dass AP-2α besser daran binden und sich dadurch die Transkriptionsaktivität erhöhen könnte (Campillos et al., 2003).
1.3.3.3 Interaktion mit LANA
In einer Arbeit von Krithivas (Krithivas et al., 2002) wurde das LANA-Protein (latency- associated nuclear antigen) des Kaposi’s Sarcoma-assoziierten Herpesviruses (KSHV) als ein weiterer Interaktionspartner von DEK identifiziert. Die Infektion des KSHV ist zunächst latent, wobei sein Genom in einigen Kopien als Episom im Nukleus der infizierten Zelle erhalten bleibt. LANA ist ein 222 bis 234 kDa großes Phosphoprotein mit einer N-terminalen und C-terminalen Domäne (Kedes et al., 1997; Rainbow et al., 1997). LANA kann sowohl als Transkriptionsrepressor über die Interaktion mit HDAC, als auch als Transkriptionsaktivator funktionieren (An et al., 2002; Knight et al., 2001;
Krithivas et al., 2000; Schwam et al., 2000). LANA ist in allen KSHV-infizierten Zellen exprimiert. Es bindet am terminalen TR-Bereich des KSHV Genoms und koppelt das virale Genom an das Wirtchromosom (Ballestas and Kaye, 2001; Piolot et al., 2001;
Szekely et al., 1999). In der Arbeit wurde gezeigt, dass LANA mit zwei Chromatin- bindenden Proteinen, methyliertes CpG-Bindeprotein MeCP2 und DEK, interagiert,
1. Einleitung
wobei die MeCP2-Bindedomäne am N-Terminus und DEK-Bindedomäne zwischen aa 986 zu 1043 am C-Terminus liegt. Die Daten zeigen, dass LANA an die Wirtchromosomen über zwei unabhängige Chromatin-Bindedomänen, die mit verschieden Chromatin-bindenden Proteinen interagieren können, gekoppelt ist (Krithivas et al., 2002).
Die Daten, die zur Zeit über DEK verfügbar sind, bringen DEK sowohl mit der Transkription (Campillos et al., 2003; Hollenbach et al., 2002) als auch mit dem RNA- Metabolismus (McGarvey et al., 2000) in Verbindung. So wäre es möglich, dass DEK in vivo mehr Funktionen ausübt. Es könnte aber auch sein, dass DEK eine generelle Funktion hat, in dem es über seine DNA- und Chromatin-Bindungseigenschaften die Chromatinstruktur so verändert, dass es alle diesen Prozesse beeinflussen könnte.
Zusammengefasst deuten die Daten darauf hin, dass DEK hinsichtlich seiner Chromatin-, DNA- und RNA-Bindefähigkeit ein multifunktionelles Protein sein könnte.
2. Zielsetzung
2 Zielsetzung
Das DEK-Protein wurde als Fusionsprotein mit dem Nukleoporin-Protein CAN in einer Subform der akuten myeloiden Leukämie entdeckt (von Lindern et al., 1992). Mit einer Kopienzahl von > 1 x 106 Moleküle pro Zelle ist DEK ein ubiquitär exprimiertes Protein (Kappes et al., 2001).
DEK ist im Zellkern lokalisiert und bindet hauptsächlich an Chromatin (Kappes et al., 2001). Bisher wurden zwei DNA-Bindedomänen im DEK-Protein identifiziert, eine zentral liegende SAP-Box und eine zweite DNA-Bindedomäne, die zwischen den Aminosäuren 270-350 liegt (Kappes et al., 2004b). In einigen Arbeit wurde DEK als sequenzspezifisches DNA-Bindeprotein identifiziert (Adams et al., 2003; Fu et al., 1997). Im Gegensatz dazu wurde in einer anderen Arbeit gezeigt, dass DEK eher strukturspezifisch als sequenzspezifisch an DNA bindet (Waldmann et al., 2003), durch seine bevorzugte Bindung an kruziforme und supergecoilte DNA. Weiterhin kann DEK in vitro die DNA-Struktur verändern, wobei DEK die Topologie von sowohl Minichromosomen als auch von proteinfreier DNA durch Einführung von positiven Supercoils verändern kann (Alexiadis et al., 2000; Waldmann et al., 2002).
Um einen genaueren Einblick in die DEK-Funktion am Chromatin zu bekommen, sollte in dieser Arbeit die DEK-Lokalisation im Chromatin mittels ChIP-Assays und nachfolgender DNA-Analyse untersucht werden. Mit der Methode der quantitativen PCR sollte die DEK-DNA-Bindung in einigen ausgesuchten Gen-Bereichen, besonders in den regulatorischen Bereichen untersucht werden. Um diese Untersuchung auf das Genom zu erweitern, sollten zum einen Kolokalisationsstudien von DEK mit Markern für aktive und inaktive Gen-Bereiche durchgeführt, zum anderen die DEK-gefällten DNA- Fragmente kloniert, sequenziert und analysiert werden.
