5 DISKUSSION
5.2 DEK im Chromatin
5.2.4 DEK-Lokalisation im Genom
Wie vorher schon diskutiert, bindet DEK sowohl an aktive als auch an inaktive Gen-Bereiche. In den meisten hier untersuchten Fällen ist DEK auf den untersuchten Regionen gleichmässig verteilt. DEK ist jeweils in einer Region von zwei Genen, nämlich die C4-Region des TOP1-Gens und die Promotor-Region des CD21-Gens angereichert. Diese Anreicherung könnte mit der Gen-Expression zusammenhängen.
Aber mit der Methode der quantitativen PCR kann die DEK-DNA-Bindung nur in den ausgewählten Regionen untersucht werden. Es kann folglich nicht ausgeschlossen werden, dass DEK in nicht untersuchten Regionen angereichert ist.
Daher wäre es sinnvoll die DEK-Lokalisation in den gesamten aktiven und inaktiven Gen-Bereichen zu untersuchen. Deswegen wurde eine Kolokalisationsanalyse über den ChIP-Assay und eine folgende Protein-Analyse durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass DEK mehr mit acetyliertem Histon H4 als mit HP1α kolokalisiert (Abbildung 4.22A).
Es ist bekannt, dass in aktiven Gen-Bereichen H4 hyperacetyliert vorkommt, wohingegen HP1α als Marker für inaktive Gene dient. So kann man sagen, dass DEK mehr in den aktiven als in den inaktiven Gen-Bereichen lokalisiert ist. Dies entspricht auch den Ergebnissen der quantitativen PCR-Analyse, wo DEK in den Regionen aktiver Gene angereichert ist (Abbildung 4.8 und 4.18). Es bestehen auch weitere Hinweise darauf, dass DEK angereichert in aktiven Chromatinbereichen vorkommt (Kappes et al., 2001). In diesen genannten Studien wurden zum DEK-Nachweis Zellfraktionierungen und Immunfluoreszenzstudien verwendet. So könnte DEK eher eine Funktion in der Gen-Aktivierung haben. Obwohl eine stärkere Kolokalisation von DEK mit acetyliertem H4 als mit HP-1α festgestellt wurde, ist dieses mitgefällte acH4 nur ein kleiner Teil des gesamten acH4. Dieser Befund könnte dadurch erklärt werden, dass jede HeLa-Zelle 4-6 x 106 Moleküle von DEK aufweist. Das entspricht theoretisch 0,25-0,4 DEK-Moleküle pro Nukleosom, wenn DEK gleichmässig auf dem Chromatin verteilt wäre (Kappes et al.,
5. Diskussion
2001). DEK wurde jedoch angereichert in zwei untersuchten aktiven Gen-Regionen vorgefunden. Weiterhin hat DEK die Fähigkeit zu multimerisieren. Wenn DEK als Multimer an Chromatin bindet, könnte dies dazu führen, dass noch weniger DEK an benachbarte transkriptionsaktive Nukleosomen, die durch hyperacetyliertes H4 gekennzeichnet sind, bindet. Deswegen könnte nur ein kleiner Teil des acH4s mit DEK mitgefällt werden.
In einem weiteren Experiment, in dem vernetzte Chromatin-Fragmente mit acH4-Antikörper gefällt wurden, konnte nur ein kleiner Anteil des DEK-Proteins mitgefällt werden, obwohl über 50% des acH4 gefällt wurden (Abbildung 4.22B). HP1α kolokalisiert aber weitaus weniger mit DEK. Insgesamt wurde hier nur eine kleine Portion des DEK-Proteins im aktiven und inaktiven Gen-Bereich lokalisiert vorgefunden.
Die gesamten Gene eines Säugertier-Genoms stellen nur 5% bis 10% der gesamten DNA. Die meiste DNA im Genom liegt daher außerhalb von Genen. Es könnte sein, dass der andere, große Teil von DEK in diesen Bereichen lokalisiert. In diesen nicht-genischen Bereichen befinden sich zahlreiche repetitive DNA-Elemente. Es ist schwierig diese DNA-Elemente über die Methode der quantitativen PCR zu analysieren.
Deswegen wurden die DEK-gefällten DNA-Fragmente kloniert und sequenziert.
