In Nalm-6 kann die CD21-Expression mit Aza-Deoxycytidine induziert werden

Die CD21-Aktivität kann durch Veränderung der Chromatin-Struktur reguliert werden und die Expression von CD21 in CD21-ruhenden Zellen kann durch TSA (Trichostatin A), einem Inhibitor von Histon-Deacetylase, stimuliert werden (Schwab and Illges, 2001;

Zabel et al., 2000; Zabel et al., 1999).

Um die Expression von CD21 in den prä-B-Zellen Nalm-6 zu stimulieren, wurden die Zellen im Experiment mit TSA (Endkonzentration: 300 ng/ml) für jeweils 24 und 48 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die gesamte RNA aus den mit TSA behandelten und normalen Nalm-6-Zellen und reifen B-Zellen Ramos (als positive Kontrolle) extrahiert und eine RT-PCR-Analyse durchgeführt, um zu sehen, ob die CD21-Expression in Nalm-6 stimuliert wird. Für das DEK-Protein wurden die Zellen zusätzlich lysiert und die Zellextrakte über Westernblot analysiert. Die RT-PCR-Analyse

4. Ergebnisse

zeigt (Abbildung 4.19A), dass nur mit reifen B-Zellen Ramos ein Produkt der Transkription erscheint. Mit TSA-behandelten prä-B-Zellen Nalm-6 konnte kein CD21-Transkriptionsprodukt nachgewiesen werden, wie mit normalen Nalm-6-Zellen. Als Kontrolle dient das Transkriptionsprodukt von GAPDH, einem Haushaltsgen, das in allen untersuchten Zellen gefunden wurde. Obwohl Nalm-6-Zellen mit TSA bis zu 48 Stunden inkubiert wurden, konnte die Expression von CD21 in den Nalm-6-Zellen nicht induziert werden. Möglicherweise müssen die Zellen noch länger und/oder mit höherer Konzentration von TSA inkubiert werden. In der DEK-Protein-Analyse ist zu sehen (Abbildung 4.19B), dass nach 24 Stunden Inkubation mit TSA das meiste DEK-Protein völlig abgebaut ist. Nach 48 Stunden bleibt nur noch ein sehr kleiner Anteil von DEK übrig. Ein anderer kleiner Teil ist in Form eines Abbauproduktes zu erkennen. Es scheint, dass DEK sensitiv gegen eine Behandlung mit TSA ist. Obwohl es noch die Möglichkeit gibt, mit höheren Konzentrationen von TSA und mit längerer Behandlungszeit die CD21-Expression in Nalm-6 zu induzieren, ist dies nicht mehr sinnvoll, da mit so wenig vorhandenem DEK in den Zellen die Untersuchung nicht durchgeführt werden könnte. Für diese Fragestellung muss daher ein anderer Weg gewählt werden.

4. Ergebnisse

Abbildung 4.19 Behandlung von Nalm-6-Zellen mit TSA

(A) CD21-Expression. Die RT-PCR wurde mit der gesamten RNA aus mit TSA behandelten und normalen Zellen durchgeführt. Die erwartete CD21-Bande erschien nur in den reifen B-Zellen Ramos, nicht in den mit TSA behandelten und normalen prä-B-Zellen Nalm-6. Als Kontrolle war ein Haushaltsgen-Transkript von GAPDH in den beiden Zellen vorhanden. M: DNA-Marker.

(B) DEK-Menge in den Zellen. Der Gesamtzellextrakt aus Nalm-6 und Ramos Zellen wurde auf ein PA-Gel aufgetragen und über Westernblot mit DEK-spezifischen Antikörpern analysiert.

