Quantifizierung von Peptidbeladung und Funktionalisierungsgrad

Für die quantitativen Untersuchungen wurden PEG-SCPs [PEG]-Mal mit einem niedrigen Funktionalisierungsgrad FD [Mal] = 36 ± 5 μmol∙g⁻¹ verwendet. Als Ligationsmedium diente ein entgaster 0.1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) mit 2 M Guanidinhydrochlorid (pH 7.0) [Gu∙HCl]. Das Denaturierungsmittel Gu∙HCl^[362] wurde hinzugefügt, um die Löslichkeit von PEP^RhB zu verbessern und unspezifische Wechselwirkungen sowohl zwischen den Peptid-sequenzen als auch mit den Mikropartikeln zu minimieren. Die Umsetzung von [PEG]-Mal mit verschiedenen Mengen PEP^RhB zwischen 0.50 Äq. und 1.50 Äq. erfolgte unter Verwendung eines fünffachen Überschusses TCEP bezogen auf die Konzentration an eingesetztem bzw. theore-tisch berechnetem Cystein-Peptid (vgl. Tabelle 3.8). Die realen Äquivalente PEP^RhB wurden an Hand konzentrationskorrigierter Stammlösungen direkt zu Beginn der Experimente ermittelt.

Zur Bestimmung dieser sowie der Peptidanbindung zu festgelegten Zeitpunkten wurden nach der Sedimentation der Mikropartikel entsprechende Aliquote aus dem Überstand entnommen und mittels RP-UHPLC vermessen. Das abnehmende UV-Vis-Signal des Cystein-Peptides PEP^RhB ermöglichte eine indirekte Quantifizierung bedingt durch den linearen Zusammenhang zwischen Signalfläche und Konzentration. Durch eine geeignete Kalibrierungsreihe für PEP^RhB in Gegenwart von TCEP konnte auf den Verbrauch des Cystein-Peptides geschlossen und die relativen Peptidbeladungen FD [PEP^RhB] [%] der gebildeten [PEG]-PEP^RhB sowie die finalen Funktionalisierungsgrade FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] ermittelt werden.

Tabelle 3.8. Reaktionsansätze zur Immobilisierung verschiedener Äquivalente des Cystein-Peptides PEP^RhB an Maleinimid-funktionalisierte PEG-SCPs [PEG]-Mal mit einem Funktionalisierungsgrad FD [Mal] = 36 ± 5 μmol∙g⁻¹ in Gegenwart von TCEP in fünffachem Überschuss – mit Ausnahme für die Verwendung von 5.00 Äq. PEP^RhB – bezogen auf die Konzentration an PEP^RhB. Die durch analytische RP-UHPLC-Messungen ermittelten Umsatzraten von PEP^RhB in Abhängigkeit von der Zeit wurden als relative Peptidbeladungen FD [PEP^RhB] [%] sowie als final erzielte Funktionalisierungsgrade FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] für die gebildeten [PEG]-PEP^RhB bestimmt.

cSTART [PEP^RhB] [μM] TCEP FD [PEP^RhB] [%] FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹]

a Die angegebenen Werte schließen die Waschschritte aus Protokoll A (vgl. Tabelle E10 Seite 171) zur Abtrennung nicht-kovalent gebundener Peptidspezies nach der Immobilisierung ein. ^b Der theoretische FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] wurde entsprechend der gemessenen Ausgangskonzentration cSTART [PEP^RhB] [μM] berechnet. Gradient RP-UHPLC:

10 – 70 % Acetonitril in H2O (0.1 % HCOOH, v/v/v), 4 min, 210 nm.

