In vitro findet keine bevorzugte Bindung von DEK an das C4-Element des TOP1-

DEK ist im Bereich der C4-Region in TOP1-Gen stark angereichert, wenn TOP1 in einem aktiven Zustand ist. C4 ist GC-reich und enthält eine DNase-I hypersensitive Stelle. Um die DEK-Bindespezifität auf dem C4-Element weiter zu untersuchen, wurden Bandshift-Assays mit nativ gereinigtem His-DEK aus dem Baculovirus-Expressionsystem (siehe Abbildung 4.2) durchgeführt. Dazu wurde das His-DEK mit dem C4-Fragment, den in beiden Richtungen benachbart liegenden C2-, P-, In2- und M1-Fragmenten des TOP1-Gens durchgeführt, wo sich C2 und P stromaufwärts und

4. Ergebnisse

In2 und M1 stromabwärts von C4 befinden (siehe Abbildung 4.11A).

Das Prinzip des Bandshift-Assays beruht auf Folgendem. Bei der Elektrophorese wandert ein Protein-DNA-Komplex langsamer als ein proteinfreies DNA-Fragment, weil der Protein-DNA-Komplex größer als das freie DNA-Fragment ist. Die DNA-Bande erscheint an einer anderen Stelle im Gel (Bandshift). Die Position kann entweder durch Färbung mit Ethidiumbromid oder, falls das DNA-Fragment radioaktiv markiert ist, durch Autoradiographie festgestellt werden.

Im Experiment wurden zunächst die DNA-Fragmente C2, P, C4, In2 und M1 über PCR amplifiziert. Die Fragmente wurden aufgereinigt und auf einem 1.5% Agarose-Gel analysiert (Abbildung 4.12). Die Fragmente sind zwischen 180 und 300 bp groß, wobei P und C4 GC-reich, In2 und M1 AT-reich sind. Darunter wurden C4 und das eng daneben liegende P und In2 für die Kompetitionsanalysen radioaktiv markiert.

Abbildung 4.12 Analyse der PCR-Produkte für den Bandshift-Assay

Die PCR Reaktionen wurden mit den entsprechenden Primer-Paare durchgeführt. Nach dem PCR-Lauf wurden die Reaktionen zur Analyse auf ein 1.5% Agarose-Gel aufgetragen.

Im Bandshift-Assay wurden die DNA-Fragmente mit steigenden DEK-Mengen inkubiert.

Die Analyse der Protein-Komplexe ergab, dass DEK an alle untersuchten DNA-Fragmente binden kann (Abbildung 4.13). DEK bindet an diese DNA-Fragmente mit einer ähnlichen Affinität. Verglichen mit anderen untersuchten DNA-Fragmenten kann hier keine Präferenz von DEK für C4-Fragment erkannt werden.

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Abbildung 4.13 Bandshift-Assay mit den DNA-Fragmenten C2, P, C4, In2 und M1 im Bereich des TOP1-Gens

Verschiedene DNA-Fragmente wurden mit steigenden Mengen His-DEK für eine Stunde bei 37°C inkubiert und auf einem 1.2% Agarose-Gel analysiert. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt. Die molaren Verhältnisse DEK/DNA waren jeweils 0, 10, 20, 50. M: DNA-Marker

Um dieses Ergebnis zu bestätigen, wurden Kompetitionsexperimente durchgeführt.

Hierfür wurden zunächst zu einer konstanten Menge an radioaktiv markiertem C4-Fragment steigende Mengen von unmarkiertem C4-C4-Fragment oder P-, In2- und M1-Fragmenten zugegeben. Dieses DNA-Gemisch wurde dann mit einer konstanten Menge His-DEK inkubiert. In der Abbildung 4.14 ist deutlich zu sehen, dass die Bindung von His-DEK an das markierte C4-Fragment durch alle anderen verwendeten DNA-Fragmente in gleichem Ausmaß kompetitiert werden konnte. Weiterhin wurden die radioaktiv markierten P- und In2-Fragmente durch das C4-, P- und In2-Fragment ebenfalls gleichmäßig kompetitiert (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DEK in vitro keine bevorzugte Bindung an das C4-Fragment aufweist.

