E XPERIMENTE ZUR ENZYMATISCHEN A KTIVIERUNG VON S4-PEG

Zur Untersuchung des Adsorptionsverhaltens des enzymatisch aktivierten S4-PEG wurde die Ansatzgröße des in Tabelle E5 aufgeführten Protokolls (vgl. Kapitel 5.6.1.1 Seite 140) auf ein Gesamtvolumen von 800.0 μL hochskaliert. Dazu wurden 1.30 mg (0.23 μM) S4-PEG in MQH²O aufgenommen und 80.0 μL des 10× TEV Puffers hinzugefügt. Die Zugabe von 36 Units der Enzymcharge #1 der TEV Protease (spezifische Aktivität: 5 Units∙μL⁻¹; 7.20 μL) markierte den Beginn der Enzymreaktion unter den Aktivierungsbedingungen von 25 mM Tris∙HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 14 mM 2ME bei einer Temperatur von 30 °C. Nach einer Inkubations-zeit von 16 h und einer Drehzahl von 600 min⁻¹ wurden 100.0 μL der Aktivierungslösung entnommen und die katalytische Aktivität des Enzyms durch die Zugabe von 100.0 μL einer 10 mM Lösung Iodacetamid in MQH²O inhibiert. Der Substratumsatz wurde mittels analyti-scher HPLC nach einer Normierung entsprechend der in Tabelle E3 angegebenen 87%igen Reinheit von S4-PEG (vgl. Kapitel 5.5.16.1 Seite 127) auf 78 % bestimmt. Für die Messung wurde die verbleibende Aktivierungslösung 1:25 (v/v) in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) auf Konzentrationen von 34 μg∙mL⁻¹ (7.7 μM) G-TBP-PEG^ENZ und 2 Units∙mL⁻¹ TEV Protease verdünnt und das Experiment nach Protokoll 8 durchgeführt. Die Adsorptions- und Desorptionsisothermen des enzymatisch aktivierten S4-PEG auf einem titanbeschichteten Sensorkristall (QSX 310 Ti) sind in Abbildung E41 dargestellt.

Abbildung E41. Adsorptions- und Desorptionsisothermen des enzymatisch aktivierten S4-PEG: Frequenz-änderungen (a) und Dissipationsänderungen (b). Bedingungen: 0.00 – 0.58 h – Äquilibierung mit 20 mM phosphat-Puffer (pH 7.0); 0.58 – 4.08 h – Inkubation der Aktivierungslösung 1:25 (v/v) verdünnt in 20 mM Natrium-phosphat-Puffer (pH 7.0) auf 34 μg∙mL⁻¹ (7.7 μM) G-TBP-PEG^ENZ und 2 Units∙μL⁻¹ TEV Protease; 4.08 – 7.00 h – Spülen mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0).

5.7.4.2 Referenzexperiment: nicht-aktiviertes S4-PEG ohne TEV Protease

1.00 mg (0.18 μmol) S4-PEG wurden ohne den Zusatz der TEV Protease in MQH²O aufge-nommen und 61.7 μL des 10× TEV Puffers zu einem Endvolumen von 617.3 μL hinzugegeben, um die Aktivierungsbedingungen von 25 mM Tris∙HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 14 mM 2ME einzustellen. Nach einer Inkubationszeit von 16 h bei einer Temperatur von 30 °C und einer

Drehzahl von 600 min⁻¹ wurde die Referenzlösung 1:25 (v/v) in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) auf eine Konzentration von 64 μg∙mL⁻¹ (11.2 μM) S4-PEG verdünnt und nach Proto-koll 8 vermessen. Die Adsorptions- und Desorptionsisothermen des nicht-aktivierten S4-PEG auf einem titanbeschichteten Sensorkristall (QSX 310 Ti) sind in Abbildung E42 dargestellt.

