Glykolamid- und Benzamidester (HMBA) als Linker

Glykolamid- und Benzamidester-Linker werden in der Literatur in zweifacher Hinsicht als stabil beschrieben. Einerseits halten sie den basischen Bedingungen der Standard-Fmoc-SPPS stand. Andererseits gelten sie auch als stabil gegenüber den säureinduzierten Seitenkettenschutzgruppenabspaltbedingungen. Die Abspaltung erfolgt unter basischen, nucleophilen Bedingungen. Auf diesem Weg lässt sich eine Vielzahl C-terminal modifizierter Peptide darstellen (Tabelle 1).

Tabelle 1 Durch Behandlung mit verschiedenen nucleophilen Reagenzien kann eine Vielzahl unterschiedlicher C-terminal modifizierter Peptide erhalten werden.

[60-63]

Linker Reagenzien -R Ausbeute Lit.

46 ⁱPrOH/H2O/NaOH -OH 93-97% ^[61]

46 und 45 Puffer pH 7-8,3 -OH 64-79% ^[63]

46 und 45 NH3/THF -NH2 90% ^[62]

46 und 45 NH3/MeOH -NH2 95% ^[62]

46 und 45 NH3/ⁱPrOH -NH2 58% ^[62]

45 H2NEt/NMP -NHEt 16% ^[60]

45 H2NBu/TEA/THF -NHBu 13% ^[60]

45 MeOH/DIPEA/DMF -OMe 32% ^[60]

45 PrOH/TEA/THF -OPr 25% ^[60]

45 H2NNH2/DMF -NHNH2 23% ^[60]

Beide Linker wurden auf ihre Stabilität in unserem System überprüft (Abb. 3.16). Zur Bestimmung der Stabilität der Glykolamidestergruppe als Linker wurde ausgehend von TentaGel-S-NH2-Harz nach Baleux^[61] das Bromacetamid-Harz 47 erhalten, welches anschließend mit der C-terminalen Aminosäure beladen wurde.^[64] Zum Cappen von etwaigen freien Aminen wurde das Harz abschließend mit einer 10%-igen Essigsäureanhydridlösung behandelt. Nach dem Trocknen wurde die Beladungsdichte bestimmt (0,332 mmol/g).

Abb. 3.20 Darstellung des Glykolamid-Harzes 48 zur weiteren Verwendung in der SPPS.

Die Beladung des kommerziell erhältlichen HMBA-Harzes (NovaSyn TG) 49 mit der ersten Aminosäure erfolgte mit der MSNT/MeIm-Methode^[32] (Abb. 3.21).

Anschließend wurde mit Benzoylchlorid gecappt. Die ermittelte Beladungsdichte betrug 0,18 mmol/g.

Abb. 3.21 Beladung des kommerziell erhältlichen HMBA-Harzes 49 mit der ersten Amniosäure.

An beiden nun vorliegenden mit Fmoc-Alanin vorbeladenen Harzen (48 und 50) wurde mittels automatisierter Fmoc-SPPS im 20 µmol-Ansatz die kurze Peptidsequenz 51 bzw. 52 synthetisiert. Bray et al.^[63] weisen darauf hin, dass während der Synthese das Peptid zum Teil vom Harz gespalten wird. In den beiden von mir durchgeführten Synthesen wurde im UV-Monitoring kein Einbruch beobachtet; somit scheint der Linker während der Peptidsynthese stabil zu sein. Um

Probleme von ungewollter Fmoc-Abspaltung unter basischen Linker-Spalt-bedingungen zu umgehen, erfolgte eine manuelle Abspaltung der N-terminal verbliebenen Fmoc-Schutzgruppe (20% Piperidin). Anschließend wurde der N-Terminus acetyliert, um das freie Amin zu cappen. Zum Abspalten des vollständig geschützten Peptids wurde ein Teil des Harzes über Nacht mit einer Propylaminlösung behandelt, gewaschen (DMF, MeOH, Wasser) und die vereinigten Lösungen eingeengt. Nach Lyophilisieren wurde das Peptid mittels RP-HPLC und anschließender ESI-Massenspektrometrie charakterisiert. Für darauffolgende Stabilitätstests und Quantifizierungen wurde eine definierte Menge Harz eingewogen, die säurelabilen Schutzgruppen abgespalten, das Harz den zu untersuchenden Reaktionsbedingungen ausgesetzt und das Peptid anschließend abgespalten. Durch Integration des Produktpeaks im RP-HPLC-Chromatogramm (bei tR=15,4 min) konnte das Peptid quantifiziert werden.