Die analytischen RP-UHPLC-Messungen ergaben eine Abhängigkeit der erzielten relativen Peptidbeladungen FD [PEP^RhB] [%] sowohl von den eingesetzten Äquivalenten PEP^RhB als auch von der Ligationsdauer. Auch noch über einem Zeitraum von 4 Stunden hinaus konnte für die drei Reaktionsansätze eine signifikante Erhöhung des FD [PEP^RhB] [%] verzeichnet werden. Für die finale Umsatzbestimmung nach 24 Stunden wurden nicht-kovalent gebundene Peptid-spezies durch mehrfaches Waschen entfernt und der FD [PEP^RhB] [%] entsprechend der nicht umgesetzten Mengen PEP^RhB korrigiert. Letztendlich zeigte sich eine deutliche Abweichung zwischen den theoretischen und erhaltenen Funktionalisierungsgraden FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] insbesondere für die unterschüssigen und äquimolaren Konzentrationen von 0.50 Äq. bzw.

1.00 Äq. PEP^RhB. Lediglich unter Verwendung von 1.50 Äq. des Cystein-Peptides wurde ein moderater Funktionalisierungsgrad FD [PEP^RhB] = 14 μmol∙g⁻¹ für [PEG]-PEP^RhB erzielt. Hierbei konnten bis zu 38 % der Maleinimid-Funktionen der PEG-SCPs mit PEP^RhB umgesetzt werden.

Daher wurde zusätzlich zu der beschriebenen Experimentierreihe eine weitere Ligations-reaktion mit 5.00 Äq. PEP^RhB ohne die vorherige Zugabe von TCEP angesetzt und die Immobili-sierungseffizienz ermittelt. Zum einen sollte dadurch verhindert werden, dass das bisher präventiv verwendete Reduktionsmittel an die partikelgebundenen Maleinimide addieren kann und möglicherweise doch zu einem Funktionsverlust führt. Zum anderen sollte durch den fünffachen Überschuss an Cystein-Peptid die maximal mögliche Peptidbeladung bestimmt werden. So wurde für den Reaktionsansatz nach einem Zeitraum von 24 Stunden eine relative Peptidbeladung von 66 % und ein Funktionalisierungsgrad FD [PEP^RhB] = 24 μmol∙g⁻¹ final quantifiziert. Im Vergleich zu der Ligation mit 1.50 Äq. PEP^RhB konnte die Anzahl an nicht umgesetzten Maleinimiden der Hydrogelpartikel [PEG]-Mal erfolgreich um etwa 28 % verrin-gert werden. Nun galt es zu klären, inwiefern der hier ermittelte FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] tatsäch-lich der oberen Grenze zur Immobilisierung des Cystein-Peptides entspricht.

Ein weiterer Faktor, den es bei Maleinimid-basierten Ligationen zu berücksichtigten gilt, ist die Anfälligkeit der heterocyclischen Funktionalität gegenüber hydrolytischen Ringöffnungs-reaktionen.^[363] Insbesondere unter wässrigen Bedingungen sind Maleinimide nur begrenzt hydrolysestabil^[364] und bilden mit der Zeit die entsprechend linearen Maleinsäure-Derivate, welche nicht mehr von freien Thiolen adressiert werden können. Diskussionen mit den Kooperationspartnern Prof. Dr. STEPHAN SCHMIDT und Prof. Dr. LAURA HARTMANN ergaben, dass die Hydrolyseempfindlichkeit der partikelgebundenen Maleinimide auch in dem zur Lagerung der [PEG]-Mal dienenden Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid (DMF) nicht zu unterschätzen ist. Da die für die bisherigen Ligationsexperimente verwendeten [PEG]-Mal erst Tage nach der Partikelsynthese mit Cystein-Peptiden umgesetzt wurden, konnte ein Funktions-verlust durch Ringöffnungsreaktionen nicht ausgeschlossen werden. Somit besteht die Möglich-keit, dass die maximale Peptidbeladung noch nicht erreicht worden war. An die Resultate und gewonnenen Erkenntnisse anknüpfend wurde eine weitere Serie von Immobilisierungansätzen mit frisch präparierten [PEG]-Mal durchgeführt. Um den Zeitraum zwischen Maleinimid-Funktionalisierung und Peptid-Ligation auf ein Minimum zu reduzieren, erfolgte die relativ zeitaufwändige Bestimmung von FD [Mal] mittels TBO-Titration[349, 350] erst nachdem die Ligationsreaktionen angesetzt wurden. Der zur Berechnung der Peptidkonzentrationen erfor-derliche FD [Mal] wurde an Hand laborbekannter Umsetzungsraten carboxylfunktionalisierter

