Neue Methoden zur Sequenzierung festphasengebundener
Cyclopeptide
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
an der Universität Konstanz
vorgelegt von
Angelika Semmler
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie
Universität Konstanz Oktober 2009
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS)
Dissertation der Universität Konstanz
Tag der mündlichen Prüfung: 03.12.2009
1. Referent: Prof. Dr. Valentin Wittmann
2. Referent: Prof. Dr. Dr. h. c. Michael Przybylski
Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Gerhard Müller
meinem Großvater Albert Anton Höfert
Vorwort
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von September 2005 bis Oktober 2009 in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Valentin Wittmann im Fachbereich Chemie der Universität Konstanz.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Valentin Wittmann für die Überlassung des sehr interessanten und herausfordernden Themas und die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe, sowie für das in mich gesetzte Vertrauen.
Herrn Prof. Dr. Michael Przybylski danke ich für die Übernahme des Zweitgut- achtens.
Da wissenschaftliche Arbeit immer auch Diskussion, Kooperation und gegenseitige Unterstützung bedeutet, möchte ich mich bei einigen Menschen bedanken:
Dominik Wöll für hilfreiche Diskussionen bei den Photolyse-Experimenten, Diana Klingler für gemeinsame Gehversuche und manche spannende Stunde am LC-MS, Markus Wieland und Astrid Joachimi für Unterstützung bei den SPR-Experimenten und Anke Friemel für die Aufnahme der NMR-Spektren.
Ein besonderer Dank gebührt allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppen Wittmann und Möller für eine wirklich tolle gemeinsame Zeit.
Besonders hervorheben möchte ich meine Laborkolleginnen Claudia Meßmer und Mônica Boldt, mit denen so manch bitterer Labortag doch noch süß wurde. Für das Suchen und Finden von Fehlern im Manuskript möchte ich mich bei Anja Meißner, Henning Beckmann, Dominik Gauß und Christian Risinger bedanken. Außerdem möchte ich Dominik „Dömi“ Gauß für die gemeinsame Peptidos-Zeit danken. Der Laborerstbesetzung Frank Sicherl, Franklin John, Marco Worch, Caroline Maierhofer und Daniel Specker danke ich für die herzliche Aufnahme und viele lustige Grillfeste.
Für den gemeinsamen Weg vom ersten Tag an der Uni Konstanz bis zum letzten, danke ich Magnus Schmidt und Henning Beckmann.
Natürlich gibt es ein Leben außerhalb des Labors. Auch da war Christian immer für mich da, ich danke Dir. Außerdem möchte ich meiner Familie und vor allem meiner Mutter Resi danken, die immer an mich geglaubt hat. Für die Möglichkeit zum Abschalten und Auspowern danke ich dem Masters-Team des RV Neptun; vor allem meinen Mädels vom Doppelvierer (Anja, Conny und Claudia) danke ich für viele gemeinsame Kilometer bei jedem Wetter.
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGEN VII
1 EINLEITUNG 1
1.1 Cyclische Peptide – Was ist ihr Nutzen? 1
1.2 Cyclopeptidbibliotheken 4
1.3 Die Problematik der Analytik 6
1.3.1 Die Ermittlung von Peptidsequenzen aus OBOC-Bibliotheken 6
1.3.2 Sonderfall cyclische Peptide 8
1.4 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide für SH2-Domänen-Mikroarray 10
2 AUFGABENSTELLUNG 13
2.1 Analytik von Cyclopeptiden 13
2.2 Synthese von fluoreszenzmarkierten Phosphopeptiden 14
3 SOLLBRUCHSTELLEN 15
3.1 Photolabile Sollbruchstelle 15
3.2 Methionin als Sollbruchstelle 26
3.2.1 Auswahl eines Linkers orthogonal zur Met-Sollbruchstelle 30
3.3 Tryptophan als Sollbruchstelle 40
3.4 Enzymatische Sollbruchstelle 44
3.5 Ringöffnung durch Edman-Abbau 46
4 ANALYTIK 47
4.1 De-novo-Sequenzierung 47
4.1.1 Massenspektrometrische Untersuchung der Bibliothek von cyclischen Peptiden mit photolabiler
Sollbruchstelle 50
4.1.2 Massenspektrometrische Untersuchung nach Anwendung der Met-Sollbruchstelle 51
4.2 Partieller Edman-Abbau (PED) 56
4.2.1 Die Mikrosequenzierung – der klassische Edman-Abbau 56 4.2.2 Partieller Edman-Abbau (PED) – die Leitersequenzierung 58 4.2.3 Erweiterung des PEDs auf OBOC-Cyclopeptidbibliotheken 59
5 ANWENDUNG DER METHODE 71
5.1 Streptavidin: Ein biologisches Modelltarget 71
5.2 Aufbau einer OBOC-Cyclopeptidbibliothek 75
5.3 Das Screening 77
5.3.1 Etablierung des Screenings 78
5.3.2 Screening der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86 81
5.4 Die Hitbead-Peptidsequenzen 83
5.5 Bestimmung der Bindungskonstanten 86
5.5.1 Synthese der ausgesuchten Peptidsequenzen 87
5.5.2 SPR-Experimente 88
6 SYNTHESE FLUORESZENZMARKIERTER PHOSPHOPEPTIDE 95
6.1 Darstellung von Phosphopeptiden 95
6.2 Auswahl des Fluoreszenzlabels 98
6.3 Synthese der beiden Peptide Y241 und pY241 99
6.4 Synthese der beiden Peptide Y230 und pY230 102
7 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 109
7.1 Analytik von Cyclopeptiden 109
7.2 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide 114
8 EXPERIMENTELLER TEIL 117
8.1 Allgemeine Angaben zur Analytik 117
8.1.1 HPLC 117
8.1.2 Massenspektrometrie 117
8.1.3 Kernresonanzspektroskopie 118
8.1.4 Infrarotspektroskopie 119
8.1.5 UV-Vis-Absorptionsspektroskopie 119
8.2 Allgemeine Arbeitsvorschriften für die SPPS 120
8.3 Synthetisierte Peptide 131
8.3.1 Synthese der photolabilen cyclischen Peptide 8-12 131 8.3.2 Synthese des cyclischen Peptids 31 zur Untersuchung von Methionin als Sollbruchstelle 134 8.3.3 Synthese des cyclischen Peptids 41 zur Untersuchung von Methionin als Sollbruchstelle 136 8.3.4 Synthese des Peptids 51/52 zur Stabilitätsuntersuchung des Glykolamid-Linkers und des HMBA-
Linkers 138
8.3.5 Synthese des festphasengebundenen Peptids 63 zur Untersuchung der Trp-Xaa Sollbruchstelle 140 8.3.6 Synthese des festphasengebundenen Peptids 66 zur Untersuchung von Trp als Linker 141 8.3.7 Synthese des festphasengebundenen Peptids 77 als Modellpeptid zur Etablierung des Partiellen
Edman-Abbaus (PED) 142
8.3.8 Synthese des Peptids 71 zur Untersuchung einer enzymatischen Ringöffnung 143 8.3.9 Synthese der Peptide (92-97) zur Bestimmung der KD-Werte 147
8.3.10 Synthese der fluoreszenzmarkierten Peptide 150
8.4 Modell in Lösung zur Aufklärung der Nebenreaktion im PED 156 8.4.1 Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-thiohydantoin (PTH-Val) 81 156 8.4.2 Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-hydantoin 82 157
8.5 On-bead-Screening 158
8.5.1 Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für das Screening: 158
8.5.2 Biotinyliertes TentaGel S-NH2 159
8.5.3 Enzymgekoppelter Farbreaktionstest 160
8.5.4 Partielle Edman-Sequenzierung 161
8.6 SPR-Experimente zur Bestimmung der KD-Werte 162 8.6.1 Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für die SPR-Experimente 162
8.6.2 Durchführung der SPR-Experimente 163
9 LITERATURVERZEICHNIS 165
10 ANHANG 171
Abkürzungen
Die Abkürzungen der Aminosäuren und Peptide richtet sich nach den Vorschlägen der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur. Diese können auf folgender Internetseite abgerufen werden URL: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb.
Cyclische Peptide werden durch ein vorgestelltes cyclo gekennzeichnet. Im Fall einer Seitenketten-Cyclisierung sind die an der Ringbildung beteiligten Aminosäuren unterstrichen.