Abbildung E42. Adsorptions- und Desorptionsisothermen des nicht-aktivierten S4-PEG: Frequenzänderungen (a) und Dissipationsänderungen (b). Bedingungen: 0.00 – 0.58 h – Äquilibierung mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0); 0.58 – 4.08 h – Inkubation der Referenzlösung 1:25 (v/v) verdünnt in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) auf 64 μg∙mL⁻¹ (11.2 μM) S4-PEG; 4.08 – 7.00 h – Spülen mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0).

5.7.4.3 Referenzexperiment: G-TBP-PEG^CHEM ohne TEV Protease

0.79 mg (0.18 μmol) des synthetischen Analogons G-TBP-PEG^CHEM wurden ohne den Zusatz der TEV Protease in MQH²O aufgenommen und 61.7 μL des 10× TEV Puffers zu einem Endvolumen von 617.3 μL hinzugegeben, um die Aktivierungsbedingungen von 25 mM Tris∙HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 14 mM 2ME einzustellen. Nach einer Inkubationszeit von 16 h bei einer Temperatur von 30 °C und einer Drehzahl von 600 min⁻¹ wurde die Referenzlösung 1:25 (v/v) in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) auf eine Konzentration von 50 μg∙mL⁻¹ (11.2 μM) G-TBP-PEG^CHEM verdünnt und nach Protokoll 8 vermessen. Die Adsorptions- und Desorptionsisothermen von G-TBP-PEG^CHEM auf einem titanbeschichteten Sensorkristall (QSX 310 Ti) sind in Abbildung E43 dargestellt.

Abbildung E43. Adsorptions- und Desorptionsisothermen der Aktivierungsreferenz G-TBP-PEG^CHEM: Frequenz-änderungen (a) und Dissipationsänderungen (b). Bedingungen: 0.00 – 0.58 h – Äquilibierung mit 20 mM phosphat-Puffer (pH 7.0); 0.58 – 4.08 h – Inkubation der Referenzlösung 1:25 (v/v) verdünnt in 20 mM Natrium-phosphat-Puffer (pH 7.0) auf 50 μg∙mL⁻¹ (11.2 μM) G-TBP-PEG^CHEM; 4.08 – 7.00 h – Spülen mit 20 mM Natrium-phosphat-Puffer (pH 7.0).

5.7.4.4 Referenzexperiment: Suppressionsdomäne IF4^CHEM ohne TEV Protease

0.22 mg (0.18 μmol) des synthetischen Analogons der Suppressionsdomäne IF4^CHEM wurden ohne den Zusatz der TEV Protease in MQH²O aufgenommen und 61.7 μL des 10× TEV Puffers zu einem Endvolumen von 617.3 μL hinzugegeben, um die Aktivierungsbedingungen von 25 mM Tris∙HCl, (pH 8.0), 150 mM NaCl, 14 mM 2ME einzustellen. Nach einer Inkubationszeit von 16 h bei einer Temperatur von 30 °C und einer Drehzahl von 600 min⁻¹ wurde die Referenz-lösung 1:25 (v/v) in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) auf eine Konzentration von 14 μg∙mL⁻¹ (11.2 μM) IF4^CHEM verdünnt und nach Protokoll 8 vermessen. Die Adsorptions- und Desorptionsisothermen der Suppressionsdomäne IF4^CHEM auf einem titanbeschichteten Sensor-kristall (QSX 310 Ti) sind in Abbildung E44 dargestellt.

Abbildung E44. Adsorptions- und Desorptionsisothermen des synthetischen Analogons der Suppressionsdomäne IF4^CHEM: Frequenzänderungen (a) und Dissipationsänderungen (b). Bedingungen: 0.00 – 0.58 h – Äquilibierung mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0); 0.58 – 4.08 h – Inkubation der Referenzlösung 1:25 (v/v) verdünnt in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) auf 14 μg∙mL⁻¹ (11.2 μM) IF4^CHEM; 4.08 – 7.00 h – Spülen mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0).

