5.2.1 FESTPHASENGEBUNDENE SYNTHESE DER PEPTIDE UND PEPTID-PEG-KONJUGATE
Die vollautomatischen Synthesen der Peptide und Peptid-PEG-Konjugate wurden an einem ABI 433A Peptid Synthesizer der Marke Applied BiosystemsTM (Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Deutschland) gemäß der Standard-Syntheseprotokolle (SynthAssist®, FastmocTM ABI) durchgeführt und die Protokolle ggf. modifiziert. Es wurden Ansätze in Maßstäben von 0.1 mmol und 0.25 mmol für 8 mL bzw. 41 mL Reaktoren gewählt. Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wurde mit einem UV-Vis-Detektor der Firma PerkinElmer® LAS GmbH (Rodgau, Deutschland) bei einer Wellenlänge von 301 nm quantitativ verfolgt.
5.2.2 SEMIPRÄPARATIVE HOCHLEISTUNGSFLÜSSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE (HPLC)
Die Aufreinigung der Peptide wurde an einem Shimadzu System (Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Deutschland) unter Verwendung einer CBM-20A Steuerungseinheit, eines DGU-14A Entgasers, einer LC-20AP Pumpe, eines SIL-20AHT Probengebers und einer FCV-200AL Niederdruckgradienteneinheit vorgenommen. Die Detektion der Signale erfolgte mittels eines dualen UV-Vis-Festwellenlängendetektors (SPD-10Avp, Shimadzu) mit einer präparativen Fluss-zelle bei einer Wellenlänge von 210 nm. Die Separation erfolgte automatisch durch die Chroma-tographiedatensoftware LabSolutions (Shimadzu) und die Fraktionen wurden mittels eines Fraktionssammlers (FRC-10A, Shimadzu) aufgefangen.
Zur Trennung diente eine SynergiTM Fusion-RP Säule (80 Å, 4 μm, 250 × 21.20 mm ID) mit einer SecurityGuardTM PREP Vorsäule (Fusion-RP, 15 × 21.20 mm ID) der Firma Phenomenex® (Aschaffenburg, Deutschland) bei einer Flussrate von 22 mL∙min−1 und Raumtemperatur. Als mobile Phase wurden eine binäre Mischung aus A (MQH2O mit 0.1 % HCOOH, v/v) und B (MeCN mit 0.1 % HCOOH, v/v) verwendet.
5.2.3 ANALYTISCHE HOCHLEISTUNGSFLÜSSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE (HPLC)
Die quantitativen RP-HPLC-Analysen wurden mittels eines Shimadzu Systems bestehend aus einer SLC-10Avp Steuerungseinheit, einem GT-154 Entgaser, einer LC-10ADvp Pumpe, einer FCV-10ALvp Niederdruckgradienteneinheit, einem CTO-10Avp Säulenofen und einem SPD-M10Avp PDA-Detektor (Wellenlängenbereich: 190 – 800 nm) vorgenommen. Die Probenauf-tragung erfolgte durch einen Jasco AS-950 Probengeber (Jasco Labor- und Datentechnik GmbH, Groß-Umstadt, Deutschland). Die Aufzeichnung der bei einer Wellenlänge von 210 min detek-tierten Daten erfolgte mittels der Chromatographie-Datensoftware LabSolutions (Shimadzu).
Zur Trennung diente eine EC 150/2 NUCLEODUR® C18 Gravity Säule (80 Å, 3 μm, 150 × 2 mm ID; Machery-Nagel GmbH, Düren, Deutschland) mit einer EC 4/2 NUCLEODUR® C18 Gravity Vorsäule (80 Å, 3 μm, 4 × 2 mm ID; Machery-Nagel) bei einer Flussrate von 0.3 mL∙min−1 und einer Temperatur von 40 °C. Als mobile Phase wurden eine binäre Mischung aus A (MQH2O mit 0.1 % HCOOH, v/v) und B (MeCN mit 0.1 % HCOOH, v/v) verwendet.
5.2.4 ANALYTISCHE ULTRAHOCHLEISTUNGSFLÜSSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE MIT MASSEN
-SPEKTROMETRIE (UHPLC-MS)
Die Reinheit der synthetisierten Peptide und der Peptid-PEG-Konjugate nach CNBr-Spaltung wurde mittels analytischer UHPLC-MS bei einer Wellenlänge von 210 nm überprüft. Dabei wurde ein ACQUITY-UPLC® H-Class CM Core System der Firma Waters GmbH (Eschborn, Deutschland) mit einem ACQUITY-UPLC® Photodiodenarray (PDA)-Detektor (Wellenlängen-bereich: 190 – 500 nm) und einem ACQUITY-UPLC® QDa Massendetektor im positiven Modus verwendet. Sowohl die Aufzeichnung der gemessenen Daten als auch die Auswertung der Chromatogramme und Massenspektren wurde mittels der Chromatographie-Datensoftware EmpowerTM 3 (Waters) vorgenommen.
Zur Trennung dienten ACQUITY-UPLC® BEH C18 Säulen (110 Å, 1.7 μm, 50 × 2.1 mm ID und 110 Å, 1.7 μm, 100 × 2.1 mm ID) mit ACQUITY-UPLC® BEH C18 VanGuardTM Vorsäulen (110 Å, 1.7 μm, 5 × 2.1 mm ID) der Firma Waters bei einer Flussrate von 0.5 mL∙min−1 und einer Temperatur von 40 °C. Als mobile Phase wurden eine binäre Mischung aus A (MQH2O mit 0.1 % HCOOH, v/v) und B (MeCN mit 0.1 % HCOOH, v/v) verwendet.