AAV allgemeine Arbeitsvorschrift
Abb. Abbildung
abs. absolut
Ac Acetyl
All Allyl
Alloc Allyloxycarbonyl
AP Alkalische Phosphatase
aq. wässrig
BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indoylphoshat-Dinatriumsalz BNPS 2-Bromo-2-(2-nitrophenylsulfenyl)
Boc tert. Butyloxycarbonyl
BrCN Bromcyan
Bu Butyl
Bzl Benzyl
bzw beziehungsweise
c Konzentration ca. circa (ungefähr)
CHCA α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure COSY correlation spectroscopy DCC N,N’-Dicyclohexhylcarbodiimid
DCM Dichlormethan
DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure DIPEA Diisopropylethylamin
DMF N,N’-Dimethylformamid
EDC N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
EDT Ethandithiol
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay ESI Elektrospray-Ionisation
eq. Äquivalente
Fl Fluoreszenzlabel
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
GC Gaschromatographie
h Stunde
HATU O-Azabenzotriazolyl-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluoro- phosphat
HBTU O-Benzotriazolyl-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat HMBA 4-Hydroxymethylbenzoesäure
HOAt Hydroxyazabenzotriazol HOBt Hydroxybenzotriazol
Hsl Homoserinlacton
HSQC heteronuclear single quantum correlation IC50 Inhibitionskonstante
ID Innendurchmesser
IR Infrarot
J Kopplungskonstante KD Dissoziationskonstante
kDa kilo Dalton
M Molar
MALDI matrix assisted laser desorption ionisiation
Me Methyl
MeCN Acetonitril
MeIm Methylimidazol
MHz Megahertz
min Minuten
ml Milliliter
MS Massenspektrometrie
MSNT 1-(Mesitylene-2-sulphonyl)-3-nitro-1H-1,2,4-triazole
NBT p-Nitroblau-Tetrazoliumchlorid NBS N-Bromsuccinimid
neg. negativ
NHS N-Hydroxysuccinimid NMP n-Methylpyrrolidin
NMR nuclear magnetic resonance (Kernspinresonanz)
Nu Nucleophil
OBOC one-bead-one-compound
Pbf 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydro-benzofuran-5-sulfonyl PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PE Polyethylen
PED partial edman degradation (partieller Edman-Abbau)
Pip Piperidin
PITC Phenylisothiocyanat Pll Photolabilerlinker
pos. positiv
PTH 3-Phenyl-2-thiohydantoin
pY Phosphotyrosin
PyAOP 7-Azabenzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphonium-Hexa- fluorophosphat
PyBOP Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphonium-Hexafluoro- phosphat
Pyr Pyridin
ROESY rotating frame nuclear Overhauser and exchange spectroscopy RP-HPLC Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie
RU resonance units
SA Streptavidin
SH2 Scr-homology-2
SPPS solid phase peptide synthesis
SPR surface plasmon resonance (Oberflächen-Plasmonen-Resonanz) SRBS Sulforhodamin-B-sulfonyl
Su Succinimid
TBS Tris-gepufferte Salzlösung TFA Trifluoressigsäure
TG Tenta Gel
Thi Thienylalanin
THF Tetrahydrofuran
TIS Triisopropylsilan
TNBS 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure TOF time of flight
TOCSY total correlation spectroscopy
tR Retentionszeit
Tris Tri(hydroxymethyl)-aminomethan
Trt Trityl
UV Ultraviolett
Xaa beliebige Aminosäure
1 Einleitung
1.1 Cyclische Peptide – Was ist ihr Nutzen?
Cyclische Peptide sind in der Natur weit verbreitet. Man kann sie in Pflanzen, Pilzen[1], maritimen Schwämmen, anderen einfachen marinen Lebewesen und Bakterien nachweisen.[2, 3] Wie andere Naturstoffe auch, zeigen viele cyclische Peptide ein vielversprechendes therapeutisches Potential. Durch ihre Aminosäurebausteine sind sie dem menschlichen Organismus nicht fremd. Im Vergleich zu ihren linearen Analoga weisen sie eine höhere metabolische Stabilität (verminderter enzymatischer Abbau in vivo) auf, wodurch eine größere Wirkungsdauer bei medizinischem Einsatz zu erwarten ist. Zudem wird die kon- formative Flexibilität des Peptidrückgrats durch die cyclische Form beträchtlich reduziert. Dies kann eine deutliche Erhöhung der Bindungsaffinität und der Rezeptorselektivität hervorrufen. Desweiteren wurde eine erhöhte Membrandurch- gängigkeit postuliert, welche jedoch noch diskutiert wird[4].
Auch heute schon stellen cyclische Peptide eine Verbindungsklasse dar, die entscheidende Beiträge zur Behandlung von Krankheiten leisten konnten.
Cyclosporin A 1, auch Ciclosporin, als Medikament unter Sandimmun (Novartis), Cicloral (Hexal) und Ciclosporin Pro (Teva) bekannt (Abb. 1.1), ein Immuno- suppressivum, wird als Calcineurin-Inhibitor vor allem in der Transplantationsmedizin verwendet. Der Wirkstoff bindet an Calcineurin und blockiert im Zellplasma so die Bindung an NF-AT (nuclear factor activating t-Cell), ein Gen-regulierendes Protein. In aktivierten T-Zellen ist Calcineurin für die Dephosphorylierung von NF-AT verantwortlich. Daraufhin kann NF-AT in den Zellen transloziert werden und dort die Transkription von zahlreichen Zytokinen und Zelloberflächenrezeptoren (u. a.
Interleukin-2 und Gamma-Interferon) aktivieren. Als Arzneimittel eingesetzt führt Cyclosporin A also zu einer eingeschränkten Aktivität des Immunsystems und senkt somit zum Beispiel das Risiko der Organabstoßung nach einer Transplantation.
Echinocandin 2 (Abb. 1.1) gab einer ganzen Substanzgruppe ihren Namen. Zur Wirkstoffklasse der Antimykotika zugehörig, werden sie zur Behandlung von Pilzinfektionen eingesetzt. Echinocandine inhibieren die β(1-3)-D-Glucan Synthase, ein Enzym zur Synthese von β(1-3)-D-Glucan. Dieses ist ein wichtiger Baustein für den Aufbau von Zellwänden in Pilzen.
Das cyclische Depsipeptid Daptomycin 3 (Abb. 1.1), als Medikament unter Cubicin bekannt (Cubist Pharmaceuticals), ist ein Antibiotikum. Der Arzneistoff wird vor allem bei Haut- und Weichteilinfektionen mit gram-positiven Problemkeimen eingesetzt.
Oftmals ist der Wirkstoff auch dann noch wirksam, wenn andere Antibiotika aufgrund von Resistenzen bei der Therapie versagen.
Abb. 1.1: Beispiele für cyclische Peptide in der Therapie. Ciclosporin 1, ein Immuno- suppressivum, Echinocandin 2, ein Antimykotikum und Deptamycin 3, ein Antibiotikum.
Neben ihrem breiten Einsatzbereich als Wirkstoffe eignen sich cyclische Peptide, aufgrund ihrer hohen Rezeptorselektivität und Bindungsaffinität, auch als molekulare Hilfsmittel in der Diagnostik. So kann beispielsweise rheumatische Arthritis mit dem sogenannten anti-CCP-Test mit einer Sensitivität von nahezu 80% und einer Spezifität von nahezu 98% nachgewiesen werden.[5] Zur Diagnostik wird im Blut nach Rheumafaktoren (RF-Antikörpern) gesucht. Peptide, bei denen Arginin durch das Enzym Peptidylarginin-Deiminase (PAD) in Citrullin umgewandelt wurde, konnten als natürliches Antigen mit rheumatoider Arthritis in Zusammenhang gebracht werden.
Antikörper gegen citrullinierte Peptid-/Protein-Antigene (ACPA) gelten als sogenannter Biomarker für die rheumatoide Arthritis und werden in einem ELISA (enzym-linked immunosorbent assay) nachgewiesen. Es gelang, ein synthetisches cyclisches Peptid darzustellen, das sich vom natürlichen Antigen ableitet und eine deutlich erhöhte Bindungsaffinität zu diesem Antikörper aufweist. Für den Anti-CCP- Test wird dieses cyclische citrullinierte Peptid (ccp) an der Oberfläche von Mikrotiterplatten immobilisiert. Daraufhin erfolgt eine Inkubation mit dem Antikörper (ACPA in Patientenserum). Durch erneute Inkubation mit einem anti-humanen IgG- Peroxidase-Konjugat und anschließender Farbreaktion kann der Biomarker ACPA nachgewiesen werden. Diese Entwicklung hat nicht nur zu einer deutlichen Verbesserung in der Labordiagnostik geführt, sondern ermöglicht auch die Diagnose der Krankheit in frühen Stadien.
Desweiteren eignen sich cyclische Peptide auch als molekulare Werkzeuge bei der Suche nach einem hoch affinen Rezeptor (oder beim Verständnis des Struktur- Wirkungs-Mechanismus).[6] Die konformative Einschränkung der cyclischen Peptide erleichtert die Bestimmung der für die biologische Wirkung bedeutenden drei- dimensionalen Struktur der aktiven Substanzen.