Abb. 3.22 Eichgerade der Glycolamidester-Datenreihe. Für die Datenreihe in magenta wurden 2,4 mg 52 eingewogen. Die blaue Datenreihe entstammt einer Einwaage von 1,7 mg 52.

Zur Erstellung der Eichgeraden wurden pro Harz zwei definierte Mengen Peptidylharz eingewogen, abgespalten und anschließend pro Einwaage eine Peptidlösung erstellt. Daraus wurden HPLC-Läufe mit 25, 30 und 50 µl Injektionsvolumen durchgeführt. Dabei wurde angenommen, dass beide Linker während der säureinduzierten Spaltung der Seitenkettenschutzgruppen stabil sind und dass die abschließende Spaltung des Peptids vom Harz quantitativ verläuft.

Beim näheren Betrachten der Eichgeraden (Abb. 3.22) fällt auf, dass die ermittelten Werte, die aus derselben Lösung, aber unterschiedlichen Injektionsvolumina entstanden sind, sehr gut auf einer Gerade liegen. Zwischen den verschiedenen Lösungen gibt es jedoch deutliche Unterschiede, vor allem im Fall der beiden Glycolamidester-Harz Datenreihen. Somit liegt die Vermutung nahe, dass der Fehler nicht bei der HPLC-Anlage (Präzision der Probeninjektion, Ermittlung der Peakfläche), sondern bereits zuvor gesucht werden muss. Hier gibt es viele mögliche Fehlerquellen, wie das ungenaue Einwiegen (verursacht zum Beispiel durch fehlende Wägepräzision und/oder statische Aufladung), eine nicht hundertprozentig reproduzierbare Abspaltreaktion und die anschließende Probenpräparation (Löslichkeit, Pipettieren). Da das Ziel eine Abschätzung der Linkerstabilität bei verschiedenen Reaktionsbedingungen war, liegen die Messwerte dennoch in einem verwertbaren Rahmen. Aus den erhaltenen Werten kann abgelesen werden, ob die Behandlung mit den getesteten Bedingungen problematisch ist. In Folge dessen kann abgeschätzt werden, ob mit einem Verlust des Peptids von der festen Phase zu rechnen ist.

Der Blick in Tabelle 2 zeigt, dass beide Linker nicht die gewünschte Stabilität besitzen. Der größte Verlust des Peptids vom Harz wurde in beiden Fällen bei der Behandlung mit TBS-Puffer beobachtet. Während eines typsichen Screenings-prozesses findet unter diesen Bedingungen üblicherweise eine durch AP-katalysierte enzymatische Anfärbereaktion zum Visualisieren der Rezeptor-Ligand-Bindungsreaktion statt. Um dieses Problem zu umgehen, könnte man statt eines AP-Konjugats ein Peroxidase-Konjugat verwenden, wodurch die Änderung des pH-Wertes ins Alkalische überflüssig werden würde. Neben der Instabilität bei TBS-Puffer, weisen beide Linker eine Labilität gegenüber TFA auf. Im Einzelnen

Tabelle 2 Quantifizierung des Peptids 53 nach Behandlung mit den aufgelisteten Reaktionsbedingungen, zur Ermittlung der Stabilität der Linker.

Zweck

betrachtet scheint dies mit einer Stabilität von zwei Dritteln noch vertretbar. Da TFA aber bei der Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen, dem partiellen Edman-Abbau und der Bromcyan-Spaltung verwendet wird, fällt die Labilität in der Summe zu stark ins Gewicht. Somit werden auch diese beiden Linker als nicht geeignet betrachtet.

Wie erwartet zeigte sich die Suche nach einem geeigneten Linker als schwierig.

Sowohl der Arylhydrazin-Linker, als auch der Glykolamid- beziehungsweise der Benzamidester-Linker erwiesen sich als nicht hinreichend stabil unter den von uns verwendeten Bedingungen. Es konnte kein Linker gefunden werden, der die Umsetzung der Methionin-Sollbruchstelle und den anschließenden partiellen Edman-Abbau an der festen Phase ermöglicht.