I MMOBILISIERUNG VON C YSTEIN -P EPTIDEN

Für die Immobilisierung der Cystein-Peptide PEP^RhB und PEP^TBP an [PEG]-Mal wurden zwei verschiedene Vorschriften (Protokoll A und Protokoll B) mit festgelegten Waschschritten und Zentrifugationszeiten zur Sedimentation der Kolloide entwickelt. Diese dienten zur Vorbe-reitung der Ligationsbedingungen der verschiedenen Reaktionsansätze sowie zur Abtrennung der nicht-kovalent gebundenen Peptide nach der Ligation. Die Ligationen wurden mit defi-nierten Mengen der Partikeldispersionen der jeweiligen SCP-Chargen in silikonbeschichteten Mikrozentrifugenröhrchen (Sigma-Aldrich^®, 1.7 mL) durchgeführt. Als Ligationspuffer wurde ein 0.1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) mit 2 M Guanidinhydrochlorid (pH 7.0) verwendet.

Die Bestimmung der relativen Peptidbeladungen FD [PEP^RhB] [%] und der finalen Funktiona-lisierungsgrade FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] erfolgten mittels analytischer RP-UHPLC.

5.8.2.1 Quantitative Analyse der Oxidation des Cystein-Peptides PEP^RhB

Erste Vorarbeiten zur Immobilisierung von 162 μM Cystein-Peptid PEP^RhB an 200 μL Partikel-dispersion [PEG]-Mal (SCP-Charge #1: 80 μmol∙g⁻¹) wurden in einem 0.1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) ohne 2 M Guanidinhydrochlorid (pH 7.0) durchgeführt. Nach 4 Stunden wurde die Dispersion durch 10-minütiges Zentrifugieren sedimentiert, 15 μL Lösung aus dem Über-stand entnommen und nach einer Verdünnung von 3:10 (v/v) in 0.1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) mittels analytischer RP-UHPLC vermessen. Das UHPLC-Chromatogramm (Abbildung E65) zeigt die partielle Oxidation des Cystein-Peptides PEP^RhB zum korrespon-dieren Disulfid [PEP^RhB]² zu etwa 13 % entsprechend des Verhältnisses der Signalflächen der beiden Spezies.

Abbildung E65. Quantitative Analyse der Oxidation des Cystein-Peptides PEP^RhB unter Bildung des korrespon-dierenden Disulfides [PEP^RhB]² nach 4 Stunden mittels analytischer RP-UHPLC. Gradient: 10 – 70 % B, 4 min, 210 nm.

* UV-Vis-Signal des 0.1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0). Bedingungen: 162 μM PEP^RhB 3:10 (v/v) verdünnt in 0.1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0).

5.8.2.2 Bestimmung des Peptid-Funktionalisierungsgrades

Die Immobilisierung verschiedener Äquivalente PEP^RhB an [PEG]-Mal in Ligationspuffer in Gegenwart von 5 Äq. TCEP bezogen auf die eingesetzten Konzentrationen PEP^RhB und die Probennahmen zur Bestimmung der Ausgangskonzentrationen sowie der relativen Peptid-beladungen FD [PEP^RhB] [%] und der finalen Funktionalisierungsgrade FD [PEP^RhB] [μmol∙g⁻¹] mittels analytischer RP-UHPLC erfolgten nach Protokoll A (vgl. Tabelle E10).

Tabelle E10. Vorschrift zur Immobilisierung verschiedener Äquivalente des Cystein-Peptides PEP^RhB an [PEG]-Mal (SCP-Charge #2: 36 ± 5 μmol∙g⁻¹) inklusive Vor- und Nachbereitung der Proben unter Angabe der Zentrifugations-zeiten zur Sedimentation der Kolloide (Protokoll A).