Die Promotor-Region von CD21 liegt in einer CpG-Insel, wo CpG-Dinukleotide von DNMT (DNA nucleotide methytransferase) methyliert werden können. Eine Methylierung von CpG-Inseln in regulatorischen Elementen kann zur Transkriptionsunterdrückung eines Gens führen (Ng and Bird, 1999; Razin, 1998). In einer Arbeit von Schwab and Illges (Schwab and Illges, 2001) wurde gezeigt, dass in CD21-inaktiven B-Zellen die CpG-Insel im Promotor-Bereich methyliert ist. Im Gegensatz dazu enthalten die B-Zellen, in denen CD21 aktiv ist, eine nicht methylierte CpG-Insel. Weiterhin konnte mit Aza-dc (5’-aza-2’-deoxycytidine), einem Inhibitor der DNA-Methyltransferase, die CD21-Expression in einer ursprünglich CD21-inaktiven pro-B-Zelle KM3 induziert werden.

Im folgenden Experiment wurde versucht, die CD21-Expression in Nalm-6-Zellen mit Aza-dc zu stimulieren. Nalm-6-Zellen wurden mit 4µM Aza-dc bis zu 72 Stunden inkubiert. Um die CD21-Expression zu testen, wurde eine RT-PCR-Analyse mit RNA

4. Ergebnisse

aus verschiedenen Zellen durchgeführt. Die DEK-Menge in den Zellen wurde über Westernblot analysiert.

Abbildung 4.20A zeigt das Ergebnis der RT-PCR-Analyse. Nach 24 h Behandlung mit Aza-dc allein oder zusammen mit TSA konnte keine Bande des CD21-Produktes detektiert werden. Bis zu diesem Zeitpunkt kann die CD21-Expression noch nicht induziert werden. Erst nach 48h erschien eine sehr schwache Bande von CD21. Mit weiterer Inkubation mit Aza-dc für 24h wurde eine stärkere Expression detektiert, wobei das Expressionsniveau deutlich niedriger als das von normalen reifen B-Zellen Ramos war, wenn man die CD21-Bande von Ramos-Zellen und mit Aza-dc für 72 h behandelten Nalm-6-Zellen vergleicht. Als Kontrolle diente GAPDH, die in allen Zellen exprimiert wurde.

Die DEK-Analyse zeigt (Abbildung 4.20B), dass nach einer Behandlung der Nalm-6-Zellen mit TSA und Aza-dc für 24 h der gleiche Effekt wie mit TSA alleine (siehe Abbildung 4.19B) hatte. Ein Hauptteil von DEK wurde abgebaut. Im Gegensatz dazu blieb DEK stabil nach einer Inkubation für 24 h mit 4 mM Aza-dc. Fast die gesamte DEK-Population blieb noch in einem stabilen Zustand selbst nach Inkubation mit 4 µM Aza-dc für 48 und 72 h, obwohl ein sehr kleiner Anteil des DEK-Proteins abgebaut vorgefunden wurde. In der gleichen Zeit wurde die CD21-Expression in Nalm-6 induziert.

Mit diesem Ergebnis konnte die DEK-Bindung im Bereich des CD21 in den normalen Zellen, in denen CD21 inaktiv ist, und in den mit Aza-dc behandelten Nalm-6-Zellen, in denen CD21-Expression induziert wird, analysiert werden. Die Zellen wurden mit Aza-dc für 72 h inkubiert, weil zu diesem Zeitpunkt das CD21 besser exprimiert wird.

4. Ergebnisse

Abbildung 4.20 Behandlung der Nalm-6-Zellen mit 4 µM Aza-dc

(A) CD21-Expression. Die RT-PCR wurde mit Gesamt-RNA aus Aza-dc behandelten und normalen Zellen durchgeführt. Die erwartete CD21-Bande erschien in den behandelten prä-B-Zellen Nalm-6 nach 48 und 72 Stunden und normalen reifen B-Zellen Ramos, nicht in den mit Aza-dc allein oder zusammen mit TSA für 24 Stunden behandelten und normalen prä-B-Zellen Nalm-6. Als Kontrolle war das Haushaltsgen-Transkript von GAPDH in den beiden Zellen vorhanden. M: DNA-Marker.

(B) DEK-Menge in den Zellen. Der Gesamtzellextrakt aus Nalm-6 und Ramos Zellen wurde auf PA-Gel aufgetragen und über Westernblot mit DEK-spezifischen Antikörpern analysiert.

4.4.4 DEK ist leicht angereichert im Bereich der Promotor-Region des