Die DEK-Anreicherung im Bereich der C4-Region ist verbunden mit der TOP1-Gen-

TOP1 ist ein Haushaltsgen und ist in der Zelle ständig im aktiven Zustand. Die Untersuchung wurde mit asynchron proliferierenden HeLa-Zellen durchgeführt. So ist DEK im Bereich der C4-Region angereichert, wenn TOP1 aktiv ist. Wenn diese Anreicherung im Zusammenhang mit der Gen-Regulierung stünde, sollte sich die DEK-Bindung im Bereich der C4-Region verändern, wenn TOP1 inaktiv ist. Weil TOP1 ständig aktiv ist, kann nur ein Transkriptionsinhibitor benutzt werden, um das TOP1-Gen zu deaktivieren. Es ist nicht möglich, einen Inhibitor zu finden, der spezifisch die Transkription von TOP1 stoppen kann. So wurde hier α-Amanitin, ein genereller Transkriptionsinhibitor, der spezifisch die Aktivität der RNA-Polymerase II in niedrigen Konzentrationen hemmt, verwendet. Die RNA-Polymerase II transkribiert die Gene, die die Information zur Herstellung von Proteinen tragen, darunter auch das TOP1-Gen.

Wenn die Aktivität von RNA-Polymerase II gehemmt werden kann, wird TOP1 nicht mehr transkribiert und bleibt im inaktiven Zustand.

Als erster Schritt wurde die Inkubationszeit von α-Amanitin getestet. Auf der einen Seite braucht es Zeit, damit α-Amanitin vom Medium in den Zellkern diffundieren kann, auf der anderen Seite kann die Inkubationszeit nicht zu lange dauern. Obwohl nach langer Inkubationszeit mit α-Amanitin die Transkription von TOP1 inhibiert werden kann, wird die Transkription von anderen Genen, darunter das DEK-Gen, auch gehemmt. Hier soll die DEK-Bindung im Bereich der C4-Region untersucht werde. Wenn nun aber die DEK-Transkription durch α-Amanitin gehemmt ist, hängen die Ergebnisse nur noch von der Stabilität der vorhandenen DEK-Proteine ab. Wenn nach langer Inkubationszeit das vorhandene DEK-Protein nicht mehr stabil ist, sondern abgebaut wird, könnte diese Untersuchung dann nicht mehr durchgeführt werden.

Im Versuch wurden HeLa-Zellen in einer Zeitreihe mit 100 µg/ml α-Amanitin inkubiert.

Anschließend wurde eine Protein-Analyse mittels Westernblot und eine RNA-Analyse mittels RT-PCR durchgeführt. Für die DEK-Protein-Analyse wurden zunächst HeLa-Zellen von verschiedenen Zeitpunkten lysiert. Anschließend wurden die Proteine über

4. Ergebnisse

SDS-PAGE aufgetrennt und DEK im Westernblot mit DEK-spezifischen Antikörpern analysiert. Für die mRNA-Analyse wurde zuerst die gesamte RNA der mit α-Amanitin behandelten HeLa-Zellen aus verschiedenen Zeitpunkten isoliert. Danach wurde je 1 µg RNA als Template für die Reverse-Transkription mit Oligo-dT als Primer verwendet. Mit der so hergestellten cDNA wurde dann eine PCR mit entsprechenden Primern durchgeführt. Über diese Methode wurde dann die Veränderung der transkribierten mRNA-Menge festgehalten. Bis 8 h Inkubationszeit mit 100 µg/ml α-Amanitin blieb die DEK-Menge unverändert. Nach 16 h reduzierte sich die DEK-Menge deutlich (Abbildung 4.9A). Die Behandlungszeit mit 100 mg/ml α-Amanitin für HeLa-Zellen kann maximal zwischen 8 und 16 h dauern. Zwischen 8 und 16 h sollte der Abbau der DEK-Proteine beginnen. Weiterhin sollte die Transkription des DEK-Gens in diesem Zeitraum schon gehemmt werden. Die mRNA-Analyse ergab auf den ersten Blick ein umgekehrtes Ergebnis (Abbildung 4.9B). Obwohl die Zellen bis 16 h mit α-Amanitin inkubiert wurden, reduzierte sich die mRNA von TOP1 nur um ca. 50%. Bis zu diesem Zeitpunkt scheint α-Amanitin noch nicht richtig funktioniert zu haben. Aber es könnte ein anderer Grund dafür verantwortlich sein. Als Haushaltsgen könnte die mRNA von TOP1 eine höhere Stabilität besitzen. Deswegen wurde ein anderes Haushaltsgen, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), getestet (Abbildung 4.9C). Mit GAPDH wurde ein ähnliches Ergebnis erzielt. So könnte das Problem an der mRNA-Stabilität liegen.

4. Ergebnisse

Abbildung 4.9 Behandlung der HeLa-Zellen mit 100 µg/ml α-Amanitin

(A) Die Zellen wurden mit α-Amanitin für 0, 2, 4, 8 und 16h inkubiert und danach lysiert. Je 10 µl Zellextrakt (ca.