1.2 Cyclopeptidbibliotheken
Die Auswahl an Methoden zur Darstellung von Cyclopeptidbibliotheken ist inzwischen sehr groß. Prinzipiell eignen sich alle Methoden, die auch für die Synthese von Bibliotheken linearer Peptide zur Verfügung stehen; da man üblicherweise zunächst die lineare Peptidsequenz synthetisiert und anschließend unter Einsatz einer gezielten Schutzgruppenstrategie eine selektive Cyclisierung vornehmen kann. Gängige Verfahren zur Synthese von Peptidbibliotheken sind Multiple-Pin-Methode,[7] Tea-Bag-Methode,[8] Split-Mix-Methode,[9, 10] lichtgesteuerte Synthese[11] und Spot-Synthese[12] Viele dieser Methoden erfordern jedoch eine spezielle und vor allem teure Laborausstattung. Bei der sogenannten Split-Mix- Methode[9, 10] ist das nicht der Fall, weshalb sie häufig die Methode der Wahl ist.
Abb. 1.2 Das Prinzip der Split-Mix-Methode.
Bei der von Furka vorgestellten Split-Mix-Methode wird das Harz vor dem ersten Reaktionsschritt in mehrere gleich große Aliquote aufgeteilt (engl. split) und separat mit dem entsprechenden Reaktionsbaustein zur Reaktion gebracht. Nach der Reaktion werden die Harzaliquote vereinigt (engl. mixed) und nach der Aufarbeitung erneut aufgeteilt, um den zweiten Baustein anzukuppeln (Abb. 1.2). Dieser Zyklus, bestehend aus Aufteilen, Reaktion und Vereinigen, wird solange wiederholt, bis die gewünschte Anzahl der Schritte erreicht ist. Man erhält eine Bibliothek mit
N = ax Komponenten, wobei a die Anzahl der Reaktionsbausteine pro Zyklus und x die Anzahl der Zyklen ist. Da sich pro Reaktionsgefäß immer nur ein Reaktand in Lösung befindet, können alle Reaktionen, trotz unterschiedlicher Kinetik, bis zum vollständigen Umsatz geführt werden. Das vorrangige Ziel von Furka bestand in der Darstellung von Peptidmischungen innerhalb kürzester Zeit.
1991 erkannten Lam et al. ein weiteres Potential von Split-Mix-Bibliotheken.[13] Auf jeder Harzkugel einer Substanzbibliothek befindet sich nur eine Verbindung in vielfacher Kopie (One-Bead-One-Compound, OBOC). Verzichtet man also auf die Abspaltung des Peptids vom Harz, kann man eine große Anzahl von Peptiden testen und anschließend getrennt identifizieren. Um sicherzustellen, dass jede theoretisch mögliche Verbindung in der Bibliothek enthalten ist, muss die Anzahl der eingesetzten Harzkugeln groß genug sein. Statistische Musterrechnungen hierzu können den Publikationen von Burgess et al.[14] und Zhao et al.[15] entnommen werden.
1.3 Die Problematik der Analytik
1.3.1 Die Ermittlung von Peptidsequenzen aus OBOC-Bibliotheken
Der Preis, den man für die hohe Syntheseeffizienz der OBOC-Bibliotheken zu zahlen hat, ist die Notwendigkeit einer eindeutigen Substanzidentifikation jeder positiv getesteten Kugel. Zur Sequenzierung von linearen Hitpeptiden aus einer OBOC- Bibliothek stehen vier verschiedene Methoden zur Wahl. Diese sind im Fließschema in Abb. 1.3 dargestellt.Abb. 1.3 Methode zur Ermittlung der Peptidsequenz, die sich auf einer als positiv getesteten Harzkugel aus einer OBOC-Bibliothek befindet.
Bei der Leitersynthese[16] wird das Problem der Analytik bereits während der Synthese, das heißt dem Split-Mix-Aufbau der Bibliothek, bedacht. Hierzu wird bei jedem Kupplungsschritt ein kleiner Teil der im Aufbau befindlichen Peptidsequenz gecappt, beispielsweise durch Zugabe von 5% Ac-Ala-OH oder der entsprechenden Boc-geschützten Aminosäure. Die weiteren Arbeitsschritte verlaufen analog zum
Split-Mix-Protokoll. Nach dem Screening werden die positiv getesteten Kugeln aussortiert. Die an der Kugel gebundene Peptidleiter muss nur noch abgespalten werden und steht dann zur massenspektrometrischen Analyse zur Verfügung. Aus den erhaltenen Massenspektren kann nun die Sequenz ausgelesen werden. Der große Nachteil dieser Methode ist, dass das One-Bead-One-Compound Prinzip verloren geht, da sich beim Screening die ganze Peptidleiter auf der Kugel befindet und somit alle „Leitersprossen“ als potentielle aktive Verbindungen zur Verfügung stehen. In späteren Veröffentlichungen[17] versuchte man, dieses Problem durch eine Aufteilung der Kugel in äußere und innere Schale (biphasic beads) zu umgehen. Die Synthese wird dabei so modifiziert, dass beim Screening der Bibliothek die eigentlich zu testende Substanz dem Target/Rezeptor auf der äußeren Schale angeboten wird, während sich die zur Verschlüsselung mitsynthetisierte Peptidleiter im Innern der Kugel befindet.
Ganz ohne Verschlüsselung kommen hingegen tandem-MS, Edman-Abbau und die Leitersequenzierung aus. Zur rein massenspektrometrischen Sequenzierung (tandem-MS) von aktiven Peptiden aus OBOC-Bibliotheken wird das Peptid vor der Probenvorbereitung von der Kugel gespalten.[18] Während der massenspektro- metrischen Charakterisierung wird das intakte Peptidion im Massenspektrometer isoliert und anschließend fragmentiert. Aus den erhaltenen Peptidfragment- ionsignalen können dann Rückschlüsse auf die Peptidsequenz gezogen werden. Für die Durchführung solcher Experimente benötigt man jedoch ein speziell zur Sequenzierung ausgestattetes Massenspektrometer, das die Möglichkeit bietet, Peptidionen zu isolieren und zu fragmentieren.[19-23] Während meiner Diplomarbeit konnte ich zeigen, dass harzgebundene Peptide mittels MALDI-FTICR-MS/MS sequenzierbar sind.[24] Durch den Einsatz eines photolabilen Linkers erfolgte die Abspaltung des Peptids vom Harz durch den Laserstrahl der MALDI-Quelle, wodurch ein vorheriges Abspalten vom Harz entfiel. Die Gruppe um Albericio zeigte eine Sequenzierung mittels MALDI-TOF/TOF-MS.[25] Die Abspaltung des Peptids erfolgte hierbei direkt auf dem MALDI-Target durch Einwirkung von Ammoniakdampf (Spaltung des HMBA-Linkers). Zur weiteren Probenpräparation musste lediglich Matrix addiert werden.
Eine weitere Möglichkeit der direkten Sequenzierung von Peptiden, die sich auf Hitbeads aus einem Screening befinden, bietet der Edman-Abbau, auch Mikro- sequenzierung genannt. Hier wird jede positiv getestete Kugel einzeln der klassischen Mikrosequenzierung zugeführt. Ein vorheriges Abspalten des Peptids vom Harz ist nicht erforderlich, da während des Abbaus Aminosäure für Aminosäure vom Harz gespalten und anschließend mittels RP-HPLC detektiert wird. Mit einer Sequenzierungsrate von 3-4 Kugeln pro Tag ist diese Methode jedoch sehr zeit- intensiv und eignet sich dadurch nur bedingt zum Einsatz im Hochdurchsatz- verfahren.
Die Leitersequenzierung[26], welche partiellen Edman-Abbau mit anschließender MALDI-TOF Massenspektrometrie umfasst, wurde ursprünglich als zeitsparende Methode zur Sequenzierung von Peptiden in Lösung eingeführt. Die Gruppe um Pei übertrug diese Methode auf festphasengebundene Peptide aus OBOC- Bibliotheken.[27] Hierzu werden alle Kugeln, die eine positiv getestete Peptidsequenz tragen, vereinigt und anschließend einem gemeinsamen partiellen Edman-Abbau unterzogen. Der partielle Abbau wird durch die Behandlung mit einer Mischung aus PITC (zur Spaltung) und Fmoc-OSu (zum Capping) realisiert. Am Ende erhält man auch hier eine Fragmentleiter, welche mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF- MS) nachgewiesen wird.