Unter 13 zufällig ausgewählten DEK-Klonen ist nur ein Klon in einem Gen lokalisiert (DEK-6). Alle anderen befinden sich in nicht-genischen Bereichen. Einige davon enthalten repetitive Elemente. Es könnte sein, dass der Großteil des DEK-Proteins in dem nicht-genischen Bereich lokalisiert, obwohl bisher noch nicht bekannt ist, ob DEK in diesen Bereichen angereichert ist, oder nur daran bindet, wie in den meisten der hier untersuchten Gen-Regionen. Dafür müssten weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Aber es kann die Aussage getroffen werden, dass DEK nicht nur in genischen Bereichen, sondern auch in nicht-genischen Bereichen lokalisiert. Weiterhin enthalten 11 von 13 Klonen umgekehrte Wiederholungssequenzen. Damit könnten einige stabile kruziforme DNA-Strukturen in vivo ausgebildet werden. Es könnte ein weiterer Hinweis für die preferentielle Bindung von DEK an kruziforme DNA-Strukturen sein. Zusätzlich enthalten 9 von 13 Klonen einen hohen Anteil an AT-Basenpaaren. Dies könnte bemerkenswert sein, weil das SAF-A-Protein über eine SAP-Domäne bevorzugt an AT-reiche Regionen bindet. DEK enthält ebenfalls eine SAP-Domäne, die ein wichtiges DNA-Bindemotiv von DEK darstellt (Kappes et al., 2004b). In dieser Arbeit konnte aber keine bevorzugte DEK-Bindung an AT-reiche Sequenzen in vivo und in vitro nachgewiesen werden (siehe Kapitel 4.3.4).
5. Diskussion
Obwohl DEK angereichert auf Regionen von aktiven Gen-Bereichen vorkommt und diese Anreicherung mit der Gen-Expression verbunden sein könnte, verhält sich DEK anders als ein Transkriptionsfaktor. Als Beispiel dient der Transkriptionsfaktor SP1, der im Promotor-Bereich des TOP1-Gens stark angereichert ist. Diese Anreicherung ist stark reduziert in den direkt daneben liegenden Regionen. An den weiter entfernten Regionen bindet SP1 gar nicht mehr (Keller et al., 2002). Hier zeigt sich eine deutliche Bindungsspezifität des SP1-Proteins. Im Gegensatz dazu bindet DEK an alle untersuchten Gen-Regionen und auch an die nicht-genischen Regionen.
5.3 DEK - ein neues Architektur-Protein?
DEK verhält sich in vielen Punkten ähnlich wie die klassischen HMG-Proteine. Um besser verstehen zu können, wie DEK im Chromatin funktionieren könnte, soll hier über die Ähnlichkeiten zwischen DEK und den HMG-Proteinen diskutiert werden.
DEK ist ein ubiquitäres Protein, das mit > 1 x 106 Kopien pro Zelle im Zellkern lokalisiert und hauptsächlich an Chromatin gebunden ist (Kappes et al., 2001). Im Vergleich dazu sind die HMG-Proteine ebenfalls abundante Chromatin-gebundene Proteine mit einer Kopienzahl von 104 bis 106 Moleküle pro Zelle (Bustin, 1999).
DEK wird weniger exprimiert in differenzierten Zellen als in normalen Zellen (Savli et al., 2002). In vielen verschiedenen Tumorzellen wird DEK überexprimiert (Casas et al., 2003; Kondoh et al., 1999; Larramendy et al., 2002; Sanchez-Carbayo et al., 2003).
Ähnlich dazu ist, dass die Expression von HMGA das höchste Niveau in rasch proliferierenden Zellen erreicht, aber in voll differenzierten Zellen und Geweben HMGA viel weniger oder sogar nicht detektierbar exprimiert wird (Bustin and Reeves, 1996).
Fast in jeder untersuchten Krebsart sind die HMGA-Proteine überexprimiert. (Reeves and Beckerbauer, 2001).
DEK bindet an die DNA über eine zentral liegende SAP-Box und eine C-terminale DNA-Binde-Domäne (Kappes et al., 2004b). Die DEK-DNA-Bindung ist eher struktur-spezifisch als sequenzstruktur-spezifisch. Es bindet bevorzugt an die kruziforme und supergecoilte DNA (Waldmann et al., 2003). Auch in dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die starke DEK-Anreicherung in der C4-Region des TOP1-Gens mit der DNA-Struktur zusammenhängen könnte. HMGA- und HMGB-Protein binden an die DNA auch eher struktur- als sequenzspezifisch und bevorzugt an gebogene, verdrehte, supergecoilte und kruziforme DNA in vitro (Teo et al., 1995; Thomas, 2001; Webb and Thomas, 1999).