PEG-SCPs – hier FD [COOH] = 58 ± 1 μmol∙g⁻¹ – mit etwa 80 % auf ungefähr 46 μmol∙g⁻¹ abge-schätzt. Der reale Funktionalisierungsgrad der [PEG]-Mal fiel mit FD [Mal] = 35 ± 3 μmol∙g⁻¹ etwas geringer aus als erwartet. Folglich wurde mit leicht höheren Äquivalenten des Cystein-Peptides PEP^RhB gearbeitet.

Wie bereits in Kapitel 3.3.3.1 (vgl. Seite 87) beschrieben, kann die Peptidbeladung bzw. der Peptid-Funktionalisierungsgrad über eine Konkurrenzreaktion von Cystein-Peptiden mit einer weiteren Thiol-Spezies gesteuert werden. Zur Prüfung diese Strategie wurden die [PEG]-Mal mit verschiedenen Verhältnissen des Cystein-Peptides PEP^RhB und dem niedermolekularen Thiol 2ME im Überschuss behandelt. Gleichzeitig wurde auf den Zusatz von TCEP als Reduk-tionsmittel verzichtet. In Tabelle 3.9 sind die relativen Peptidbeladungen FD [PEP^RhB] [%] sowie die final erzielten Funktionalisierungsgrade FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] unter Verwendung von 10 %, 50 % und 100 % PEP^RhB bezogen auf eine Gesamtmenge von theoretisch eingesetzten 5.00 Äq. an Thiol-Spezies nach 24 Stunden angegeben.

Tabelle 3.9. Reaktionsansätze zur Immobilisierung verschiedener Verhältnisse des Cystein-Peptides PEP^RhB und der Thiol-Spezies 2ME im Überschuss an Maleinimid-funktionalisierte PEG-SCPs [PEG]-Mal mit einem Funktionali-sierungsgrad FD [Mal] = 35 ± 3 μmol∙g⁻¹. Durch analytische RP-UHPLC-Messungen wurden die relativen Peptid-beladungen FD [PEP^RhB] [%] sowie die final erzielten Funktionalisierungsgrade FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] der gebildeten [PEG]-PEP^RhB bestimmt.

abgeschätzte Äq. c_START [PEP^RhB] [μM] FD [PEP^RhB] [%] FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] Bezeichnung PEP^RhB/2ME berechnet gemessen 24 h^a theoretisch^b erhalten

[PEG]-PEP^RhB [10 %] 0.50/4.50 Äq. 69 69 7 23 2

[PEG]-PEP^RhB [50 %] 2.50/2.50 Äq. 345 341 20 35 7

[PEG]-PEP^RhB [100 %] 5.00/0.00 Äq. 690 635 32 35 11

a Die Ligationsreaktionen wurden nach Protokoll B (vgl. Tabelle E11 Seite 173) durchgeführt. ^b Der theoretische FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] wurde entsprechend der gemessenen Ausgangskonzentration c^START [PEP^RhB] [μM] berechnet.

Gradient RP-UHPLC: 10 – 70 % Acetonitril in H²O (0.1 % HCOOH, v/v/v), 4 min, 210 nm.

Für die drei Reaktionsansätze wurden signifikante Unterschiede zwischen den theoretischen und erhaltenen Funktionalisierungsgraden FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] verzeichnet, obwohl mit frisch präparierten Maleinimid-funktionalisierten PEG-SCPs [PEG]-Mal gearbeitet worden war.

Gemäß diesen Resultaten schien die hier gewählte Strategie auf Basis der Konkurrenzreaktion zwischen PEP^RhB und 2ME nicht dazu geeignet, die angestrebten Peptidbeladungen zu erhalten.

Die geringen FD [PEP^RhB] [%] bzw. FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] unter Verwendung von 10 % bzw.

