Synthese der fluoreszenzmarkierten Peptide

8.3.10.1 Synthese des fluoreszenzmarkierten Peptids SRBS-Y241

Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Ala-OH beladen (Beladungsdichte 0,2 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Synthese des Peptids am Synthesizer unter Verwendung des 20µM spezial.kem chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen (Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid (Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc) wurde die automatisierte SPPS beendet.

Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Met-Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH und Fmoc-Tyr(tBu)-OH.

Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.

Fmoc-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr-Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH (110→) Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (15-100% B in 30 min, 0,9 ml/min) t_R = 12,9 min ESI-MS: 2068,5 m/z [M+H]¹⁺, 1035,0 m/z [M+2H]²⁺, 690,5 m/z [M+3H]³⁺, 518,0 m/z [M+4H]⁴⁺

Berechnet: C₉₃H₁₃₆N₂₅O₂₅S₂⁺(avarage 2068,35 m/z)

Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde nach AAV 9 das Fluoreszenzlabel eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit Reagenz K (nach AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.

SRBS-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr-Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH SRBS-Y241 Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): (27-53% B in 20 min, 9,8 ml/min) tR = 11,4 min ESI-MS: 2387,7 m/z

Ausbeute: 34% (16 mg)

Berechnet: C₁₀₅H₁₅₄N₂₇O₂₉S₄⁺(exacte 2385,0283 m/z, avarage 2386,7692 m/z)

8.3.10.2 Synthese des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids SRBS-pY241

Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Ala-OH beladen (Beladungsdichte 0,2 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Elongation der ersten sieben Aminosäuren am Synthesizer unter Verwendung des 20µM spezial.kem chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen (Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid (Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc) wurde die automatisierte SPPS beendet. Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Asp(OtBu)-OH, Arg(Pbf)-OH, Cys(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Met-OH.

Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.

Fmoc -Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH (111→) MALDI-TOF-MS: 1082,4 m/z

Berechnet: C₄₈H₆₈N₁₃O₁₂S₂⁺(exacte 1082,4546 m/z)

Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde Fmoc-Tyr[PO(OBzl)OH]-OH (5 eq.) unter Aktivierung mit 5 eq. PyBOP, 5 eq. HOBt und 10 eq. DIPEA. angeknüpft. Es wurde wie in AAV 3 beschrieben vorgegangen. Auch die Anknüpfung der nächsten Aminosäure (Fmoc-Ile-OH) erfolgte wie eben beschrieben manuell.

Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte wiederum am Peptidsynthesizer.

Hierzu wurde wie bereits zu Beginn der Synthese beschreiben vorgegangen.

Folgende Aminosäurebausteine kamen zum Einsatz: Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(O^tBu)-OH, His(Trt)-OH, Leu-OH, Lys(Boc) und Fmoc-Thr(tBu)-OH.

Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde nach AAV 9 das Fluoreszenzlabel eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit Reagenz K (nach AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.

SRBS-Leu-Lys-His-Asp-Thr-Asn-Ile-Tyr[PO(OH)2]-Cys-Arg-His-Asp-His-Lys-Ala-OH SRBS-pY241

Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): 30-45% B in 20 min, 9,8 ml/min) t_R = 11,1 min ESI-MS: 2464,5 m/z [M+H]¹⁺, 1233,3 m/z [M+2H]²⁺ und 822,5 m/z [M+3H]³⁺

Ausbeute: 13% (6,3 mg)

Berechnet: C₁₀₅H₁₅₅N₂₇O₃₂PS₄⁺(exacte 2464,9946m/z, avarage 2466,7491 m/z)

8.3.10.3 Synthese des fluoreszenzmarkierten Peptids SRBS-Y230

Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Asp(O^tBu)-OH beladen (Beladungsdichte 0,7 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Elongation der ersten neun Aminosäuren am Synthesizer unter Verwendung des 20µM spezial.kem chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen (Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid (Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc) wurde die vorläufige automatisierte SPPS beendet. Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Fmoc-Glu(O^tBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Tyr(^tBu).

Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.

Fmoc-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (119→) MALDI-TOF-MS: (roh)

[M+H]⁺_gemessen Intensität Beschreibung [M+H]⁺_berechnet

1381,5 m/z 100% Fmoc-Ile…-OH 1381,6674 m/z (C₆₈H₉₃N₁₂O₁₉⁺) 1088,3 m/z 13% Ac-Tyr...-OH 1088,5259 m/z (C49H74N11O17+) 925,2 m/z 21% Ac-Glu²…-OH 925,4625 m/z (C₄₀H₆₅N₁₀O₁₅⁺) 796,2 m/z 9% Ac-Glu¹..-OH 796,4199 m/z (C₃₅H₅₈N₉O₁₂⁺)

Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde Fmoc-Ala-Ser(Ψ^MeMePro)-OH (5 eq.) unter Aktivierung mit 5 eq. PyBOP, 5 eq. HOBt und 10 eq. DIPEA angeknüpft. Es wurde wie in AAV 3 beschrieben vorgegangen.

Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte wiederum am Peptidsynthesizer.

Hierzu wurde wie bereits zu Beginn der Synthese beschrieben vorgegangen.

Folgende Aminosäurebausteine kamen zum Einsatz: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Pro-OH und Fmoc-Thr(^tBu)-OH.

Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.

Fmoc-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (121→) Analytische RP-HPLC (Eurosphere Säule): (10-100% B in 20 min, 0,9 ml/min) tR = 17,2 min MALDI-TOF-MS: 1966,2 m/z [M+H]⁺

Berechnet: C92H134N21O27+(exacte 1964,9753 m/z, avarage 1966,1723 m/z)

Der automatisierten SPPS folgte eine manuelle Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe nach AAV 10. Daraufhin wurde nach AAV 9 das Fluoreszenzlabel eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit Reagenz K (nach AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.

SRBS-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH SRBS-Y230 Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): 30-75% B in 30 min, 9,8 ml/min) t_R = 14,9 min MALDI-TOF-MS: 2284,4 m/z [M+H]¹⁺

Ausbeute: 6% (2,5 mg)

Berechnet: C₁₀₄H₁₅₂N₂₃O₃₁S₂⁺(exacte 2283,0461 m/z, avarage 2284,5846 m/z)

8.3.10.4 Synthese des fluoreszenzmarkierten Phosphopeptids SRBS-pY230

Wie in AAV 2 beschrieben wurde das Wang-Harz mit Fmoc-Asp(O^tBu)-OH beladen (Beladungsdichte 0,7 mmol/g). Anschließend erfolgte nach AAV 7 die Elongation der ersten sieben Aminosäuren am Synthesizer unter Verwendung des 20µM 15 min länger UV.kem chemistry files. Im ersten Modul wurde das Harz gewaschen (Modulfolge: eGD). Die Modulfolge der darauffolgenden Zyklen lautete BbDAFiiiCid (Single Couple, Cap./5eq.). Mit einem abschließenden final wash (Modulfolge: Dc) wurde die vorläufige automatisierte SPPS beendet. Folgende Aminosäurebausteine wurden verwendet: Fmoc-Glu(O^tBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH und Fmoc-Lys(Boc)-OH.

Zur Überprüfung der Synthese wurden Testabspaltungen durchgeführt. Hierzu wurden kleine Mengen des Peptids entnommen und nach AAV 19 vorgegangen.

Fmoc-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH (122→) MALDI-TOF-MS: 1105,3 [M+H]⁺

Berechnet: C₅₃H₇₃N₁₀O₁₆⁺(exacte 1105,5201 m/z, avarage 1106,2036 m/z)

Die weitere Verlängerung der Peptidkette erfolgte manuell. Die Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe erfolgte nach AAV 10, wobei deren Erfolg stets mittels UV-Quantifizierung überprüft wurde. Die Anknüpfung der Aminosäure-bausteine wurde wie in AAV 3 beschrieben durchgeführt. Zur Aktivierung wurde PyBOP/ HOBt verwendet. Die letzten beiden Aminosäuren (Arg und Pro) wurden mit PyAOP/ HOAt aktiviert. Nach dem Aufbau der Peptidkette wurde nach AAV 9 das Fluoreszenzlabel eingeführt und schließlich wurde das Peptid durch Behandlung mit Reagenz K (nach AAV 20) vom Harz gespalten und aufgereinigt.

SRBS-Pro-Arg-Thr-Ala-Ala-Ser-Ile-Tyr[PO(OH)₂]-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-His-Asp-OH SRBS-pY230

Präparative RP-HPLC (Eurosphere Säule): 35-60% B in 20 min, 9,8 ml/min) t_R = 10,9 min ESI-MS: 2364,4 m/z [M+H]¹⁺

Ausbeute: 14% (6,4 mg)

Berechnet: C₁₀₄H₁₅₂N₂₃O₃₄PS₂⁺(exacte 2363,0124 m/z, avarage 2364,5645 m/z)

8.4 Modell in Lösung zur Aufklärung der Nebenreaktion im

Im Dokument Neue Methoden zur Sequenzierung festphasengebunder Cyclopeptide (Seite 164-170)