DEK ist angereichert im Promotor–Bereich des aktiven CD21-Gens

In der Untersuchung wurde die DEK-Bindung an das aktive und inaktive CD21-Gen in zwei verschiedenen B-Zellen verglichen. So muss zunächst sicher sein, dass CD21 wirklich in Nalm-6 (prä-B-Zellen) inaktiv und in Ramos (reife B-Zellen) aktiv ist. Um dies zu bestätigen, wurde eine RT-PCR mit gesamter RNA aus Nalm-6- und Ramos-Zellen durchgeführt. In der Abbildung 4.17A ist es zu sehen, dass die CD21-cDNA-Bande nur in Ramos-Zellen, nicht in Nalm-6-Zellen erscheint. Als Kontrolle dient die Expression eines Haushaltsgens, GAPDH, die in beiden Zellen vorhanden ist. Wie erwartet ist CD21 nur in reifen B-Zellen (Ramos) exprimiert, nicht aber in prä-B-Zellen (Nalm-6). Als nächster Schritt wurde die DEK-Menge in den beiden Zelllinien getestet, weil es bekannt ist, dass die DEK-Menge in verschiedenen Zelllinien und in Differenzierungsphasen eines gegebenen Zelltyps unterschiedlich ist (Daibata et al., 2004; Kondoh et al., 1999; Larramendy et al., 2002; Savli et al., 2002). Es ist wichtig für die Untersuchung, dass DEK in beiden Zellen exprimiert wird. Für diesen Zweck wurden diese zusammen mit HeLa-Zellextrakt als Referenz auf einem PA-Gel aufgetragen und die DEK-Menge über Westernblot analysiert. Das Ergebnis zeigt (Abbildung 4.17B), dass die DEK-Menge in den beiden B-Zelllinien gleich ist, jedoch geringer als in HeLa-Zellen. Das Signal von 5x10⁴ HeLa-Zellen entsprach 15x10⁴ B-Zellen in der Westernblot-Analyse. So entspricht die DEK-Menge in den B-Zellen ungefähr einem Drittel der von HeLa-Zellen.

4. Ergebnisse

Abbildung 4.17 DEK in B-Lymphozyten

(A) CD21-Expression. Die RT-PCR wurde mit gesamter RNA aus den beiden B-Zelllinien durchgeführt. Die erwartete CD21-Bande erschien nur in den reifen B-Zellen (Ramos), nicht aber in den prä-B-Zellen (Nalm-6). Als Kontrolle diente ein Haushaltsgen-Transkript (GAPDH), das in den beiden Zelllinien vorhanden war. M: DNA-Marker.

(B) DEK-Protein-Menge in unterschiedlichen Zelltypen. Ein Gesamtzellextrakt aus HeLa-, Nalm-6- und Ramos-Zellen wurde auf einem PA-Gel aufgetragen und über Westernblot mit DEK-spezifischen Antikörpern analysiert.

Um die DEK-Bindung im Bereich des CD21-Gens zu analysieren, wurden die beiden B-Zellen genau wie die HeLa-B-Zellen behandelt. Mit den so gewonnen Nukleoproteinfragmenten wurde eine Immunfällung mit polyklonalen DEK-spezifischen Antikörpern und IgG-Kontroll-Antikörpern durchgeführt. Nach der Immunfällung wurden die Immunpellets mehrfach gewaschen und mit SDS-Lösung eluiert. Die Proteine im Input, Überstand und Pellet wurden über Westernblot analysiert. Die DNA im Pellet wurde extrahiert und über quantitative PCR analysiert.

Für die quantitative PCR-Analyse wurden sechs Primer-Paare ausgewählt (Abbildung 4.18A). Eines davon liegt in der Promotor-proximalen Region (P), Pv und In1 befinden sich jeweils ca. 1 kb stromaufwärts und 500 bp stromabwärts von P und zwei Primer-Paare, RS1 und RS2, wurden für die DEK-Bindung im CRS-Element benutzt, wobei RS1 die Bindestelle für CBF-1, ein Transkriptionsrepressor, bedeckt. Ein weiteres Primer-Paar, Ex6, lokalisiert weit stromabwärts auf Exon 6 und dient als Kontrolle.