1.3.2 Sonderfall cyclische Peptide
Möchte man eine rein massenspektrometrische Sequenzanalyse (tandem-MS/
De-novo-Sequenzierung) auf einen kombinatorischen Ansatz anwenden, so ist der Erhalt aller Fragmentionen zur vollständigen und eindeutigen Sequenzierung unbedingt notwendig. Demnach muss die Wahrscheinlichkeit eines Bindungsbruchs zwischen den Aminosäuren im gesamten Peptid gleich groß sein. Wird dieses Prinzip zur Sequenzierung cyclischer Peptide verwendet, so sollte der Bruch des peptidischen Rings an jeder beliebigen Stelle gleich wahrscheinlich sein. Die dadurch erhaltenen linearen Peptidfragmente haben eine gemeinsame Zusammensetzung der Aminosäuren, somit eine identische Masse, aber eine unterschiedliche Aminosäuresequenz. Weitere Fragmentierungen führen zu immer komplexeren Spektren.[28] In der Gruppe von Ghadiri wurde ein Computerprogramm entwickelt,
welches LC-MS/MS-Spektren automatisiert aus- bzw. bewertet. Das Programm ist speziell auf cyclische Peptide aus OBOC-Bibliotheken zugeschnitten und berücksichtigt durch die Split-Mix-Synthese vorhandene Sequenzinformationen, wie eingesetzte Aminosäuren, sowie die Anzahl und Häufigkeit der Aufspaltungen. Zur Auswertung können jedoch keine Peaklisten, sondern lediglich die erhaltenen Rohdaten von Hitachi 3DQ-ion trap Massenspektrometern herangezogen werden.[29]
A B C D E B C D E A
C D E A B D E A B C E A B C D
a
b
E D C
B A b a
Abb. 1.4 Die Isolierung und anschließende Fragmentierung eines cyclischen Peptids im Massenspektrometer führt zu einer Reihe von Fragmentionen mit identischer molekularen Masse aber unterschiedlicher Aminosäurensequenz.
Soll zur Sequenzierung eines cyclischen Peptids eine auf Edman-Chemie basierende Sequenzierungsmethode (Microsequenzierung oder Leitersequen- zierung) zum Einsatz kommen, ist das Vorhandensein des freien N-Terminus unbedingt notwendig.
Eine präanalytische, also unmittelbar vor der Sequenzierung stattfindende, Umwandlung der cyclischen Peptide in lineare Peptide würde einen deutlich besseren Zugang zur Sequenzinformation mittels massenspektrometrischer und Edman-basierter Methoden ermöglichen.
1.4 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide für SH2-Domä- nen-Mikroarray
Scr-homology-2-(SH2)-Domänen sind eine von vielen Familien innerhalb der Proteindomänen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Signaltransduktion vermitteln. Wie andere Domänen auch, sind SH2-Domänen über eine konservierte Region in der Aminosäuresequenz definiert. Die charakteristische Faltung dieser 100 Aminosäuren umfassenden Domäne ermöglicht eine spezifische Erkennung und Bindung an Phosphotyrosin-beinhaltende Liganden. Phosphotyrosin (pY) bein- haltende Protein-Protein Wechselwirkungen, wie zum Beispiel solche, die durch SH2-Domänen ermöglicht werden, sind eines der primary means, um Signalproteine zu rekrutieren und spielen daher eine Hauptrolle bei der Signalübermittlung. SH2- Domänen wurden in Enzymen, Adapterproteinen, Regulationsuntereinheiten von Signalproteinen, Gerüstproteinen, Transkriptionsfaktoren und onkogenen Proteinen gefunden. Diese Proteine sind fest eingebunden in den Prozess der Signalüber- mittlung, da sie als Verbindung zwischen Rezeptor und nachgeordneten Signal- moleküle fungieren. Sie vermitteln Signale zwischen Zellen und regulieren die Kinaseaktivität bestimmter Proteine.[30] Die Phosphorylierung von Proteinen ist eine
Abb. 1.5 C-terminale Aminosäuresequenz [222-252] des CEACAM3 Proteins. Die beiden Tyrosine (Y230 und Y241) sind fettgedruckt hervorgehoben.
Ausgehend von diesen beiden Y, sieben Aminosäuren in der Sequenz in Richtung C- und N-Terminus, ergeben sich die zwei ITAM-ähnlichen Sequenzen (Peptid Y230 beziehungsweise Y241), die unterstrichen hervorgehoben sind.
der Haupinformationsleitungen der zellulären Verständigung. Eine Störung im SH2- Domänen-abhängigen Signalweg kann oftmals direkt oder indirekt mit Humanerkrankungen in Verbindung gebracht werden.
Die Arbeitsgruppe um Prof. Christof Hauck (Fachbereich Biologie, Universität Konstanz) beschäftigt sich ausführlich mit der Aufklärung der Rolle der ITAM (immunoreceptor tyrosine based activation motif)-ähnlichen Sequenzen von CEACAM3 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule) in Signalwegen (Abb. 1.5). Mit Hilfe eines SH2-Domänen-Mikroarrays soll ermittelt werden, an welche SH2-Domänen die ITAM-ähnlichen Sequenzen von CEACAM3 binden. Hierzu soll eine mit unterschiedlichen SH2-Domänen versehene Glas- oberfläche mit einem synthetischen Peptid, welches Phosphotyrosin beinhaltet und mit einem Fluoreszenzlabel versehen wurde, inkubiert werden. Findet eine Ligand- Proteinwechselwirkung statt, kann diese im Chipreader mittels Fluoreszenz sichtbar gemacht werden (Abb. 1.6). Durch die Identifikation der SH2-Domänen, an die der zu erforschende Ligand bindet, kann nachgewiesen werden, an welchem Signalweg dieser Ligand beteiligt ist.[31]
Abb. 1.6 SH2-Domänen-Mikroarray: a) Der Glasträger wird mit unterschiedlichen SH2- Domänen versehen. b) Inkubation mit einem Phosphotyrosin beinhaltenden und fluoreszenzmarkierten Peptid (möglicher Ligand). c) Ligand bindet nur am passenden Rezeptor und kann über Fluoreszenz nachgewiesen werden.
2 Aufgabenstellung
2.1 Analytik von Cyclopeptiden
In der Natur sind cyclische Peptide weit verbreitet. In vielen Fällen weisen sie eine hohe biologische Aktivität auf und stellen somit eine potentielle Substanzklasse für Wirkstoffe, Leitstrukturen und molekulare Werkzeuge dar. Die Split-Mix-Synthese[10]
ermöglicht eine effiziente und schnelle Darstellung cyclischer OBOC- Peptidbibliotheken[13] mit einer großen Mitgliederzahl. Nach dem Screening, dem Test der Mitglieder auf Aktivität, stößt man jedoch bei der Analytik der Hitbeads auf den Engpass der Methode. Zur Identifikation der aktiven Komponente steht lediglich eine einzelne Harzkugel zur Verfügung. An diese sind je nach Beladungsdichte typischerweise zwischen 100 pmol und 5 nmol der aktiven Verbindung gebunden.
Aufgrund ihrer hohen Sensitivität können Massenspektrometrie und auch auf Edman- Abbau basierte Methoden zur Analytik solch geringer Peptidmengen herangezogen werden. Neben der geringen Substanzmenge weisen OBOC-Cyclopeptid- bibliotheken jedoch noch eine weitere analytische Herausforderung auf. Sie besitzen oft keinen freien N-Terminus und sind somit für die Chemie des Edman-Abbaus nicht zugänglich. Auch in der Massenspektrometrie liefern sie aufgrund ihrer cyclischen Verbrückung meist keine eindeutig auswertbaren Spektren.[28] Eine präanalytische, also unmittelbar vor der Sequenzierung stattfindende, Transformation der cyclischen Peptide in lineare Peptide würde einen deutlich besseren Zugang sowohl zu massen- spektrometrischen, als auch zu Edman-basierten Methoden ermöglichen.
Ziel der Arbeit war die Entwicklung einer effizienten Methode zur Sequenzierung cyclischer Peptide, die als aktive Substanzen aus einer OBOC-Bibliothek her- vorgingen. Zunächst sollte die Einführung und Spaltung molekularer Sollbruchstellen zur gezielten Peptidringöffnung untersucht werden. Die daraus resultierenden, vormals cyclischen, Peptide sollten anschließend zuverlässig mit in unseren Laboratorien zur Verfügung stehenden Methoden sequenziert werden. Nach der Entwicklung der Methode sollte ihr Nutzen anhand einer konkreten Anwendung gezeigt werden. Die durch die Anwendung gefundenen Cyclopeptide sollten schließlich auf Ihre Bindungsaktivität hin untersucht werden.
2.2 Synthese von fluoreszenzmarkierten Phosphopeptiden
Für den Einsatz im SH2-Domänen-Mikroarray (mehr dazu in Kapitel 1.4) sollten die in Abb. 2.1 gezeigten Peptide Y241 und Y230 synthetisiert werden. Die Tyrosine sollten in jeder der beiden Sequenzen als Phosphotyrosin (aktive Peptide: pY241 und pY230) beziehungsweise als Tyrosin (Negativkontrolle: Y241 und Y230) vorliegen, so dass sich vier synthetische Peptide ergeben. Die Peptide sollten als Peptidylsäuren erhalten werden. Für den Einsatz im Mikroarray sollten die Peptide mit einem mit dem Chip-Reader kompatiblen Fluoreszenzlabel versehen werden.
Abb. 2.1 Die fluoreszenzmarkierten Peptide (Fl = Fluoreszenzlabel).