Schritte Experimentelle Vorgehensweise Zentrifugation

1 Probenvorbereitung 300 μL der Suspension [PEG]-Mal mind. 10 min SCP-Charge #2 Abnehmen des max. Überstandes

2 Waschen 1 x 500 μL MQH2O 5 min

vor der Ligation 2 x 500 μL Ligationspuffer jeweils 5 min

3 Ligation Zugabe verschiedener Äq. PEP^RhB 30 s schütteln

in 210 μL Ligationspuffer max. 2 min

Ausgangskonzentration Abnehmen von 10 μL aus dem Überstand für Messung 24 h schütteln 4 Probennahme Zentrifugation für Umsatzkontrolle mind. 10 min

Umsatzkontrolle Abnehmen von 10 μL aus dem Überstand

5 Probennahme Zentrifugation für finale Umsatzkontrolle mind. 10 min nach der Ligation Abnehmen des Überstandes – davon 10 μL für Messung

6 Rückstandsprüfung 1 – 3 x mit 200 − 500 μL Ligationspuffer jeweils 10 min und jeweils Abnehmen des Überstandes für Messung

7 Waschen 1 x 500 μL Ligationspuffer 5 min

nach der Ligation 1 x 500 μL MQH2O 5 min

Schütteln für 10 min in 500 μL 1 M Gu∙HCl (pH 7.0) 5 min

1 x 500 μL MQH2O jeweils 5 min

An Hand analytischer RP-UHPLC-Messungen konnte der Verbrauch von PEP^RhB bzw. PEP^TBP* zeitlich verfolgt werden. Dafür wurden die entnommenen Aliquoten in MQH²O/MeCN (4:1, v/v) versetzt mit 0.1 % HCOOH verdünnt (1:4, v/v). Die Waschlösungen zur Rückstands-prüfung wurden unverdünnt vermessen. Die entsprechenden UV-Vis-Signale der Cystein-Peptide ermöglichten aufgrund des linearen Zusammenhangs zwischen Signalfläche und Konzentration eine indirekte Quantifizierung der jeweiligen Peptidbeladungen und Funktionalisierungsgrade. Für die Kalibrierungen wurden verschiedene Konzentrationen in Gegenwart von 5 Äq. TCEP mittels analytischer RP-UHPLC dreifach vermessen. Die entsprech-enden Signalflächen wurde mit Hilfe der Chromatographiedatensoftware Empower 3 der Firma Waters bestimmt. In Abbildung E66 sind die gemittelten Signalflächen der Kalibrierungs-lösungen in Abhängigkeit von der Konzentration von PEP^RhB bzw. PEP^TBP* aufgetragen. Durch das Anlegen linearer Ausgleichgeraden konnten die Anstiege und Bestimmtheitsmaße ermittelt werden.

Kalibrierung PEP^RhB

Kalibrierungslösungen: 5 – 50 μM PEP^RhB in Ligationspuffer/MQH2O/MeCN (5:16:4, v/v/v) versetzt mit 0.1 % HCOOH

Gradient RP-UHPLC: 10 – 70 % B, 4 min, 210 nm

Ausgleichsgerade: 565∙10² ± 8∙10² mit R² = 0.99817 (vgl. Abbildung E66a) Kalibrierung PEP^TBP*

Kalibrierungslösungen: 5 – 50 μM PEP^TBP* in Ligationspuffer/MQH2O/MeCN (5:16:4, v/v/v) versetzt mit 0.1 % HCOOH

Gradient RP-UHPLC: 5 – 50 % B, 4 min, 210 nm

Ausgleichsgerade: 248∙10² ± 2∙10² mit R² = 0.99953 (vgl. Abbildung E66b)

Abbildung E66. Auftragung der mittels analytischer RP-UHPLC bestimmten Signalflächen in Abhängigkeit von der Konzentration Cystein-Peptid: 5 – 50 μM PEP^RhB in Ligationspuffer/MQH2O/MeCN (5:16:4, v/v/v) mit 0.1 % HCOOH (a). Gradient: 10 – 70 % B, 4 min, 210 nm. 5 – 50 μM PEP^TBP* in Ligationspuffer/MQH2O/MeCN (5:16:4, v/v/v) mit 0.1 % HCOOH (b). Gradient: 5 – 50 % B, 4 min, 210 nm.

Die Immobilisierung verschiedener Verhältnisse aus Cystein-Peptiden PEP^RhB bzw. PEP^TBP* und 2ME an [PEG]-Mal in Ligationspuffer und die Probennahmen zur Bestimmung der entsprechenden Ausgangskonzentrationen sowie der relativen Peptidbeladungen und der finalen Funktionalisierungsgrade mittels analytischer RP-UHPLC erfolgten nach Protokoll B (vgl. Tabelle E11).

