Q UARZKRISTALL -M IKROWAAGE MIT D ISSIPATIONSAUFZEICHNUNG (QCM-D)

Die QCM-D-Messungen erfolgten mit einem Q-Sense E1 Durchflussmodul (Biolin Scientific Holding AB, Stockholm, Schweden) ausgestattet mit einer IPC 4 Ismatec^® Multikanalpumpe (Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Deutschland) als flussunterbrechende Analyse. Als Oberflächen dienten titanbeschichtete (QSX 310 Ti, 120 nm; Q-Sense, Biolin Scientific; vgl. Abbildung E1) und mit Siliciumdioxid beschichtete piezoelektrische Sensorkristalle (QSX 303 SiO², 50 nm; Q-Sense, Biolin Scientific). Vor den Messungen wurden die Sensorkristalle nach der in Protokoll 9 beschriebenen Prozedur gereinigt. Anschließend wurde ein Sensor in der Durchflusskammer platziert und mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) bei einer Temperatur von 22 °C inkubiert. Die Messungen wurden bei Flussraten von 50 μL∙min⁻¹ für titanbeschichtete bzw.

30 μL∙min⁻¹ für mit Siliciumdioxid beschichtete Sensorkristalle durchgeführt. Die Oszillations-frequenzen wurden bis zum Erhalt einer konstanten Basislinie (ca. 1 – 3 h) beobachtet. Anschlie-ßend wurden die zu vermessenden Proben in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) aufge-nommen, im Ultraschallbad entgast und durch die Flusskammer gepumpt. Die Frequenzen wurden erneut aufgezeichnet, bis ein konstantes Signal erhalten wurde. Die nachfolgenden

Waschschritte erfolgten mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) oder in Puffer gelöstem BSA mit einer Konzentration von 10 mg∙mL⁻¹. Die Frequenzobertöne Δfⁿ/n sowie die Dissipationsobertöne ΔDⁿ von n = 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 13 wurden simultan mit der Anwender-software QSoft (Q-Sense, Biolin Scientific) aufgezeichnet und die jeweils dritten Obertöne Δf^{n = 3}/3 und ΔD^{n = 3} zur Auswertung herangezogen. Vor Beginn der Messungen wurden Schwebstoffe aus dem 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) bzw. den BSA-Lösungen mittels Rotilabo^® Spritzenfilter (PVDF, 0.22 μm, Ø 33 mm) entfernt.

Abbildung E1. Produktspezifikationen der titanbeschichteten piezoelektrischen Sensorkristalle (Titan: 120 nm, QSX 310 Ti; Biolin Scientific).

5.3.3.2 Protokoll 9: Reinigung der piezoelektrischen Sensorkristalle^[373]

Die Reinigungsprozedur wurde entsprechend der Literaturvorschrift adaptiert und erfolgte direkt vor den Messungen.^[373] Dazu wurden die piezoelektrischen Sensorkristalle für 30 min in 2% Hellmanex^TM in MQH²O (v/v) inkubiert, anschließend für 10 min in EtOH mit Ultraschall behandelt, danach mit MQH²O gewaschen und mit Druckluft (Dust Off 67, Kontakt Chemie^®, CRC Industries Deutschland GmbH, Iffezheim, Deutschland) getrocknet. Danach erfolgte für 3 – 5 min eine Behandlung mit Luftplasma in einem ZEPTO Plasmareiniger (Diener electronic GmbH, Ebhausen, Deutschland) bei einer Leistung von 75 W im Feinvakuum. Zum Schluss wurde die Prozedur mit 2 % Hellmanex^TM in MQH²O (v/v), Ultraschall in EtOH, Waschen mit MQH²O und Trocknen mit Druckluft wiederholt.

5.3.3.3 Protokoll 10: Adsorbierte Massen nach SAUERBREY für rigide Beschichtungen

Mittels der Modellierungssoftware QTools (Q-Sense, Biolin Scientific) wurden die adsorbierten Massen Δm^SAUERBREY [ng∙cm⁻²] der Beschichtungen der Peptid-PEG-Konjugate und der TEV Protease nach SAUERBREY bestimmt. Die Auswertung erfolgte an Hand der Frequenz-obertöne Δfⁿ/n von n = 3, 5, 7, und 9 nahe des Sättigungsbereiches. Die erhaltenen Werte wurden gemittelt und die entsprechenden Standardabweichungen berechnet.