3 Sollbruchstellen
Für eine spätere Sequenzierung cyclischer Peptide müssen diese, wie in der Einleitung beschrieben, in lineare Peptide überführt werden. Zunächst wurden daher mehrere Herangehensweisen experimentell untersucht, um eine Sollbruchstelle in den peptidischen Ring einzubringen. Denkbar sind chemische und enzymatische Sollbruchstellen. Der Ring muss erst geöffnet werden und anschließend das lineare Peptid von der Kugel gespalten werden. Auf den Einsatz von Disulfidbrücken, eine Verbrückung über Cysteinseitenketten, wurde bewusst verzichtet, da ein selektives und stabiles Öffnen bzw. Schließen des peptidischen Rings auf diese Weise als problematisch eingestuft wird.[32-34]
3.1 Photolabile Sollbruchstelle
Lichtinduzierte Spaltungsreaktionen ermöglichen eine Erweiterung der Orthogonalität von Linkern und Schutzgruppen in der präparativen organischen und kombi- natorischen Synthese auf eine weitere Dimension. Die photolytische Spaltung verläuft unter sehr milden Reaktionsbedingungen und kommt ohne Erwärmen und ohne Zusatz von Reagenzien aus. Ein erster Ansatz bestand daher im Einbau einer photolabilen Sollbruchstelle.
Abb. 3.1 Zwei von Holmes et al. entwickelte photolabile Linker. Nach photoinduzierter Reaktion erhält man eine Peptidylsäure (wenn X=O), beziehungsweise ein Peptidylamid (wenn X=N).
Die in Abb. 3.1 gezeigte Verbindung 4 enthält einen kommerziell erhältlichen photolabilen Linker[35, 36], wie er auch in meiner Diplomarbeit verwendet wurde. Durch Laserbestrahlung (Stickstofflaser, 337 nm), zum Beispiel während der Laser-
induzierten Ionisierung im MALDI-Experiment, kann das Peptid direkt vom Harz gespalten werden. Ein vorheriges Abspalten zur Probenvorbereitung ist nicht notwendig. Im Rahmen meiner Diplomarbeit konnte ich jedoch feststellen, dass die Esterverknüpfung in Verbindung 4 unter Standard-Abspaltbedingungen von säurelabilen Schutzgruppen (TFA/TIS/Wasser (95:2,5:2,5)) nicht vollständig stabil ist.
Die Amidverknüpfung zwischen Peptid und Linker in Verbindung 5 sollte diese Säurelabilität hingegen nicht aufweisen. Da es sich bei diesem Linker um eine Verbindung mit Carboxyl- und Aminogruppe handelt, also eine „Amino-Säure“- Funktionalität vorliegt, sollte diese Verbindung innerhalb einer Peptidkette auch als Sollbruchstelle nutzbar sein. Wird die Verbindung als Linker zwischen fester Phase und Peptid und zugleich im Peptidzyklus verwendet, so sollte eine gleichzeitige Abspaltung des Peptids von der festen Phase und eine Peptidringöffnung möglich sein (Abb. 3.2). Der für den Aufbau von Verbindung 5 notwendige Baustein 7 ist kommerziell nicht erhältlich.
Abb. 3.2 Wird der photolabile Linker zwischen Peptid und Harzkugel und im cyclischen Peptid verwendet, so sollte durch Bestrahlung der Peptidzyklus gezielt geöffnet und gleichzeitig das Peptid vom Harz gespalten werden.
Abb. 3.3 zeigt diesen kommerziell nicht erhältlichen Linker 7, der freundlicherweise im organischen Grundpraktikum unter der Leitung von Herrn Dr. Huhn nach einer Vorschrift von Holmes et al. dargestellt wurde.[35] Ausgehend von 4-Hydroxy-3-meth- oxyacetophenon kann dieser in sieben Stufen mit einer Literaturausbeute von 56%
synthetisiert werden.
Abb. 3.3 Der Fmoc-geschützte photolabile Linker (Fmoc-Pll-OH) 7 kann ausgehend von 4-Hydroxy-3-methoxy-acetophenon 6 in sieben Schritten synthetisiert werden.
Um zunächst die photolabile Sollbruchstelle untersuchen zu können, wurde eine kleine Bibliothek von cyclischen Peptiden an SieberAmid-TentaGel-Harz synthetisiert (Abb. 3.4). Die Verwendung des SieberAmid-Linkers ermöglichte das Abspalten der cyclischen Peptide, ohne den Ring zu öffnen. So konnte eine anschließende Charakterisierung und eine Studie der Spaltung der Sollbruchstelle folgen.
Abb. 3.4 Durch parallele Synthese erhaltene Bibliothek von Cyclopeptiden.
Abb. 3.5 zeigt exemplarisch für alle Peptide den Syntheseweg zur Darstellung von Peptid 8. Die Synthese der linearen Vorläufersequenz erfolgte im 10 µmol Ansatz am Peptidsynthesizer unter Fmoc-Bedingungen. Der Synthese- verlauf wurde über eine Leitfähigkeitsmessung der Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Die photolabile Aminosäure 7, welche später als Sollbruchstelle im Ring fungiert, wurde manuell angeknüpft. Nach vollständiger Elongation der Peptide wurde die N-terminale Fmoc-Gruppe abgespalten. Anschließend wurde das Peptidylharz mit Pd(0) und Diaminoboran-Komplex in DCM behandelt, um die Allyl-Schutzgruppe der Glutaminsäurenseitenkette zu entfernen. Die Cyclisierung erfolgte über eine
N-Terminus-zu-Carbonsäureseitenkette-Amidverknüpfung. Dazu wurde die Carboxyl- gruppe der Glutaminseitenkette mit PyBOP/HOBt und DIPEA aktiviert. Nach jedem wichtigen Syntheseschritt erfolgte eine Testabspaltung des Peptids von der festen Phase und eine anschließende Charakterisierung mittels RP-HPLC und offline-MS.
NH O
HN NH
O O
O
NO2
MeO
O O
O N
HN O O
NH NH
HN NH O
HN
O O
Fmoc-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-SieberAmid-
Fmoc-Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(OAll)-Lys(Boc)-SieberAmid- 1) 20% Piperidin in DMF
2) Fmoc-Pll-OH7/HOBt/
HBTU/DIPEA
(4 eq: 6 eq: 4 eq: 8 eq), 19h
4) [Pd(PPh3)4]/(CH3)2NHBH3(0,8 eq: 15 eq) 5) 20% Piperidin in DMF
H-Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu-Lys(Boc)-SieberAmid-
6) PyBOP/HOBt/DIEA (5 eq: 5 eq: 10eq), 18,5h
SieberAmid
13 14
15 16
18 17
19 TFA/TIS/H20 8
TFA/TIS/H20 TFA/TIS/H20 TFA/TIS/H20
Abb. 3.5 Nach automatisierter Elongation des linearen Vorläuferpeptids 13 wurde manuell die photolabile Aminosäure 7 (Fmoc-Pll-OH) angeknüpft. Nach Abspaltung der Fmoc- und Allyl-Schutzgruppe erfolgte die Cyclisierung. Nach jedem wichtigen Syntheseschritt erfolgte eine Testabspaltung mit anschließender RP-HPLC-offline-MS-Charakterisierung. Den Syntheseweg durchliefen alle fünf Bibliotheksmitglieder (Peptid 8-12) getrennt nacheinander.
Die erhaltenen Chromatogramme sind in Abb. 3.6 dargestellt. Zur Peptidsequenzierung wurden massenspektrometrische Untersuchungen vorgenommen, die in Abschnitt 4.1.1 näher beschrieben werden.
Abb. 3.6 RP-HPLC-Diagramm der Testabspaltungen während der Synthese von 8. Die Peak-Fraktionen wurden aufgesammelt und anschließend massenspektro- metrisch untersucht.
Säule: C18 Nucleosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte Detektorwellenlänge ist 254 nm. Gradient: 10-85% MeCN in 30 min (MeCN und H2O mit 0.1% TFA).
In den Chromatogrammen der cyclischen Peptide 8-12 traten immer zwei Hauptpeaks auf (Abb. 3.6 in grün abgebildet), welche massenspektrometrisch nicht zu unterscheiden waren. Da die photolabile Aminosäure 7 eine chirale Verbindung ist, die nicht enantiomerenrein in der SPPS eingesetzt wurde, entstehen Diastereomere. Möglicherweise sind diese nach der Cyclisierung in ihrer Konformation soweit eingeschränkt, dass sie sich chromatographisch voneinander trennen lassen. Zur Bestätigung dieser Hypothese wurde das cyclische Peptid 10 erneut synthetisiert, beide Produkte aufgetrennt und NMR-spektroskopisch untersucht. Die Synthese erfolgte wie bereits oben beschrieben.
Abb. 3.7 RP-HPLC-Diagramm nach einer Testabspaltung des photolabilen cyclischen Peptids 10 mit 1% TFA. Unter diesen Bedingungen bleibt die Boc- Schutzgruppe weitestgehend im Peptid erhalten. Deutlich zu erkennen sind zwei Produktpeaks pro Peptid.