3. Material und Methoden
3 Material und Methoden 3.1 Allgemeine Lösungen
Im Folgenden sind alle verwendeten Lösungen aufgelistet, auf die nicht näher eingegangen wird. Spezielle Lösungen werden bei den entsprechenden Methoden aufgeführt.
LB-Medium:
10 g/l NaCl
5 g/l Yeast-Extrakt
10 g/l Bactotrypton
TE:
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
1 mM EDTA, pH 8,0
6 x Probenpuffer für Agarosegele:
15 % Ficoll Type 400
0,25% Bromphenolblau
0,25% Xylene cyanol FF
50 x TAE:
242 g Tris-Base
57,1 ml Essigsäure conc.
100 ml 0.5 M EDTA, pH 8,0 ad 1 l mit H2O bidest
5 X TBE: 450 mM Tris-Base
45 mM Borsäure
10 mM EDTA, pH 8,0
Ad 1l mit H2O bidest
3. Material und Methoden
1 x PBS: 140 mM NaCl
2,7 mM KCl 10 mM Na2HPO4 1,8 mM KH2PO4
4 x Lämmli Probenpuffer für SDS-Polyacrylamid-Gele:
200 mM Tris-HCl, pH 6,8
8 % SDS
40 % Glycerin
0,4 % Bromphenolblau
10 % ß-Mercaptoethanol
5 x Laufpuffer für SDS-Polyacrylamid-Gele:
30 g Tris
144 g Glycin
0,5% SDS
ad 1 l mit bidest H2O (pH darf nicht eingestellt werden)
2 x Sammelgelpuffer für die SDS-Polyacrylamid-Gele :
0,25 M Tris-HCl, pH 6,8
0,2 % SDS
Bromphenolblau (1 Spatelspitze)
5 x Trenngelpuffer für SDS-Polyacrylamid-Gele:
1,875 M Tris-HCl, pH 8,8
0,5 % SDS
Semi-Dry-Puffer für den Western-Transfer:
48 mM Tris-Base 39 mM Glycin 0,037% SDS 20% Methanol
3. Material und Methoden
TBST:
137 mM NaCl
20 mM Tris-HCl, pH 7,6 0,1 % Tween 20
3.2 Allgemeine Methoden
3.2.1 Agarose-GelelektrophoreseMittels Agarose-Geleletrophorese erfolgte die DNA-Analyse. DNA-Proben wurden auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Als Laufpuffer wurde 1 x TAE oder 0,5 X TBE verwendet. Die Gelelektrophorese wurde bei einer Spannung von 90V und einer Laufzeit von ca. 100 min durchgeführt. Die Gele wurden nach der Elektrophorese für 30 min in Ethidiumbromid (0,05 μg/ml) gefärbt, dann für 15 min in Wasser entfärbt und anschließend fotografiert.
3.2.2 Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung von DNA
Zu der DNA-Probe wurde 1/2 Volumen 100% Phenol und ein 1/2 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) gegeben, kurz kräftig durchgemischt und für 5 min in der Eppifuge mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Die obere wässrige Phase, die die DNA enthielt, wurde vorsichtig in ein neues Eppendorfgefäß transferiert. Dazu wurde 1 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol gegeben, kurz kräftig durchgemischt und für 5 min zentrifugiert. Mit der oberen wässrigen Phase wurde die Ethanol-Fällung durchgeführt. Zu dieser Phase wurde 1/10 Volumen Natriumacetat (pH 5,2) zugegeben und kurz durchgemischt. Dazu wurden 2,5 Volumen 100% Ethanol (eiskalt) gegeben, kurz durchgemischt und bei –20°C für 30 min gefällt. Die Probe wurde in der Eppifuge mit maximaler Geschwindigkeit bei 4°C für 20 min zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 500 µl 70% Ethanol gewaschen, bei 4°C für 10 min abzentrifugiert und anschließend im Exikator für 10 min getrocknet gefolgt von einer Resuspendierung in TE-Puffer.
3. Material und Methoden
3.2.3 Denaturierende Proteinfällung (Wessel and Flugge, 1984)
Eine Proteinfällung wurde durchgeführt, um Ionen oder Agenzien, die die Gelelektrophorese stören könnten, zu entfernen oder um die Proteine aus wässrigen Lösungen zu konzentrieren. Für Proben < 500 µl ist die Chloroform/Methanol-Fällung nach Wessel und Flugge (Wessel and Flugge, 1984) die Methode der Wahl.