5.2.5 MATRIX-UNTERSTÜTZTE LASER-DESORPTION/IONISATION MIT FLUGZEITMASSEN
-SPEKTROMETER-DETEKTION (MALDI-TOF-MS)
Die Massenspektren wurden an einem Bruker autoflex II smartbeamTM (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Deutschland) mit MALDI und einem Flugzeitmassenspektrometer (ToF) aufgenom-men. Die zu analysierenden Proben sowie die Matrices DHB und αCHCA mit Konzentrationen von 10 mg∙mL−1 bzw. 7 mg∙mL−1 wurden in MQH2O/MeCN (1:1, v/v) versetzt mit 0.1% TFA aufgenommen. Auf der Probenplatte wurde 1 μL der entsprechenden Matrix vorgelegt und mit jeweils 1 μL Probe vermischt. Die Messungen erfolgten im linear-positiven Modus, nachdem die Proben bei Raumtemperatur getrocknet wurden.
5.2.6 FOURIER-TRANSFORM-INFRAROTSPEKTROSKOPIE (FT-IR)
Die FT-IR-Spektren wurden mit einem Bruker Vertex 70v FT-IR-Spektrometer (Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Deutschland) im Bereich von 4000 – 400 cm−1 aufgezeichnet. Die Proben wurden als Feststoff bei Raumtemperatur im Feinvakuum vermessen. Die Lage der IR-Banden wurde in cm−1 (υ) und die Intensität der Signale als sehr stark (vs), stark (s), mittel (m), schwach (w) und sehr schwach (vw) angegeben.
5.2.7 KERNMAGNETISCHE RESONANZSPEKTROSKOPIE (NMR)
Die NMR-spektroskopischen Messungen wurden mit einem Bruker AvanceIII-500 Spektrometer (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Deutschland) in 5-mm-NMR-Röhrchen bei einer Tempe-ratur von 20 °C vorgenommen. Zur Aufnahme der 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren wurden Messfrequenzen bei 500.13 MHz bzw. 125.76 MHz verwendet. Die 13C-NMR-Spektren wurden
1H-enkoppelt oder nach der APT-Prozedur aufgezeichnet. Alle chemischen Verschiebungen [δ]
wurden relativ zu Tetramethylsilan in parts per million [ppm] angegeben, die Kopplungs-konstanten J in Hertz [Hz], sowie die integrierte Protonenzahl. Die Signalmultiplizitäten wur-den wie folgt abgekürzt: s = Singulett, d = Dublett, dd = Dublett von Dubletts, t = Triplett und m = Multiplett. Die Kalibirierung in 1H-NMR-Spektren erfolgte intern gegen das Restprotonen-Signal bzw. in 13C-NMR-Spektren gegen das 13C-Signal des deuterierten Lösungsmittels.
Die Messungen wurden im Service durch ANGELA THIESIES der Arbeitsgruppe NMR-Spektroskopie von Prof. Dr. CLEMENS MÜGGE (Institut für Chemie, Humboldt-Universität zu Berlin) vorgenommen.
5.2.8 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
Die Fluoreszenz-Emissions-Spektren wurden mit einem Synergy MX Mikroplattenleser (BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichhall, Deutschland) in schwarzen 96-Loch-Fluoreszenz-Mikro-titerplatten (Thermo Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Deutschland) gemessen und mittels der BioTek Gen5 Data Analysis Software aufgezeichnet.
5.2.9 ZENTRIFUGATION
Die Zentrifugationen von gefällten Peptiden und Peptid-PEG-Konjugaten wurden in einer Tischzentrifuge Universal 320 der Firma Andreas Hettich GmbH & Co.KG (Tuttlingen, Deutsch-land) bei einer Drehzahl von 9000 min−1 für 15 – 20 min durchgeführt. Als Gefäße dienten 50 mL Zentrifugenröhrchen der Firma Sarstedt AG & Co. (Nümbrecht, Deutschland).
Für die Zentrifugationen der Reaktionsansätze der enzymatischen Aktivierung sowie für die Waschschritte der PEG-Partikel wurde eine Mikroliterzentrifuge (Mini-Zentrifuge mini G, Carl Roth®) bei einer Drehzahl von 6000 min−1 verwendet.
5.2.10 LYOPHILISATION
Für die Lyophilisation wurden die Proben in MQH2O aufgenommen bzw. nach Bedarf MeCN zur Verbesserung der Löslichkeit zugesetzt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Anschlie-ßend wurden die Proben in einer Gefriertrocknungsanlage Alpha 1-4 der Firma Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH (Osterode, Deutschland) im Feinvakuum eingeengt.
5.2.11 TEMPERIERTE REAKTIONSANSÄTZE IM MIKROMAßSTAB
Für eine konstante Temperierung der Aktivierungsansätze in 1.7 mL-Mikrozentrifugenröhr-chen wurde ein Kühl-Thermomixer MKR 13 der Firma DITABIS AG (Pforzheim, Deutschland) bei einer Temperatur von 30 °C und einer Drehzahl von 600 min−1 verwendet.