Säule: C-18 Nuclosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte Detektorwellenlänge ist 254 nm. Gradienten: 10-85% MeCN in 20 min. Beiden Eluenten (Wasser und MeCN) wurde je 0.1% TFA zugesetzt.
Abb. 3.7 zeigt das Chromatogramm eines analytischen RP-HPLC-Laufes nach einer Testabspaltung des Peptids 10. Unter den bei der Testabspaltung verwendeten Standard-SieberAmid-Abspaltbedingungen (TFA/TIS/DCM (1:1:98)) bleibt die Boc- Schutzgruppe weitestgehend auf der Aminogruppe der Lysinseitenkette erhalten. Die quantitative Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgte durch Behandlung mit TFA/TIS/DCM (95:2,5:2,5), wodurch simultan die Boc-Schutzgruppe entfernt wurde.
Mittels präparativer RP-HPLC wurden die beiden Komponenten voneinander getrennt. Zur NMR-spektroskopischen Untersuchung wurden von beiden Produkten COSY-, HSQC-, TOCSY- und ROESY-Experimente durchgeführt. Die Durchführung eines NOESY-Experiments ist für diese Verbindung nicht sinnvoll, da die Intensität der erhalten Signale von der molaren Masse abhängt und bei ca. 1000 g/mol gegen Null geht. Die vollständige Auswertung der erhaltenen Datensätze bestätigt, dass es sich um zwei cyclische Peptide der gleichen Sequenz mit vermutlich unterschiedlicher Konfiguration handelt. Abb. 3.8 zeigt exemplarisch einen Ausschnitt aus einem ROESY-Spektrum, aus dem die Sequenz ausgelesen werden kann. Alle weiteren NMR-Daten können dem Anhang entnommen werden.
Abb. 3.8 Ausschnitt aus dem 600-MHz-ROESY-Spektrum von Peptid 10 (nach prä- parativer Auftrennung; Fraktion tR = 9,7min). Schematisch eingezeichnet ist die Zuordnung der Peptidsequenz. Die Kreuzsignale sind mit der in Cara[37]
üblichen Nomenklatur bezeichnet. Die zur Auswertung verwendeten Signale sind mit gelb hervorgehoben und zur besseren Verständlichkeit mit Nummern versehen, die sich in der Struktur oben wieder finden.
Abb. 3.9 Denkbarer Reaktionsmechanismus der photolytischen Spaltung.[38]
Für eine kinetische Untersuchung der photolytischen Sollbruchstelle wurde Peptid 9 herangezogen. Durch Behandlung des Harzes mit 1% TFA wurde das Boc- geschützte Peptid 9 von der festen Phase gespalten und anschließend gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus Aceto- nitril (66,6%), Methanol (16,6%), Wasser (16,3%) und Ameisensäure (0,3%) (v/v) gelöst und in ein HPLC-Probegefäß überführt. Anschließend erfolgte eine Bestrahlung der Peptidlösung mit UV-Licht (366 nm) für 20, 60, 120, 180, 240 und 360 Sekunden. Ein hypothetischer Reaktionsmechanismus kann Abb. 3.9 entnommen werden.[38] Nach Ablauf der Bestrahlungsdauer wurden RP-HPLC- Chromatogramme von je 10 µl Peptidlösung aufgenommen. In Abb. 3.10 ist eine Auswahl der erhaltenen Chromatogramme dargestellt. Vor der Bestrahlung zeigt das Chromatogramm den Doppelpeak (rot hervorgehoben) des cyclischen Peptids 9 bei Retentionszeiten von 13,3 und 13,6 min. Im Verlauf der Reaktion nimmt dieser Eduktpeak, wie erwartet, ab. Synchron zu seinem Verschwinden, wurde die Entstehung eines Produkts (blau hervorgehoben) bei einer Retentionszeit von 12,6 min beobachtet, dessen UV-Spektrum leicht bathochrom verschoben ist. Das neu gebildete Produkt zeigte das Phänomen des Doppelpeaks nicht, was nicht weiter verwunderte, da während der Photoreaktion das Chiralitätszentrum verloren geht. Mit zunehmendem Reaktionsverlauf ist eine weitere Produktbildung (tR 13,2 min, grün hervorgehoben) zu erkennen. Da zwischen den einzelnen Bestrahlungszyklen immer ein HPLC-Lauf erfolgte, lag die Vermutung nahe, dass es sich hierbei nicht um eine photolytische Reaktion, sondern um eine Zersetzung des photolytischen Spalt- produktes handeln könnte. Deshalb wurde die Peptidlösung nach der letzten
Bestrahlung für 62 Stunden im Kühlschrank gelagert und erneut mittels RP-HPLC untersucht. Ein Vergleich der Chromatogramme zeigte eine deutliche Abnahme des photolytischen Spaltproduktes (blau hervorgehoben) und eine Zunahme der neuen Komponente mit einer Retentionszeit von 13,2 min. Somit konnte die Vermutung bestätigt werden, dass das gewünschte Produkt der photolytischen Ringöffnung nicht stabil ist. Durch Ermittlung der Peakflächen bei tR 12,6 min und tR 13,6 min, welche zu den Stoffmengen proportional sind, und Auftragung dieser gegen die Bestrahlungsdauer, wurde das Diagramm in Abb. 3.11 erhalten. Auch hier wurde deutlich, dass es sich zunächst um eine direkte Umwandlung des Edukts zum Produkt handelte. Die Kinetik der direkten Umwandlung entspricht der einer Reaktion 1. Ordnung. Mit fortschreitendem Reaktionsverlauf wandelt sich das Primärprodukt zu einer neuen Verbindung um.
Abb. 3.10 RP-HPLC-Diagramme von Peptid 9 nach unterschiedlicher Bestrahlungsdauer mit 366 nm. Die rot unterlegten Peaks stellen das cyclische Peptid 9 dar. Das photolytische Spaltprodukt ist in blau unterlegt und wandelt sich ohne Bestrahlung in eine neue Verbindung um. Diese ist grün unterlegt.
Säule: C-18 Nuclosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min und einem Gradienten von 10-85% MeCN in 20 min verwendet. Beiden Eluenten (Wasser und MeCN) wurden je 0,1% TFA zugesetzt.
Abb. 3.11 Die Kinetik zeigt in rot die Abnahme des Edukts. In schwarz ist die Entstehung des Primärproduktes zu sehen.
Auch andere Arbeitsgruppen haben bei der photolytischen Spaltung dieses Linkers diverse Nebenreaktionen, wie beispielsweise Dimerisierungen und nucleophile Angriffe durch primäre Amine oder Thiole, beobachtet.[39, 40] Oftmals konnten die Nebenprodukte allerdings nicht identifiziert werden.[39, 41] Anhand der erhaltenen HPLC-, UV- und MS-Daten konnte auch in unserem Fall keine weitere Aussage über das entstandene Nebenprodukt gemacht werden.
Um weitere Informationen über das durch Photolyse erhaltene Peptidprodukt zu gewinnen, wurde das cyclische Peptid 10 erneut synthetisiert und mit 1% TFA vom Harz gespalten. Für die anschließende Photolyse wurde das lyophilisierte Peptid 10 in Acetonitril (66,6%), Methanol (16,6%), Wasser (16,3%) und Ameisensäure (0,3%) (v/v) gelöst und 420 Sekunden mit UV-Licht bestrahlt. Die bestrahlte Lösung wurde im Kühlschrank für 24 Stunden verwahrt und anschließend mittels präparativer RP- HPLC aufgereinigt. Zur NMR-spektroskopischen Charakterisierung wurden COSY-,
HSQC-, TOCSY- und ROESY-Experimente durchgeführt. Vergleicht man den erhaltenen Datensatz mit dem Datensatz des cyclischen Peptids, so bemerkt man einige Unterschiede: Die Spur der Aminofunktion der Sollbruchstelle (Verknüpfung zwischen photolabiler Aminosäure und Glutaminsäure) fehlt im TOCSY-Spektrum.
Die Signale der CHCH3-Gruppe am Pll-Aromaten sind weiterhin zu sehen. Der vierte Substituent am Pll-Aromaten, im Edukt die Nitrogruppe, ist jedoch unklar. Im HSQC- Spektrum ist eine deutliche Veränderung an der kx-Position der Pll-Kette zu sehen.
Das freie Amin in der Glutaminseitenkette fehlt. Die Signale der Protonen im Pll- Aromaten verändern sich fast nicht. Eine vollständige Identifizierung der Verbindung war jedoch leider nicht möglich.
Da man für MS-Identifizierungen der Peptidsequenz auf stabile und eindeutige Produkte angewiesen ist, ist diese Sollbruchstelle für diesen Zweck nicht geeignet.