An alle untersuchten DNA-Fragmente bindet DEK mit einer ähnlichen Affinität, obwohl P und C4 GC-reich, In2 und M1 dagegen AT-reich sind. So zeigt DEK hier keine Sequenzspezifität auf.

4. Ergebnisse

Abbildung 4.14 Kompetitionsanalyse mit dem C4-Fragment

Radioaktiv markiertes C4-Fragment wurde mit His-DEK in Gegenwart von steigenden Mengen nicht-markierter Kompetitor-DNA (C4, P, In2 und M1) für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Das molare Verhältnis von DEK/markierter DNA war in allen Ansätzen 50. Das Verhältnis von markierter DNA zu Kompetitor-DNA war jeweils: 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, und in manche Fällen 1:15 und 1:20.

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DEK ist in vivo stark angereichert auf dem C4-Element in dem aktiven TOP1-Gen. Aber in vitro wird keine bevorzugte Bindung von DEK an C4 gezeigt. Der Grund könnte darin liegen, dass im Bandshift-Assay His-DEK mit proteinfreier DNA inkubiert wurde. In vivo könnte DEK während der TOP1-Genaktivierung von anderen Proteinen auf dem C4-Element rekrutiert werden und/oder die Struktur des C4-Bereiches so verändert werden, dass DEK bevorzugt an dieser Struktur binden kann. In einer Arbeit von Waldmann (Waldmann et al., 2003) wurde gezeigt, dass DEK an DNA eher strukturspezifisch als sequenzspezifisch bindet. Es bindet bevorzugt an kruziforme und supergecoilte DNA.

Über eine Sequenzanalyse wurde eine GC-reiche, 10 bp lange umgekehrte Wiederholungssequenz auf C4 identifiziert. Dadurch könnte eine stabile kruziforme Struktur in vivo gebildet werden (Abbildung 4.15). Auf anderen untersuchten DNA-Fragmenten konnte keine solche Sequenz identifiziert werden. Im Bandshift-Assay wurde das über PCR-amplifizierte C4-Fragment benutzt. Auf diesem proteinfreien DNA-Fragment wäre es unwahrscheinlich, eine stabile kruziforme Strukur zu bilden. Dies würde auch erklären, warum His-DEK in vitro nicht bevorzugt an dieses Fragment bindet. Die Strukturspezifität von DEK an DNA könnte ein Grund für die starke Anreicherung im Bereich der C4-Region des TOP1-Gens sein.

Abbildung 4.15 Eine mögliche kruziforme Struktur innerhalb des C4-Fragmentes

Eine stabile kruziforme Struktur könnte durch eine umgekehrte Wiederholungssequenz (8 GC-Paare und 2 AT-Paare) gebildet werden.

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4.4 DEK-Lokalisation im Bereich des CD21-Gens in B-Zellen

Bisher wurde gezeigt, dass DEK stark angereichert im C4-Bereich des aktiven TOP1-Gens ist. Diese Anreicherung ist drastisch reduziert, wenn TOP1 inaktiviert wird. So scheint diese Anreicherung mit der Genaktivierung verbunden zu sein. Aber der inaktive Zustand von TOP1 wird durch Anwendung des Transkriptionsinhibitors α-Amanitin erreicht, das wiederum toxisch für Zellen ist. Um die in vivo Funktion von DEK auf Chromatin besser zu verstehen, wäre es besser, die DEK-Lokalisation auf einem Gen zu untersuchen, dessen Expression in verschiedenen Phasen des Zellzyklus oder Entwicklungsphasen in Zellen reguliert ist. Deswegen wurde ein solches Gen, nämlich CD21, dessen Expression Zell- und Entwicklungsphasen-spezifisch ist, ausgewählt, um die Verteilung von DEK auf diesem Gen zu untersuchen.