50 % PEP^RhB könnten dadurch erklärt werden, dass 2ME als niedermolekulare Thiol-Spezies sehr schnell an die leichter zugänglichen Maleinimid-Funktionen auf der Partikeloberfläche addieren kann. Dagegen unterliegt die kovalente Immobilisierung des Cystein-Peptides PEP^RhB mit einer molekularen Masse von 3678.13 g∙mol⁻¹ an die [PEG]-Mal kinetisch limitierten Diffusionsprozessen.^[365] Folglich sollte der Reaktionsansatz mit [PEG]-PEP^RhB [100 %] aufgrund der langen Ligationszeit von 24 Stunden dennoch zu einer hohen Umsetzung der partikel-gebundenen Maleinimide durch PEP^RhB führen. Im Vergleich zu dem vorgehenden Experiment – bei welchem durch Verwendung von 5.00 Äq. PEP^RhB ein FD [PEP^RhB] = 24 μmol∙g⁻¹ erhalten

wurde – war der hier erzielte Funktionalisierungsgrad mit FD [PEP^RhB] = 11 μmol∙g⁻¹ um etwa 50 % verringert. Da für die letzten Messungen der Einfluss hinsichtlich der Hydrolyse-empfindlichkeit der Maleinimid-Funktionen ausgeschlossen wurde, galt es an dieser Stelle den gewählten Quantifizierungsansatz in Form von Überstandsmessungen zu hinterfragen.

Bereits während der Vorbereitung der Reaktionsansätze wurde beobachtet, dass die PEG-Mal insbesondere in wässrigen Lösungen an den Kunststoffoberflächen der Pipettenspitzen und Probengefäße hafteten, obwohl silikonbeschichtete Mikrozentrifugenröhrchen zur Ligation verwendet wurden. Dadurch war eine quantitative Handhabung der Hydrogelpartikel erschwert und führte zu Partikelverlusten durch die notwendigen Waschschritte zur Einstellung der Ligationsbedingungen. Auch eine Verlängerung der Zentrifugationszeiten zur Sedimentation der Peptid-PEG-SCPs ergab diesbezüglich nur eine leichte Verbesserung. Für die zuletzt durchgeführte Messreihe wurde deshalb auf einen vollständigen Austausch des Lösungsmittels verzichtet. Hierfür wurden nach der Sedimentation der in DMF gelagerten Hydrogelpartikel definierte Mengen des Überstandes abgenommen und das Ligationsmedium 0.1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) versetzt mit 2 M Gu∙HCl (pH 7.0) zusammen mit Cystein-Peptid PEP^RhB hinzugegeben. So erfolgte die Immobilisierung von PEP^RhB an die PEG-Mal in einem Cosolvens aus organischem Lösungsmittel und wässrigem Ligationspuffer.

Ungeachtet dieses praktikableren Vorgehens ist die Bestimmung der Peptidbeladungen FD [PEP^RhB] [%] bzw. des Funktionalisierungsgrades FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] über indirekte Methoden durch Überstandsmessungen nur begrenzt aussagekräftig. Alternativ sollte die Quantifizierung daher zukünftig über eine direkte Aminosäuren-Analyse der an PEG-SCPs gebundenen Peptidsequenzen durch den EDMAN-Abbau erfolgen.^[260]

Durch die Immobilisierung des enzymresponsiven Cystein-Peptides PEP^RhB an Maleinimid-funktionalisierte PEG-SCPs [PEG]-Mal wurden elastische PEG-Hydrogelpartikel [PEG]-PEP^RhB erhalten, welche eine Charakterisierung der spezifischen Wechselwirkungen enzymatisch akti-vierbarer Adhäsionsdomänen mit Siliciumdioxid-Oberflächen ermöglichen sollten. Zur Bestim-mung der Adhäsionsenergien der mittels TEV Protease modulierbaren Affinitätsbiosensor-Systeme wurden die in Kapitel 2.7.2 (vgl. Seite 26) beschriebene RICM-Technik herangezogen.