5.7.4.5 Referenzexperiment: artifizielle Referenz REF1^CHEM [78 %] ohne TEV Protease

Basierend auf dem mittels analytischer HPLC bestimmten Substratumsatz des enzymatisch aktivierten S4-PEG von 78 % (vgl. Kapitel 5.7.4.1 Seite 149) wurde eine artifizielle Referenz REF1^CHEM [78 %] bestehend aus den synthetischen Analoga des Binders G-TBP-PEG^CHEM und der Suppressionsdomäne IF4^CHEM sowie des verbleibenden Eduktes S4-PEG in Protease-Puffer hergestellt. Dazu wurden 0.54 mg (0.12 μmol) G-TBP-PEG^CHEM, 0.15 mg (0.12 μmol) IF4^CHEM und 0.32 mg (0.06 μmol) des Substrates S4-PEG ohne den Zusatz der TEV Protease in MQH2O aufgenommen und 61.7 μL des 10× TEV Puffers zu einem Endvolumen von 617.3 μL hinzuge-geben, um die Aktivierungsbedingungen von 25 mM Tris∙HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 14 mM 2ME einzustellen. Nach einer Inkubationszeit von 16 h bei einer Temperatur von 30 °C und einer Drehzahl von 600 min⁻¹ wurde die Referenzlösung 1:25 (v/v) in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) auf Konzentrationen von 34 μg∙mL⁻¹ (7.7 μM) G-TBP-PEG^CHEM, 10 μg∙mL⁻¹ (7.8 μM) IF4^CHEM sowie 20 μg∙mL⁻¹ (3.6 μM) S4-PEG verdünnt und nach Protokoll 8 vermessen.

Die Adsorptions- und Desorptionsisothermen der artifiziellen Referenz REF1^CHEM [78 %] auf einem titanbeschichteten Sensorkristall (QSX 310 Ti) sind in Abbildung E45 dargestellt.

Abbildung E45. Adsorptions- und Desorptionsisothermen der artifiziellen Referenz REF1^CHEM [78 %]: Frequenz-änderungen (a) und Dissipationsänderungen (b). Bedingungen: 0.00 – 0.58 h – Äquilibierung mit 20 mM phosphat-Puffer (pH 7.0); 0.58 – 4.08 h – Inkubation der Referenzlösung 1:25 (v/v) verdünnt in 20 mM Natrium-phosphat-Puffer (pH 7.0) auf 34 μg∙mL⁻¹ (7.7 μM) G-TBP-PEG^CHEM, 10 μg∙mL⁻¹ (7.8 μM) IF4^CHEM und 20 μg∙mL⁻¹ (3.6 μM) S4-PEG; 4.08 – 7.00 h – Spülen mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0).

5.7.4.6 Referenzexperiment: Protease-Puffer ohne TEV Protease

61.7 μL des 10× TEV Puffers wurden ohne den Zusatz der TEV Protease in MQH²O auf ein Endvolumen von 617.3 μL verdünnt, um die Aktivierungsbedingungen von 25 mM Tris∙HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 14 mM 2ME einzustellen. Nach einer Inkubationszeit von 16 h bei einer Temperatur von 30 °C und einer Drehzahl von 600 min⁻¹ wurde die Referenzlösung 1:25 (v/v) in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) auf Konzentrationen von 0.98 mM Tris∙HCl, 5.89 mM NaCl, 0.55 mM 2ME verdünnt und nach Protokoll 8 vermessen. Die Adsorptions- und Desorp-tionsisothermen des Protease-Puffers auf einem titanbeschichteten Sensorkristall (QSX 310 Ti) sind in Abbildung E46 dargestellt.

Abbildung E46. Adsorptions- und Desorptionsisothermen des Protease-Puffers: Frequenzänderungen (a) und Dissipationsänderungen (b). Bedingungen: 0.00 – 0.58 h – Äquilibierung mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0); 0.58 – 4.08 h – Inkubation der Referenzlösung 1:25 (v/v) verdünnt in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) auf 0.98 mM Tris∙HCl, 5.89 mM NaCl, 0.55 mM 2ME; 4.08 – 7.00 h – Spülen mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0).