Tabelle E11. Vorschrift zur Immobilisierung verschiedener Verhältnisse aus Cystein-Peptiden PEP^RhB bzw. PEP^TBP* und 2ME als fünffacher Überschuss an PEG-SCPs [PEG]-Mal (SCP-Charge #3: 35 ± 3 μmol∙g⁻¹) inklusive Vor- und Nachbereitung der Proben unter Angabe der Zentrifugationszeiten zur Sedimentation der Kolloide (Protokoll B).

Schritte Experimentelle Vorgehensweise Zentrifugation

1 Probenvorbereitung 500 μL der Suspension [PEG]-Mal 20 min SCP-Charge #3 Abnehmen von 450 μL aus dem Überstand

2 Ligation Zugabe verschiedener Verhältnisse Cystein-Peptid : 2ME 30 s schütteln

in 460 μL Ligationspuffer max. 2 min

Ausgangskonzentration Abnehmen von 10 μL aus dem Überstand für Messung 24 h schütteln 3 Probennahme Zentrifugation für finale Umsatzkontrolle mind. 10 min

nach der Ligation Abnehmen des Überstandes – davon 10 μL für Messung

4 Waschen 2 x 500 μL MQH₂O/MeCN (50:50, v/v) mit 0.1 % TFA jeweils 10 min

für RICM-Messungen 2 x 500 μL PBS (pH 7.0) jeweils 10 min

Dispergieren von 100 μL der Probe in PBS (pH 7.0)

An Hand analytischer RP-UHPLC-Messungen konnte der Verbrauch von PEP^RhB bzw. PEP^TBP* zeitlich verfolgt werden. Dafür wurden die entnommenen Aliquoten in MQH²O/MeCN (4:1, v/v) versetzt mit 0.1 % HCOOH verdünnt und mit 100 μM TCEP für 30 min reduziert.

Ansatz 0.50/4.50 Äq. Cystein-Peptid/2ME: 10 μL Probe

30 μL MQH²O/MeCN (4:1, v/v) mit 0.1 % HCOOH 10 μL 500 μM TCEP

Ansatz 2.50/2.50 Äq. Cystein-Peptid/2ME: 10 μL Probe

70 μL MQH²O/MeCN (4:1, v/v) mit 0.1 % HCOOH 20 μL 500 μM TCEP

Ansatz 0.00/5.00 Äq. Cystein-Peptid/2ME: 10 μL Probe

150 μL MQH²O/MeCN (4:1, v/v) mit 0.1 % HCOOH 40 μL 500 μM TCEP

Die relativen Peptidbeladungen FD [PEP^TBP*] [%] und die finalen Funktionalisierungsgrade FD [PEP^TBP*] [μmol∙g⁻¹] der Reaktionsansätze unter Verwendung verschiedener Verhältnisse PEP^TBP* und 2ME im Überschuss zur Darstellung von [PEG]-PEP^TBP* sind in Tabelle E12 ange-geben.

Tabelle E12. Reaktionsansätze zur Immobilisierung verschiedener Verhältnisse PEP^TBP* und 2ME im Überschuss an [PEG]-Mal unter Angabe der relativen Peptidbeladungen FD [PEP^TBP*] [%] sowie der finalen Funktionalisierungs-grade FD [PEP^TBP*] [μmol∙g⁻¹] der gebildeten [PEG]- PEP^TBP*.

abgeschätzte Äq. c_START [PEP^TBP*] [μM] FD [PEP^TBP*] [%] FD [PEP^TBP*] [μmol∙g⁻¹] Bezeichnung PEP^TBP*/2ME berechnet gemessen 24 h theoretisch erhalten

[PEG]-PEP^TBP* [10 %] 0.50/4.50 Äq. 69 75 12 25 4

[PEG]-PEP^TBP* [50 %] 2.50/2.50 Äq. 345 373 52 35 18

[PEG]-PEP^TBP* [100 %] 5.00/0.00 Äq. 690 674 52 35 18