Wie vorher mit den HeLa-Zellen wurde die DEK-DNA-Bindung im Bereich des CD21-Gens in den beiden B-Zelllinien als eine Rate von gefällter DNA zu Input-DNA gezeigt (Abbildung 4.18B). Mit den unspezifischen IgG-Antikörpern wurde nur eine sehr kleine

4. Ergebnisse

Menge DNA gefällt (IgG in der Abbildung 4.18B). Im Gegensatz dazu wurde mit den DEK-spezifischen Antikörpern viel mehr von allen getesten DNA-Sequenzen an diesem Bereich präzipitiert (DEK in der Abbildung 4.18B).

Für Nalm-6-Zellen wurde gezeigt, dass DEK an alle untersuchten Sequenzen im Bereich des CD21-Gens mit einem ähnlichen Niveau bindet, wobei der Wert zwischen 5 und 10% liegt. Es scheint, dass DEK eher gleichmässig im Bereich des inaktiven CD21-Gens verteilt ist (Abbildung 4.18B, linkes Diagramm). Unterschiedlich zu den Nalm-6-Zellen ist DEK-Verteilung in den Ramos-Nalm-6-Zellen, wo CD21 exprimiert ist. Hier kommt es zu einer zwei- bis dreimal höheren Anreicherung von DEK in der Promotor-proximalen Region. Weiterhin wurde keine DEK-Anreicherung auf dem anderen regulatorischen Element CRS gefunden (Abbildung 4.18B, rechtes Diagramm). Dieses Ergebnis wurde in 4 unabhängigen Versuchen bestätigt. DEK bindet folglich stärker an den Promotorbereich als an andere Sequenzen auf dem aktiven CD21-Gen.

Abbildung 4.18 DEK-Bindung im Bereich des CD21-Gens in B-Zellen

(A) Regulatorische Elemente und PCR-amplifizierte Regionen im Bereich des CD21-Gens. Die CpG-Insel in der Promotor-Region und das CRS-Element innerhalb des Intron 1 sind als grüne Boxen gezeigt. Der Pfeil zeigt die Initiation und Richtung der Transkription von CD21. Die roten Boxen unter der Genkarte zeigen die Größe und Position der amplifizierten DNA-Sequenzen an.

(B) DEK-Bindung im Bereich des CD21-Gens in den beiden B-Zellen. Die DEK-Bindung im Bereich des CD21 in Nalm-6- (links) und Ramos-Zellen (rechts) ist als Rate von präzipitierter DNA zu Input-DNA gezeigt.

4. Ergebnisse

Es könnte sein, dass die DEK-Anreicherung in der Promotor-Region des aktiven CD21-Gens mit der CD21-Expression verbunden ist. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurden die folgenden Versuche durchgeführt.

Wenn die DEK-Anreicherung im Bereich des Promotors wirklich mit der CD21-Expression zusammenhängt, sollte die CD21-CD21-Expression in den reifen B-Zellen Ramos bei einer völligen Abwesenheit von DEK oder einer verminderten DEK-Expression, runtereguliert werden. Umgekehrt sollte eine DEK-Anreicherung in der Promoter-Region erzielt werden, wenn die CD21-Expression in den Nalm-6-Zellen stimuliert wird.

Für die ersten Fragestellung wurden Ramos-Zellen und HeLa-Zellen (als positive Kontrolle) mit siRNA (short interfering RNA) gegen DEK transfiziert. Obwohl nach Transfektion für 72 Stunden das DEK-Protein in HeLa-Zellen fast völlig eliminiert wurde, blieb die DEK-Menge in den Ramos-Zellen unverändert (Daten nicht gezeigt). Mit verlängerter Transfektionszeit hatte die siRNA auch keinen Effekt auf die Ramos-Zellen.

Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass die transfizierte siRNA über einen Schutzmechanismus wieder aus den Ramos-Zellen exportiert wurde. Weil diese Methode nicht gelungen ist, sollte nun die andere Fragestellung bearbeitet werden, nämlich die Stimulierung der CD21-Expression in Nalm-6, in denen CD21 normalerweise inaktiv ist.

4.4.3 In Nalm-6 kann die CD21-Expression mit Aza-Deoxycytidine