5x10⁴ Zellen entsprechend) wurde auf einem SDS-PA-Gel aufgetrennt und DEK wurde im Westernblot analysiert.

(B, C) Die gesamte RNA von α-Amanitin behandelten Zellen wurde isoliert. Die mRNA-Analyse von TOP1 (B) und GAPDH (C) wurde mit RT-PCR durchgeführt.

Um den Effekt von α-Amanitin zu testen, sollte eine unstabile mRNA-Art ausgewählt werden. Deswegen wurde ein Test mit c-Myc durchgeführt. Das c-Myc-Gen kodiert für einen Bestandteil eines Transkriptionsfaktors. Die c-Myc-mRNA ist kurzlebig und wird ca. 30 min nach ihrer Synthese wieder abgebaut. Deshalb ist dieses Gen gut geeignet für diesen Test.

Im Versuch wurden die HeLa-Zellen mit 50 µg/ml und 100 µg/ml α-Amanitin für jeweils 0, 2, 4, 6 und 8h inkubiert. Die gesamte RNA wurde isoliert und die RT-PCR wurde mit den Primern für c-Myc durchgeführt. Mit der Abbildung 4.10 ist gut zu sehen, dass ab einer Inkubationszeit von 6h mit 50 µg/ml α-Amanitin die Menge von c-Myc-mRNA abnahm. Nach 8h reduzierte sich die Menge noch deutlicher. Mit 100 µg/ml ist der Effekt von α-Amanitin noch besser zu erreichen. Nach einer Inkubationszeit von 8h blieb nur noch eine sehr schwache Bande übrig. Die Transkription des c-Myc-Gens wurde fast vollständig inhibiert. Es bedeutet auch, dass zu diesem Zeitpunkt und unter diesen Bedingungen die Transkription in den HeLa-Zellen gestoppt wird und das

TOP1-4. Ergebnisse

Gen inaktiv ist. Wie vorher gezeigt (Abbildung 4.9A), bleibt die Menge des vorhandenen DEK-Proteins nach Inkubation von 8h mit 100µg/ml α-Amanitin unverändert. So kann die Untersuchung der DEK-Anreicherung im Bereich der C4-Region im inaktiven TOP1-Gen unter diesen Bedingungen durchgeführt werden, bei denen HeLa-Zellen für 8h mit 100 µg/ml α-Amanitin inkubiert werden.

Abbildung 4.10 Inhibition der Transkription des c-Myc-Gens durch α-Amanitin

HeLa-Zellen wurden mit 50 µg/ml oder 100 µg/ml α-Amanitin für 0, 2, 4, 6 und 8h inkubiert. Anschließend wurde die gesamte RNA der behandelten Zellen isoliert. Die Veränderung der c-Myc-mRNA wurde über RT-PCR und Agarosegel-Elektrophorese analysiert.

Der ChIP-Assay wurde mit nicht behandelten HeLa-Zellen, in denen TOP1 aktiv ist, und mit für 8h mit 100 µg/ml α-Amanitin behandelten Zellen, in denen TOP1 inaktiv ist, durchgeführt. Dabei wurden zunächst die Zellen mit 1% Formaldehyd inkubiert. Die vernetzten Nukleoproteine wurden aufgereinigt, sonifiziert und mit Mikrokokkus-Nuklease verdaut. Mit diesen Nukleoprotein-Fragmenten (Chromatin-Fragmenten) wurde dann die Immunfällung mit DEK-spezifischen Antikörpern und unspezischen IgGs durchgeführt. Anschließend wurde die gefällte DNA gereinigt und über quantitative PCR im Light-Cycler analysiert.

Wie in der Abbildung 4.11 zu sehen ist, hat DEK, wenn TOP1 aktiv ist, eine starke Anreicherung im Bereich der C4-Region. Wenn TOP1 aber inaktiv ist, reduziert sich diese Anreicherung drastisch. Dies deutet darauf hin, dass die DEK-Anreicherung im Bereich der C4-Region mit der TOP1-Aktivierung verbunden ist.

4. Ergebnisse

Abbildung 4.11 DEK-Anreicherung auf dem aktiven und inaktiven TOP1-Gen

(A) Schematische Darstellung des TOP1-Gens. Das TOP1-Gen ist gezeigt als graue skalierte Box (in bp) und die Exons als schwarze Boxen. Die DNase I hypersensitiven Regionen sind als nummerierte schwarze Dreiecke über das TOP1-Gen eingezeichnet. Rote Boxen: Regionen für die PCR-Amplifizierung.

(B) DEK-Anreicherung auf dem TOP1-Gen. Die DEK-Anreicherung wurde durch Bildung der Verhältnisse der Kopienzahlen des Präzipitates mit dem Input bestimmt (Präzipitat-DNA/Input-DNA). Die so erhaltenen Faktoren wurden graphisch aufgetragen. DEK+: DEK-Anreicherung im Bereich des TOP1-Gens in α-Amanitin behandelten HeLa-Zellen. DEK: DEK-Anreicherung in nicht behandelten Zellen.

4.3.4.2 In vitro findet keine bevorzugte Bindung von DEK an das