Zur Probe wurde ein Volumen 100 % Methanol und 1/4 Volumen 100 % Chloroform gegeben und kräftig gemischt. Danach wurde die Probe 5 min in einer Eppifuge bei maximaler Geschwindigkeit abzentrifugiert. Es erfolgte eine Phasentrennung, wobei die Interphase die Proteine enthielt. Die obere Phase wurde vorsichtig abgenommen ohne dabei die Interphase zu berühren. Zu dem Rest wurde 3/4 Volumen 100 % Methanol gegeben, gemischt und erneut für 5 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, das Pellet wurde für ca. 30 min bei 60°C getrocknet und in 1 x Lämmli- Probenpuffer resuspendiert.
3.2.4 SDS-Gelelektrophorese
Die SDS-Gelelektrophorese diente der Analyse von Proteinmischungen und ermöglicht schnelle Molekulargewicht-Bestimmungen. Bei der Polyacrylamid-SDS-Gel- elektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970) werden die einzelne Proteine ihrem Molekulargewicht folgend aufgetrennt. In der Regel wurde ein 12% Trenngel, überschichtet mit einem 4% Sammelgel, benutzt. Die Laufzeit betrug ca. 90 min bei anfangs 20 mA und nach dem Einlaufen der Proben 40 mA.
3.2.5 Färbung von Protein-Gelen
Um die Proteinbanden nachzuweisen, wurden die Gele nach der SDS-PAGE entweder mit Coomassie oder mit Silber gefärbt.
3.2.5.1 Silberfärbung (Wray et al., 1981)
Bei der Siberfärbung bilden die Ag+-Ionen Komplexe mit den Glu-, Asp- und Cys-Resten der Proteine. Formaldehyd reduziert das Ag+ der Komplexe zu Ag. Die Feinheiten
3. Material und Methoden
dieser Reaktion sind noch unbekannt. Der Vorteil der Silberfärbung liegt in ihrer hohen Sensitivität.
Die Plastikschale, die für die Färbung benutzt wurde, musste extrem sauber sein und durfte nur mit Handschuhen angefasst werden.
Das Gel wurde zuerst in 50% Methanol entwässert. Nach einer Stunde wurde die Methanol-Lösung gewechselt und über Nacht weiter inkubiert. Am zweiten Tag wurde die Methanol-Lösung noch einmal gewechselt und für eine weitere Stunde inkubiert.
Danach wurde das Gel in einer frischen Lösung A für 15 min geschwenkt. Das Gel wurde dann in reichlich H2O für 5 min gewässert, mit einem Wechsel von H2O. Nach dem Wässern wurde das Gel in Lösung B gefärbt. Zum Stoppen der Färbung wurde das Gel in 40% Methanol 10% Essigsäure Lösung gebracht.
Lösung A:
1. 0,8 g AgNO3 + 4 ml H2O
2. 387 µl 5 M NaOH + 1,7 ml 25% NH3 (im 100 ml Messzylinder)
Lösung 1 wurde tropfenweise unter Rühren zu Lösung 2 gegeben. Die Lösung wurde mit H2O bidest auf 100 ml aufgefüllt.
Lösung B:
500 µl 1% Citronensäure 50 µl 37% Formaldehyd mit H2O bidest auf 100 ml aufgefüllt.
3.2.5.2 Coomassie-Färbung (Sambrook, 1989)
Das Gel wurde zuerst in der Färbungslösung für 4 Stunden oder über Nacht gefärbt, dann in der Entfärbungslösung für 4 bis 8 Stunden entfärbt. Die Entfärbungslösung wurde drei- oder viermal gewechselt. Nach dem Entfärben konnte das Gel in 20%
Glycerin-Lösung aufbewahrt werden.