3.2 Methionin als Sollbruchstelle
Bereits in den 1960er Jahren beschrieben Gross und Witkop die Bromcyan- vermittelte selektive Spaltung von Peptidbindungen, an denen die Carbonylgruppe eines Methionins beteiligt ist.[42, 43] Bis heute ist dies die wichtigste nichtenzymatische Spaltung von Proteinen und Polypeptiden in der Biochemie. Inglis und Edman befassten sich mit Studien zu Kinetik und Mechanismus dieser Spaltung.[44] Der heute in Lehrbüchern[45] verbreitete Mechanismus ist in Abb. 3.12 dargestellt.
Die hoch selektive Transformation beginnt mit einer S-Alkylierung des Methioninrests durch Bromcyan-Behandlung unter wässrig sauren Bedingungen. Die Elektronen des Cyan-Kohlenstoffs sind in Richtung des elektronegativeren Bromids verschoben.
Dies führt zu einer positiven Teilladung am Kohlenstoff, welche einen nucleophilen Angriff des Sulfids (Methionin) ermöglicht. Es folgt eine intramolekulare Cyclisierung, bei der Methylthiocyanat 22 als gute Abgangsgruppe eliminiert wird. Nach saurer Hydrolyse des entstandenen Iminolactons gelangt man zum C-terminalen Homoserinlacton (Hsl) 26 und einem freien Amin.
Abb. 3.12 Mechanismus der BrCN-Spaltung, wie er üblicherweise in Lehrbüchern zu finden ist.[45]
Neben der Bromcyanspaltung zur Fragmentierung von Polypeptiden findet man in der Literatur auch zahlreiche Beispiele, in denen Methionin als Linkergruppe in der SPPS eingesetzt wurde.[16, 21, 27, 46-50] Nach der Standard-Fmoc-SPPS wird das Peptid dabei üblicherweise durch Behandlung mit einer Lösung, bestehend aus BrCN in 70% wässriger TFA (70 mg/ml), vom Harz abgespalten.
Abb. 3.13 Cyclisches Peptid mit Methionin als Linker zum Harz und Sollbruchstelle im Peptidzyklus. Durch Behandlung mit BrCN wird das Peptid vom Harz gespalten und der Ring geöffnet. Man erhält ein lineares Peptid in Lösung.
Inspiriert von diesen Arbeiten kam der Gedanke auf, Methionin nicht nur als Linker, sondern zusätzlich als Sollbruchstelle im cyclischen Peptid zu verwenden. Wird ein solches System einer BrCN-Behandlung ausgesetzt, so sollte simultan das Peptid vom Harz gespalten und der peptidische Ring geöffnet werden. Man erhält ein lineares Peptid in Lösung, welches nun einer Sequenzierung unterzogen werden kann.
Um das Potential von Methionin als Sollbruchstelle im Zyklus zu überprüfen, wurde zunächst Peptid 27-33 an SieberAmid-TentaGel-Harz synthetisiert (Abb. 3.14). Im Hinblick auf eine spätere Sequenzierung des Peptids mittels Massenspektrometrie, wurde zwischen dem Peptidzyklus und dem Trägerharz eine kurze Massenspacer- sequenz, bestehend aus -βAla-Pro-Pro-Arg-, synthetisiert. Der Spacer nutzt in zweierlei Hinsicht. Erstens bringt er die zur Sequenzierung notwendigen Peptid- fragmente in einen Massenbereich größer 500 m/z und somit über den Massenbereich der Matrix-Hintergrund-Signale im MALDI-Experiment. Zum Zweiten wird durch die Anwesenheit von Arginin eine positive Ladung im Peptid gesichert, welche für die massenspektrometrische Detektion nötig ist.
Abb. 3.14 Synthese des cyclischen Peptids 33 und anschließende Ringöffnung mit BrCN-Behandlung.
Abb. 3.15 RP-HPLC von Testabspaltungen während der Synthese von 33. Die Peak- Fraktionen wurden aufgesammelt und anschließend massenspektrometrisch untersucht.
Säule: C18 Nucleosil 100-5, ID 4 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte Detektorwellenlänge war 254 nm. Gradient: 10-85% MeCN in 20 min (MeCN und H2O mit 0,1% Ameisensäure).
Die Synthese des linearen Vorläuferpeptids 27 erfolgte unter Standard-Fmoc-SPPS am Peptidsynthesizer. Der Syntheseverlauf wurde mittels Leitfähigkeitsmessung der Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Nach Entschützung des N-Terminus und der Carboxylgruppe der Glutaminsäureseitenkette erfolgte zwischen diesen die Cyclisierung unter Verwendung von PyBOP. Die Reaktionsbedingungen können der Abb. 3.14 entnommen werden. Zur Untersuchung der Sollbruchstelle wurde das harzgebundene Cyclopeptid 31 anschließend über Nacht mit Bromcyan in wässrig saurer Lösung behandelt. Alle Schritte wurden mittels RP-HPLC und nachfolgender Massenspektrometrie analysiert (Abb. 3.15). In den Chromatogrammen der Peptide 28, 30 und 32 wurden je zwei Hauptpeaks beobachtet. Die massenspektrometrische offline-Charakterisierung ergab, dass es sich bei den Peaks mit niedrigerer Retentionszeit (17,921 min, 13,395 min und 13,710 min) jeweils um das entsprechende Peptid handelte, bei dem Methionin oxidiert vorliegt. Aus den Chromatogrammen in Abb. 3.15 wird ebenfalls ersichtlich, dass das cyclische Peptid 32 durch Behandlung mit BrCN zum linearen Peptid 33 umgewandelt werden kann.
Methionin ist somit als Sollbruchstelle in cyclischen Peptiden durchaus geeignet.
Die daran anschließenden massenspektrometrischen Sequenzierungsexperimente sind in Abschnitt 4.1.2 ausführlich beschrieben. Wie dort ausführlich erläutert stellte sich die rein massenspektometrische Sequenzierung als ungeeignet heraus, somit erübrigte sich die Anwendung einer simultanen Ringöffnung und Harzspaltung.
Der partielle Edman-Abbau (PED) zeigte sich dagegen als geeigneter zur Sequenzierung (eine ausführliche Beschreibung hierzu befindet sich in Kapitel 4).
Dies stellt jedoch besondere Anforderungen an den Linker. Ein simultanes Peptidringöffnen und Abspalten des Peptides vom Harz ist bei dieser Methode nicht mehr möglich. Alle Schritte müssen festphasengebunden vonstatten gehen und erst unmittelbar vor der Analytik darf das Peptid vom Harz gespalten werden.
3.2.1 Auswahl eines Linkers orthogonal zur Met-Sollbruchstelle
In den oben beschriebenen Experimenten wurde Methionin als Sollbruchstelle und Linker verwendet. Somit wurde durch die Behandlung mit Bromcyan der Peptidzyklus geöffnet und gleichzeitig das Peptid vom Harz gespalten. Soll die Bromcyan- vermittelte Ringöffnung jedoch ohne simultane Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgen, benötigt man einen Linker, der allen verwendeten Bedingungen standhält.Zur Darstellung des cyclischen Peptids werden folgende Bedingungen verwendet:
Die Standard-Bedingungen der Fmoc-SPPS (20% Piperidin in DMF bzw. NMP), Entfernung der Allyl- bzw. Alloc-Schutzgruppe (Pd(0) und Nucleophil) und Abspaltung der säurelabilen Boc-, Trt-, t-Bu- und Pbf-Schutzgruppen (95%TFA aq.).
Zum Öffnen des Peptidzyklus wird eine Bromcyan-Spaltung durchgeführt (BrCN in 70% TFA aq.). Außerdem sollen die festphasengebundenen cyclischen Peptide einem Screening unterzogen werden (Abschnitt 5.3), welches im wässrigen Milieu zwischen pH=1-9 verläuft; auch hierbei darf der Linker nicht reagieren. Da sich herausstellte, dass der partielle Edman-Abbau die geeignetste Methode zur Sequenzierung ist, muss der Linker schließlich auch zu diesen Bedingungen kompatibel sein.
Peptid-Synthese vordemScreening
Abb. 3.16 Ein geeigneter Linker muss zu allen hier aufgeführten Bedingungen kompatibel sein.
3.2.1.1 Der Arylhydrazin-Linker
Die meisten in der Literatur beschriebenen Linker zeichnen sich dadurch aus, dass sie leicht spaltbar sind. Der von uns gesuchte Linker muss jedoch ein äußerst breites Spektrum an chemischen Reaktionen (Bedingungen) überstehen. Eine oftmals erweiterte Stabilität besitzen sogenannte safety-catch Linker. Ihre Besonderheit besteht darin, dass man sie vor der Abspaltung vom Harz zunächst aktivieren muss.
Das heißt, sie sind zunächst in ihrer Ausgangsform inert und werden erst während des vorletzten Syntheseschritts unter speziellen Bedingungen chemisch aktiviert.
