DEK-Lokalisation am Chromatin

Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass DEK am Chromatin sowohl in aktiven, als auch in inaktiven Gen-Bereichen lokalisiert ist. Man findet DEK angereichert an regulatorischen Elementen in zwei aktiven Genen, nämlich TOP1 und CD21. Diese Anreicherung hängt mit der Gen-Expression zusammen. Es könnte sein, dass DEK mehr an aktive Gen-Bereiche als an inaktive Gen-Bereiche bindet. Aber mit der Methode des ChIP-Assays und folgender quantitativer PCR-Analyse ist es nicht möglich, alle Gene im Genom zu untersuchen. Um die DEK-Lokalisation auf den aktiven und inaktiven Genen auf Genom-Ebene zu analysieren, wurde eine Kolokalisationsanalyse mit Hilfe des ChIP-Assays durchgeführt.

4.5.1 DEK kolokalisiert mehr mit acetyliertem Histon H4 als mit HP1α

Das Histon H4 in aktiven Genen ist hyperacetyliert. Inaktive Gene sind meist in heterochromatischen Bereichen lokalisiert. Im Centromer und Telomer von Chromosomen befindet sich Heterochromatin, auf dem HP1 (Heterochromatin Protein 1) angereichert ist (Maison and Almouzni, 2004; Zhimulev and Beliaeva, 2003). Mit diesem Wissen kann die DEK-Lokalisation auf aktiven und inaktiven Genen durch Kolokalisationsstudien mit acetyliertem Histon H4 und HP1 untersucht werden.

Im Experiment wurde ein ChIP-Assay durchgeführt. Nach der Immunfällung mit den DEK-spezifischen Antikörpern wurden die Proteine im Input, Überstand und Immunpräzipitat mit DEK-, AcH4- und HP1α-spezifischen Antikörpern analysiert. Das Ergebnis zeigt (Abbildung 4.22A), dass zunächst die DEK-Menge im DEK-gefällten Überstand deutlich weniger als im Input ist. Nur im DEK-Pellet, aber nicht im IgG-Kontroll-Pellet erscheint die DEK-Bande (Abbildung 4.22A, oben). Demnach war die DEK-Fällung erfolgreich, und mit IgG-Kontrollantikörpern wird kein DEK gefällt.

Acetyliertes Histon H4 (AcH4) und HP1α konnten durch die Inkubation mit Formaldehyd ebenfalls gut vernetzt werden (siehe Abbildung 4.22A, Input mitte und unten). Nur eine sehr schwache HP1α-Bande kann im DEK-Pellet detektiert werden. Dieses Ergebnis stimmt mit den Immunfluorezenz-Analysen von Ingo Scholten überein, wonach ein großer Teil von DEK nicht mit HP1α angefärbten Bereichen kolokalisiert (Scholten, 2004). Im Vergleich zur HP1α-Bande erscheint eine deutlich stärkere AcH4-Bande im DEK-Pellet, obwohl es nur ein kleiner Anteil vom gesamten AcH4 ist. So ist mehr AcH4

4. Ergebnisse

als HP1α mit DEK kolokalisiert. Um die DEK-AcH4-Kolokalisation zu bestätigen, wurde der ChIP-Assay mit AcH4-spezifischen Antikörpern durchgeführt. In der Abbildung 4.22B ist zu sehen, dass ungefähr 50% AcH4 gefällt wurde, wenn der Input und der AcH4-gefällte Überstand verglichen wird (Abbildung 4.22B, oben). Das AcH4-Pellet enthielt daher auch nur einen kleineren Anteil der gesamten DEK-Population (Abbildung 4.22B, unten). So kolokalisiert DEK mehr mit AcH4 als mit HP1α. Es bedeutet, dass DEK mehr an aktiven Gen-Bereichen als an inaktiven Gen-Bereichen bindet. Dieses Ergebnis entspricht der vorherigen Analyse der einzelnen Gene. In einer Arbeit von Kappes (Kappes et al., 2001) konnte durch Chromatinfraktionierungen ebenfalls gezeigt werden, dass DEK eine fünffache Anreicherung in aktiven Chromatinbereichen erfährt.