Färbungslösung:
40% Methanol
10% Essigsäure
0,2% Coomassie Brilliantblau R250
3. Material und Methoden
Entfärbungslösung:
40% Ethanol
10% Essigsäure
3.2.6 Western-Blot und Immunfärbung
Beim Blotten wurden die Proteine eines SDS-Polyacrylamid-Gels, analog der von Towbin (Towbin et al., 1979) beschriebenen Methode, auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Das Blotten wurde in einer Semi-Dry-Blot-Apparatur der Firma Hoefer mit 0.8 mA/cm2 für eine Stunde durchgeführt. Nach dem Blotten wurde die Membran mit Ponceau-S-Lösung (0,2 % Ponceau-Rot, 5 % Essigsäure) angefärbt, um die Markerproteine zu detektieren. Nach dem Entfärben der Membran in TBST wurde sie eine Stunde in 1 x Rotiblock-Lösung inkubiert, um die restlichen Proteinbindungsstellen abzusättigen. Danach wurde die Membran in TBST 1 x 15 min und 2 x 5 min gewaschen und für eine Stunde mit primärem Antikörper inkubiert. Nach gleichen Waschschritten mit TBST wurde die Membran weiter für eine Stunde mit sekundärem Antikörper (verdünnt in TBST und 0,5 % Magermilchpulver) inkubiert. Nach erneuten Waschgängen mit TBST erfolgte die Nachweisreaktion durch eine Chemilumineszenzreaktion nach Angaben des Herstellers (ECL-System).
3.2.6.1 Verwendete Antikörper und ihre Verdünnung
Primäre Antikörper Verdünnung
α-DEK (Kaninchen, polyklonal) 1:2000 α-DEK (Maus, monoklonal) 1:500 α-SP1 (Kaninchen, polyklonal) 1:1000 α-AcH4 (Kaninchen, polyklonal) 1:1000 α-HP1α (Maus, monoklonal) 1:500
Als sekundäre Antikörper wurden α-Kaninchen und α-Maus Peroxidase-Konjugate verwendet, die in TBST mit 0,5 % Magermilchpulver 1:20000 verdünnt wurden.
3. Material und Methoden
3.3 Zellen und Zellkultur
3.3.1 HeLa-Mel-ZellenMenschliche HeLa-Mel-Zellen sind Epithel-Zellen aus einem Zervixkarzinom.
HeLa-Mel-Zellen wurden auf 145 mm Petrischalen als Monolayerkultur in DMEM (”Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium”) mit 5 % FCS (fötales Kälberserum) in 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit bei 37°C kultiviert. Dem Kulturmedium waren 40 μg/ml Penicillin-G und 80 μg/ml Streptomycin-Sulfat zugesetzt. Die Zellen wurden alle zwei oder drei Tage mit 5 mg/ml EDTA-gepufferten Trypsin (Sigma) von der Oberfläche abgelöst und in einem Verhältnis 1:4 für zwei Tage oder 1:7 für drei Tage umgesetzt.
3.3.2 Prä- und reife B-Zellen
Die menschliche prä-B-Zelllinie Nalm-6 wurde bei 37°C in 5% CO2 in Iscove’s modifizierten DMEM mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin gehalten. Die menschliche reife B-Zellilinie Ramos wurde bei 37°C in 5% CO2 in RPMI1640 mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin and 100 µg/ml Streptomycin kultiviert.
Für 5-Aza-2’-deoxycytidine (Aza-dc) Behandlung wurden Nalm-6-Zellen auf 3,5 x 105/ml verdünnt und wuchsen über Nacht. Frisch vorbereitetes Aza-dc wurde in der Endkonzentration von 4 µM eingesetzt und die Zellen wuchsen für 24, 48 oder 72 h weiter.
3.3.3 Hi5-Zellen
Hi5-Zellen (Eizellen aus Trichoplusia ni) wurden in Zellkultur-Flaschen (Greiner) als Monolayerkulturen in Grace´s Insect Medium (Gibco BRL) mit 10% FCS bei 28°C kultiviert. Die Zellen wurden alle zwei bis drei Tage vom Flaschenboden abgeklopft und im Verhältnis 1:3 für zwei Tage oder 1:5 für drei Tage zur Kultivierung umgesetzt.
3. Material und Methoden
3.4 Expression und Reinigung von His-DEK
3.4.1 Expression von His-DEK im Baculovirus-Expressionssystem
Die Hi-5 Zellen wurden mit rekombinanten, DEK-cDNA haltigen Baculoviren (AcMNPV) infiziert. Die Zellen wurden nach der Infektion für weitere 72 h bei 28°C kultiviert, um His-DEK zu exprimieren.
3.4.2 Reinigung von His-DEK
Zum Ernten der infizierten Hi5-Zellen wurden diese durch Abklopfen vom Flaschenboden gelöst und in ein 50 ml Röhrchen überführt. Die Zellen wurden in der Jouan Zentrifuge bei 400g für 5 min zentrifugiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS konnten die Zellen bei –70°C gelagert werden.