Diese Aktivierung erlaubt anschließend eine Freisetzung des gewünschten Produkts unter milden Bedingungen. Ein auf diesem Prinzip beruhender Linker ist der Arylhydrazin-Linker. Die Hydrazid-Gruppe wurde bereits vor vierzig Jahren als Carboxyl-Schutzgruppe in der Peptidsynthese eingesetzt[51, 52] und findet heute als Linker in der SPPS Verwendung.[53] Der Arylhydrazin-Linker ist inert zu den Abspaltbedingungen der Boc-, Fmoc- und Alloc-Schutzgruppe. Wie in Abb. 3.17 abgebildet, wird das Hydrazid erst durch Oxidation, üblicherweise mit NBS oder Cu(II)-Acetat, in die hoch reaktive Azoverbindung umgewandelt, welche mit Nucleophilen unter Spaltung des Linkers abreagiert. Auf diesem Weg können je nach verwendetem Nucleophil C-terminale Peptidsäuren,[54] -ester,[54, 55] -amide,[54, 56]
-thioester,[56] -p-nitrophenole,[57] -lipide[58] und cyclische Peptide[59] erhalten werden.
Abb. 3.17 Abspaltung des Arylhydrazin-Linkers. Erst nach oxidativer Aktivierung kann mit einem Nucleophil das Peptid vom Harz gespalten werden.
Um die Eignung des Arylhydrazin-Linkers für unsere Zwecke zu untersuchen, wurde zunächst nach optimalen Abspaltbedingungen gesucht. Da die Abspaltung der Peptidleiter (durch partiellen Edman-Abbau an der festen Phase erzeugt) als letzter Schritt vor der massenspektrometrischen Charakterisierung erfolgen soll, wurde versucht, über das Nucleophil beim Abspalten ein Bromisotopenlabel einzuführen.
Durch das somit im Molekül enthaltene charakteristische Isotopenverteilungmuster, wird die Auswertung der Massenspektren erleichtert. Zunächst wurde das kommerziell erhältliche Fmoc-geschützte Arylhydrazin-Harz 34 mit Fmoc-βAla-OH beladen. Zum Drosseln der Beladungsdichte wurde eine Mischung aus Fmoc- und Boc-βAla-OH (1:1) verwendet. Für die zu untersuchende Abspaltung wurde der Linker durch Behandlung mit einer Lösung aus NBS, Pyridin und DCM aktiviert und anschließend mit verschiedenen Nucleophilen umgesetzt (Abb. 3.18).
Abb. 3.18 Das kommerziell erhältliche NovaSyn-TG-Harz 34 wurde mit Aminosäure beladen. Zur Optimierung der Abspalt-Bedingungen wurde das Harz nach oxidativer Aktivierung mit folgenden Nucleophilen behandelt: Methanol (35), 2- Brombenzylalkohol (36), 4-Brombenzylalkohol (37) und 4-Bromanilin (38).
Eine RP-HPLC Analyse der NBS-Aktivierungslösung ergab, dass das Harz während und nach der Aktivierung äußerst hydrolyseempfindlich ist. Bei Verwendung von nicht ausreichend wasserfreien Reagenzien wurde die Aminosäure bereits vor Zugabe des Nucleophils als freie Säure vom Harz abgespalten. Unter Verwendung der Alkohole 35-37 als Nucleophile zeigte die Analyse der Abspaltlösungen neben
Aminosäureestern überwiegend die hydrolysierten Aminosäuren. Gründe für die Entstehung dieser Hydrolyseprodukte könnten wiederum nicht wasserfreie Reaktionsbedingungen oder wässrig-saure HPLC-Eluenten sein. Bei der Verwendung von 36 beziehungsweise 37 als Nucleophil ist auch eine erhöhte Labilität der Benzylposition während der Ionisierung im Massenspektrometer denkbar. Verwendet man ein Amin als Nucleophil, greifen die beiden zuletzt genannten Punkte nicht, da man dann ein stabiles Amid entsteht. Wurde 4-Brom- anilin 38 als Nucleophil eingesetzt, zeigte die RP-HPLC Analyse nur wenig Aminosäure (Hydrolyse) und viel Aminosäureamid, weshalb in den darauffolgenden Experimenten 4-Bromanilin als Nucleophil zum Abspalten verwendet wurde. Um die Stabilität des Linkers in der geplanten Synthese zu testen, wurde das Peptid 39 am Synthesizer (20 µmol-Ansatz mit Leitfähigkeitsmonitoring) unter Standard-Fmoc-Be- dingungen synthetisiert. Der weitere, nicht automatisierte Syntheseweg ist in Abb.
3.19 aufgeführt.
Abb. 3.19 Synthese des festphasengebunden Peptids 43.
Zunächst wurde die Allyl-Schutzgruppe, sowie die Fmoc-Schutzgruppe entfernt und nach Aktivierung der Carboxylgruppe mit PyBOP cyclisiert. Vom nun cyclischen Peptid 41 wurde die säurelabile Pbf-Schutzgruppe entfernt und anschließend wurde durch Behandlung mit BrCN-Lösung der Zyklus geöffnet. Zur Überprüfung der
Stabilität des Linkers, wurde die saure Pbf-Abspaltlösung und die anschließenden Waschlösungen, sowie die BrCN-Spaltlösung und alle folgenden Waschlösungen mittels MALDI-TOF-MS untersucht. In der Pbf-Abspaltlösung wurde kein Peptid gefunden; der Linker scheint unter diesen Umständen stabil zu sein. In der BrCN- Lösung wurde jedoch deutlich nachweisbar hydrolysiertes Peptid gefunden. Somit ist der Arylhydrazin-Linker nicht stabil unter den verwendeten Bedingungen und eignet sich folglich nicht.
3.2.1.2 Glykolamid- und Benzamidester (HMBA) als Linker
Glykolamid- und Benzamidester-Linker werden in der Literatur in zweifacher Hinsicht als stabil beschrieben. Einerseits halten sie den basischen Bedingungen der Standard-Fmoc-SPPS stand. Andererseits gelten sie auch als stabil gegenüber den säureinduzierten Seitenkettenschutzgruppenabspaltbedingungen. Die Abspaltung erfolgt unter basischen, nucleophilen Bedingungen. Auf diesem Weg lässt sich eine Vielzahl C-terminal modifizierter Peptide darstellen (Tabelle 1).
Tabelle 1 Durch Behandlung mit verschiedenen nucleophilen Reagenzien kann eine Vielzahl unterschiedlicher C-terminal modifizierter Peptide erhalten werden.[60-
63]
Linker Reagenzien -R Ausbeute Lit.
46 iPrOH/H2O/NaOH -OH 93-97% [61]
46 und 45 Puffer pH 7-8,3 -OH 64-79% [63]
46 und 45 NH3/THF -NH2 90% [62]
46 und 45 NH3/MeOH -NH2 95% [62]
46 und 45 NH3/iPrOH -NH2 58% [62]
45 H2NEt/NMP -NHEt 16% [60]
45 H2NBu/TEA/THF -NHBu 13% [60]
45 MeOH/DIPEA/DMF -OMe 32% [60]
45 PrOH/TEA/THF -OPr 25% [60]
45 H2NNH2/DMF -NHNH2 23% [60]
Beide Linker wurden auf ihre Stabilität in unserem System überprüft (Abb. 3.16). Zur Bestimmung der Stabilität der Glykolamidestergruppe als Linker wurde ausgehend von TentaGel-S-NH2-Harz nach Baleux[61] das Bromacetamid-Harz 47 erhalten, welches anschließend mit der C-terminalen Aminosäure beladen wurde.[64] Zum Cappen von etwaigen freien Aminen wurde das Harz abschließend mit einer 10%- igen Essigsäureanhydridlösung behandelt. Nach dem Trocknen wurde die Beladungsdichte bestimmt (0,332 mmol/g).
Abb. 3.20 Darstellung des Glykolamid-Harzes 48 zur weiteren Verwendung in der SPPS.
Die Beladung des kommerziell erhältlichen HMBA-Harzes (NovaSyn TG) 49 mit der ersten Aminosäure erfolgte mit der MSNT/MeIm-Methode[32] (Abb. 3.21).
Anschließend wurde mit Benzoylchlorid gecappt. Die ermittelte Beladungsdichte betrug 0,18 mmol/g.
Abb. 3.21 Beladung des kommerziell erhältlichen HMBA-Harzes 49 mit der ersten Amniosäure.
An beiden nun vorliegenden mit Fmoc-Alanin vorbeladenen Harzen (48 und 50) wurde mittels automatisierter Fmoc-SPPS im 20 µmol-Ansatz die kurze Peptidsequenz 51 bzw. 52 synthetisiert. Bray et al.[63] weisen darauf hin, dass während der Synthese das Peptid zum Teil vom Harz gespalten wird. In den beiden von mir durchgeführten Synthesen wurde im UV-Monitoring kein Einbruch beobachtet; somit scheint der Linker während der Peptidsynthese stabil zu sein. Um