5. Diskussion
DEK kann die DNA-Struktur verändern, wobei DEK die Topologie von sowohl Minichromosomen als auch von proteinfreier DNA durch Einführung von positiven Supercoils verändern kann (Waldmann et al., 2002). HMGA- und HMGB-Proteine können auch die DNA-Struktur verändern, zum Beispiel durch Einführung von Supercoils in relaxierte DNA (Nissen and Reeves, 1995). Weiterhin können HMG-Proteine in vivo als Architektur-Transkriptionsfaktoren funktionieren, möglicherweise durch ihre Fähigkeit die Struktur zu verändern und durch ihre DNA-Strukturspezifität. Zum Beispiel kann das HMGA-Protein durch Erleichterung oder Verhinderung der Formation vom Enhanceosomen auf dem Promotor-Bereich eines Gens zusammen mit anderen Faktoren die Transkription positiv oder negativ regulieren (Bustin and Reeves, 1996; Reeves, 2000; Thanos and Maniatis, 1995). Durch die mögliche HMGA-Protein-induzierte DNA-Struktur-Veränderung könnten andere Transkriptionsfaktoren besser an diese Stelle rekrutiert werden und die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes könnte dadurch erleichtert werden.
Ein weiterer Hinweis ist, dass HMGA-Proteine im Prozess der Tanskriptionsaktivierung mit der Bindung eines Inhibitor-Proteins wie z.B H1 kompetitieren oder sogar ersetzen können. Gleichzeitig wurden Kern-Histone in der Kolokalisationsanalyse mit DEK mitgefällt. Jedoch konnte keine Kolokalisation von DEK mit H1 nachgewiesen werden.
Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass DEK auch die Position von H1 kompetitieren oder ersetzen könnte.
Nun stellt sich die Frage welche Funktion DEK im Chromatin-Kontext einnehmen könnte. DEK kann sowohl in aktiven und inaktiven Gen-Bereichen, als auch im nicht-genischen Bereich lokalisieren. In den meisten untersuchten Regionen ist DEK gleichmäßig verteilt. Diese DNA-Bindung könnte, wie für H1 und die HMG-Proteine beschrieben, dynamisch sein (Scholten, 2004). Auf der anderen Seite wurde DEK in regulatorischen Elementen von Genen angereichert vorgefunden und diese Anreicherung könnte mit der Gen-Expression verbunden sein. Die Anreicherung auf die C4-Region des TOP1-Gens ist aber nicht sequenzspezifisch, weil im Bandshiftassay keine bevorzugte Bindung des DEK-Proteins an das C4-Element nachgewiesen werden konnte. So verhält sich DEK nicht wie ein sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor.
Weiterhin könnte diese DEK-Anreicherung mit der DNA-Struktur im C4-Fragment verbunden sein. Mit der Ähnlichkeit zu den HMG-Proteinen übt DEK sehr wahrscheinlich eine Struktur-Funktion in der Transkription aus. So lässt sich auch gut erklären, warum DEK als Transkriptionsaktivator aber auch als Transkriptionsrepressor identifiziert werden konnte (Campillos et al., 2003; Hollenbach et al., 2002). Es könnte
5. Diskussion
jedoch sein, dass DEK nur die DNA-Struktur im bestimmten Bereich verändert oder stabilisiert. Dies könnte zu positiven, aber auch zu negativen Effekten in der Transkription führen.
Zusammenfassend könnte DEK mit seiner Fähigkeit, die DNA-Struktur zu verändern, und seiner Strukturspezifität ein Kandidat für ein neues Chromatin-Architektur-Protein sein, das eher eine allgemeine Struktur-Funktion als Architektur-Transkriptionsfaktor wie die HMG-Proteine ausüben könnte.
6. Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde die DEK-Lokalisation und -Verteilung im Chromatin mittels der Methode des ChIP-Assays und nachfolgender DNA-Analyse untersucht.
In den meisten untersuchten Gen-Regionen wurde DEK gleichmäßig verteilt vorgefunden. Weiterhin ist DEK im C4-Element des TOP1-Gens und im Promotorbereich des CD21-Gens angereichert. Hinweise bestehen darauf, dass diese Anreicherung mit der Gen-Expression zusammenhängt. Die Anreicherung im C4-Element des TOP1-Gens ist eher struktur– als sequenzspezifisch, da in Bandshiftassays keine bevorzugte Bindung an das C4-Element festgestellt werden konnte. Jedoch könnte die C4-Region durch ihre GC-reiche, umgekehrte Wiederholungssequenz eine stabile kruziforme DNA-Struktur ausbilden.
Des weiteren konnte in Kolokalisationsstudien gezeigt werden, dass DEK in aktiven Gen-Bereichen mehr als in inaktiven Gen-Bereichen lokalisiert. Mit der Klonierung und Analyse der DEK-gefällten DNA-Fragmente (DEK-Klone) konnte festgestellt werden, dass DEK innerhalb von Gen-Bereichen und auch an Nicht-Gen-Bereiche bindet.
Mit den hier gezeigten Ergebnissen, der DEK-Strukturspezifität an DNA und seiner Fähigkeit, die DNA-Struktur zu verändern (Alexiadis et al., 2000; Waldmann et al., 2002), könnte DEK als Architektur-Protein wie die klassischen HMG-Proteine im Chromatin funktionieren.
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