Abbildung 4.22 DEK-Kolokalisation mit AcH4 und HP1α.

(A) Immunfällung der vernetzten Chromatinfragmente (Nukleoproteinfragmente) wurde mit DEK-spezifischen Antikörpern und unspezifischen Kontroll-Antikörpern (IgG) aus Kaninchen durchgeführt. Input, Überstand und Immunpellet wurden durch Westernblot mit polyklonalen DEK-, monoklonalen HP1α- und polykonalen AcH4-spezifischen Antikörpern analysiert.

(B) Die Immunfällung wurde mit AcH4-spezifischen Antikörpern und unspezifischen Kontroll-Antikörpern (IgG) durchgeführt. Input, Überstand und Immunpellet wurden über Westernblot mit polyklonalen AcH4- und DEK- spezifischen Antikörpern analysiert.

Insgesamt wird nur ein kleiner Teil der DEK-Population auf den aktiven und inaktiven Gen-Bereichen lokalisiert. Wo sind die anderen DEK-Proteine im Chromatin lokalisiert?

Die Gesamtheit der Gene nimmt nur 5 bis 10% der DNA eines Säugertier-Genoms ein.

Die Mehrheit der DNA liegt außerhalb von Genen. Diese extragenische oder intergenische DNA besteht teilweise aus repetitiven DNA-Elementen, wie SINE ( short interspersed repetitive elements), LINE (long interspersed repetitive elements) und Satelliten-DNA, die sich im Centromer- und Telomer-Bereich von Chromosomen befindet (Knippers, 1995). Der Großteil der DEK-Proteine sollte in diesem extra- oder

4. Ergebnisse

intergenischen Bereich lokalisieren. Über quantitative PCR wurde bestätigt, dass DEK an ein Satelliten-DNA-Element mit einem ähnlichen Niveau wie die meisten anderen untersuchten Bereichen bindet (Daten nicht gezeigt). Es ist aber unmöglich, diesen nichtgenischen Bereich mittels quantitativer PCR zu untersuchen. Um die DEK-Bindung auf dem gesamten Genom zu analysieren, sollten DEK-gefällte DNA-Fragmente kloniert werden.

4.5.2 DEK-Klone

Nach der Immunfällung der Chromatinfragmente wurde das Immunpräzipitat intensiv gewaschen. Die Vernetzung zwischen Proteinen und DNA wurde revertiert und die Fragmente wurden aufgereinigt und in einen Vektor kloniert. Die klonierten DNA-Fragmente wurden sequenziert und analysiert. Das Ergebnis ist in Tabelle 4.1 zusammengefasst.

Insgesamt wurden 13 zufällig ausgewählte DEK-Klone analysiert. Die Größe der Klone liegt zwischen 188 und 765 bp mit einem Mittelwert von 490 bp. Unter allen Klonen ist nur ein Klon in einem Gen lokalisiert (DEK-6). Alle andere befinden sich im intergenischen oder extragenischen Bereich. Einige davon enthalten repetitive Elemente. Mit diesem Ergebnis wird bestätigt, dass ein Großteil der DEK-Proteine auf dem nichtgenischen Bereich im Chromatin lokalisieren könnte. Weiterhin enthalten 11 von 13 Klonen umgekehrte Wiederholungssequenzen, wie die vorher in der C4-Region im TOP1-Gen erwähnte, auf dem DEK stark angereichert ist. Einige dieser Wiederholungssequenzen könnten stabile kruziforme DNA-Strukturen in vivo ausbilden.

Zusätzlich enthalten 9 von 13 Klonen einen höhen Anteil an AT-Basenpaaren.

4. Ergebnisse

Die DEK-Klone wurden sequenziert und mittels Genom-Datenbank-Recherche (NCBI GenBank) analysiert.