3.4.2.1 Reinigung unter denaturierenden Bedingungen
Die Zellen wurden mit 2 ml Lysepuffer pro große Flasche für 15 min bei Raumtemperatur lysiert und anschließend für 15 min bei 15000 g zentrifugiert. Der Überstand enthält die lösliche Proteine. Je 1 ml Überstand wurde mit 100 µl Ni-NTA- Agarose (mit Lysepuffer äquilibriert) (Qiagen) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, um His-DEK an die Säule zu binden. Nach der Inkubation wurde die Säule mit dem Waschpuffer zweimal gewaschen. Die an der Säule gebundene Proteine wurden dreimal mit je 300 µl Elutionspuffer eluiert. Das gereinigte Protein wurde bei 4°C aufbewahrt.
Lysepuffer: pH 8,0
100 mM NaH2PO4
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
6 M Guanidinium-HCl
0,5 mM MgCl2
10 mM Imidazol
3. Material und Methoden
Waschpuffer: pH 8,0
100 mM NaH2PO4
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
6 M Guanidinium-HCl
0,5 mM MgCl2
10 mM Imidazol
1% NP 40
Elutionspuffer: pH 4,5
100 mM NaH2PO4
10 mM Tris-HCl
6 M Guanidinium-HCl
0,5 mM MgCl2
3.4.2.2 Reinigung unter nativen Bedingungen
Die Lyse erfolgte mit 2 ml Lysepuffer pro große Flasche. Die Ansätze wurden für 30 min auf Eis inkubiert und anschließend für 15 min bei 5000 rpm im HB-4 Rotor zentrifugiert.
Der Überstand enthält natives lösliches Protein. Für 1 ml Überstand wurden 100 µl Ni- NTA-Agarose (Qiagen) mit Lysepuffer äquilibriert. Die Bindung an das Säulenmaterial erfolgte für 1,5 h bei 4°C im Batch-Verfahen. Das Säulenmaterial wurde für 1 min bei 2000 rpm im HB-4 Rotor abzentrifugiert. Danach folgten die Waschschritte, einmal mit 10 Volumen WP-150, einmal mit 10 Volumen WP-300 und einmal mit 10 Volumen WP- 150. Die Elution erfolgte mit Elutionspuffer und zweifachen Säulenvolumen. Bei jeder Reinigung wurde dreimal eluiert. Das gereinigte Protein wurde bei –70°C gelagert.
Lysepuffer:
100 mM Tris-HCl, pH 7,5 150 mM NaCl
0,5 mM MgCl2
5 mM KCl 5 mM Imidazol
1% NP 40
3. Material und Methoden
Waschpuffer-150
50 mM Tris-HCl, pH 7,5 150 mM NaCl
10 mM Imidazol Waschpuffer-300
50 mM Tris-HCl, pH 7,5 300 mM NaCl
10 mM Imidazol Elutionspuffer
100 mM Tris-HCl, pH 7,5 150 mM NaCl
500 mM Imidazol
3.5 Herstellung vom monospezifischen DEK Antikörpern
Die Antikörper wurden aus Kaninchenserum, das mit His-DEK immunisiert wurde, mittels Affinitäts-Säulenchromatographie aufgereinigt.
Zur Reinigung der Antikörper wurde zuerst denaturiertes His-DEK als Antigen an SulfoLink-Säulenmaterial gekoppelt. Dazu wurde ca. 100 µg denaturiertes His-DEK zuerst mit 1M NaOH auf einen pH-Wert von 8,5 und mit 10 X Kopplungspuffer auf 1 X Puffer-Bedingung eingestellt. Mit dem Kopplungspuffer (50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8,5) wurde ca. 400 µl SulfoLink-Material dreimal gewaschen. Anschließend erfolgte die Kopplung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Danach wurde das gekoppelte SulfoLink-Material mit 10 ml 50 mM Cysteinlösung für 30 min blockiert und mit 16 SV (Säulenvolumen) 1M NaCl und H2O gewaschen. Vor der ersten Verwendung dieses SulfoLink-Materials wurde es mit 10 SV 0,1 M Na-Citrat (pH 2,7) und zweimal mit je 10 SV PBS gewaschen.
Das Antiserum wurde auf 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, eingestellt, für 5 min bei 1000 x g abzentrifugiert und der Überstand mit dem Antigen-gekoppelten SulfoLink-Material bei Raumtemperatur über Nacht gerollt. Nach der Antikörperbindung wurde die Säule mit je 20 SV TBST + 1M NaCl, TBST und H2O gewaschen. Die gebundenen Antikörper wurden in zehn Schritten zu je 0.5 SV 0,1 M Na-Citrat (pH 2,7) eluiert. Zur Neutralisierung wurde die entsprechende Menge 1 M Tris-HCl pH 8 in den Fraktions- röhrchen vorgelegt. Die Proteinkonzentration der einzelnen Fraktionen wurde