5.3.3.4 Protokoll 11: Schichtdicken und adsorbierte Massen nach VOIGT für viskoelastische Beschich-tungen

Die Bestimmung der Schichtdicken d^VOIGT [nm] und adsorbierten Massen Δm^VOIGT [ng∙cm⁻²] nach VOIGT erfolgte an Hand der ermittelten Daten von Frequenz- und Dissipationsänderungen durch das Anlegen einer Näherungsfunktion. Dabei wurden die Rahmenbedingungen für die zu approximierenden Parameter unter Verwendung geeigneter Grenzen definiert und konstante Werte für die übrigen physikalischen Parameter basierend auf validierten Messdaten festgelegt. Die einzelnen Schritte zur Berechnung auf Basis der Programmfunktion “viscoelastic models for f and D” in QTools sind nachfolgend beschrieben:

Grundlegende Einstellungen (model settings): Die ersten Obertöne der aufgezeichneten Frequenz- und Dissipationsobertöne wurden aufgrund deren hoher Sensitivität ausgeschlossen und die Frequenzobertöne Δfⁿ/n sowie die Dissipationsobertöne ΔDⁿ von n = 3, 5, 7, 9 und 11 für die Modellierung verwendet. Maximal zwei der Obertöne wurden bei der Berechnung ausgeschlossen, sobald diese gegenüber dem übrigen Datensatz eine zu hohe Abweichung aufwiesen.

Zu nähernde Parameter (parameters to fit): Der initial verwendende Grenzbereich für die Viskosität η^FILM und das Schermodul μ^FILM der Beschichtungen sowie für die Schichtdicke d^VOIGT sind in Tabelle E1 aufgeführt. Die Anzahl der logarithmischen Stufen wurde auf 20 festgelegt.

Tabelle E1. Initiale Grenzen der zu nähernden Parameter für die Anwendung des VOIGT-Modells in QTools.

zu nähernde Parameter Grenzbereich

Viskosität der Beschichtung ηFILM 0.0005 – 0.01 kg∙m⁻¹∙s⁻¹ Schermodul der Beschichtung μ_FILM 1∙10⁵ – 1∙10⁸ Pa Schichtdicke dVOIGT 1∙10⁻¹⁰ – 1∙10⁻⁸ m

Festgelegte Parameter (fixed parameters): Die Dichte der Beschichtung ρFILM sowie die Dichte ρLM

und Viskosität η^LM des Lösungsmittels (LM) sollten möglichst dem realen System entsprechen und sind in Tabelle E2 aufgeführt. Da die Beschichtungen eingelagerte Wassermoleküle enthal-ten, wurden für die Parameter des Lösungsmittels die validierten Werte für Wasser angenom-men. Die Dichte ρFILM der Beschichtung wurde in Übereinstimmung mit Literaturangaben für Filme von Poly(ethylenglycol)en und Biokonjugaten auf 1.200 g∙cm⁻³ festgelegt.^[374-376]

Tabelle E2. Werte der festgelegten Parameter für die Anwendung des VOIGT-Modells in QTools.

festgelegte Parameter Werte Dichte des Lösungsmittels ρ_LM 1000 kg∙m⁻³ Viskosität des Lösungsmittels ηLM 0.001 kg∙m⁻¹∙s⁻¹ Dichte der Beschichtung ρ_FILM 1200 kg∙m⁻³

Gemessene Daten (measured data): Die automatische Standardabweichung wurde angewendet (automatic standard deviation estimation).

Einstellungen für die Modellierung (fit settings): Die Zeitachse wurde in Übereinstimmung mit dem Bereich der Adsorptionsisothermen festgelegt und die Option “grid only first row to fit”

ausgewählt.

Nach einer ersten Bestimmung der Schichtdicke (fit analysis) wurde die Näherungsfunktion durch Anpassung der Grenzen der zu nähernden Parameter optimiert, wobei gleichzeitig die Anzahl der logarithmischen Stufen auf 50 erhöht wurde. Die Bewertung der Näherungs-funktion erfolgte an Hand des Bestimmtheitsmaßes χ², welches sukzessiv minimiert wurde. Die verbesserte Näherungsfunktion ergab die eigentliche Schichtdicke d^VOIGT [nm] des viskoelasti-schen Films.

Für die Fehlerbestimmung wurde die berechnete Schichtdicke als ein konstanter Parameter gesetzt und die Grenzen der Modellierung auf ein schmales Zeitintervall von 1 – 2 min nahe dem Sättigungsbereich festgelegt. Die Viskosität und das Schermodul der Beschichtung wurden erneut genähert und das entsprechende Bestimmtheitsmaß χ² ermittelt. Anschließend wurde die Schichtdicke zu niedrigen und höheren Werten variiert, um eine Verdopplung von χ² zu erreichen. Die erhaltenen Differenzen entsprachen dem Fehler der Beschichtung.

Unter Verwendung der festgelegten Dichte der Beschichtung ρ^FILM = 1.200 g∙cm⁻³ konnte die Schichtdicke d^VOIGT [nm] in die adsorbierte Masse Δm^VOIGT [ng∙cm⁻²] für den jeweiligen Film umgerechnet werden:

∆𝑚𝑚_{𝑉𝑉𝐷𝐷𝐷𝐷𝐺𝐺𝐷𝐷} =𝑑𝑑_{𝑉𝑉𝐷𝐷𝐷𝐷𝐺𝐺𝐷𝐷}∙ 𝜌𝜌_{𝐹𝐹𝐷𝐷𝐹𝐹𝐹𝐹} (𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆𝐆 𝐄𝐄𝟏𝟏)