E NZYMATISCH AKTIVIERTE A DSORPTION DES SCHWACH - BINDENDEN D IMERES

Ausgehend von der quantitativen Analyse der enzymatischen Aktivierung des schwach-bindenden Dimeres (S7)²K-PEG konnte das Adsorptionsverhalten auf Titandioxid-Oberflächen mittels QCM-D untersucht werden. Dementsprechend wurden 1.00 mg Substrat mit 56 Units TEV Protease für 16 Stunden bei einer Temperatur von 30 °C inkubiert und durch analytische RP-HPLC-Messungen ein Substratumsatz von 79 % indirekt bestimmt. Die Aktivierungslösung wurde nach einer Verdünnung von 1:17 (v/v) in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) auf die Sensoroberfläche gegeben.^[267] In Abbildung 3.21 sind die Adsorptions- und Desorptions-isothermen des prozessierten Biokonjugates (S7)²K-PEG auf Titandioxid-Oberflächen den

Frequenzverschiebungen des nicht-aktivierten Vorläufers gegenübergestellt. Weiterhin sind die Referenzmessungen des synthetischen Analogons der Suppressionsdomäne IF7^CHEM und der zur Aktivierung verwendeten Enzymkonzentration an TEV Protease [56 Units] abgebildet. Für das aktivierte Dimer-Substrat (S7)²K-PEG konnte ein rascher Frequenzabfall auf − 38 Hz inner-halb der ersten 3 Minuten verzeichnet werden. Dies entsprach einer Beschichtung von 97 % gemessen an der Frequenzänderung von − 39 Hz nach einer Inkubationszeit von 90 Minuten.^[267]

Folglich konnten durch die proteolytische Abtrennung der anionischen Supressionsdomänen die adhäsiven Eigenschaften des divalenten Binders (G-TBP)²K-PEG^ENZ effektiv zurückgebildet werden. Entsprechend des für das enzymresponsive Biokonjugat (S7)²K-PEG ermittelten Substratumsatzes wurde für die abgespaltene Suppressionsdomäne IF7^ENZ eine Referenzlösung des synthetischen Analogons IF7^CHEM in Protease-Puffer angesetzt und diese verdünnt in Phosphat-Puffer vermessen. Erwartungsgemäß adsorbierte die haftungsunterbindende Einheit nur minimal und konnte im anschließenden Spülschritt wieder vollständig von der Oberfläche gelöst werden. Für die Referenzexperimente des nicht-aktivierten Dimeres (S7)²K-PEG und der TEV Protease [56 Units] wurden Lösungen basierend auf den zur enzymatischen Aktivierung eingesetzten Konzentrationen verdünnt in Phosphat-Puffer aufgegeben.^[267] Das unbehandelte Biokonjugat zeigte eine leichte Oberflächenhaftung mit einer Frequenzänderung von − 10 Hz während der Inkubationsphase. Im Gegensatz zu der Bindungskinetik des prozessierten (S7)²K-PEG wies das nicht-aktivierte Substrat jedoch eine deutlich verlangsamte initiale Haftung auf. Dahingegen wurde der enzymatisch gebildete Dimer-Binder (G-TBP)²K-PEG^ENZ zügig auf der Metalloxid-Oberfläche akkumuliert. Gemäß der Frequenzverschiebung des unbehandelten (S7)2K-PEG nach 90 Minuten Inkubation konnte durch den Aktivierungsprozess die Materialanreicherung um 75 % gesteigert werden.

Abbildung 3.21. Adsorptions- und Desorptionsisothermen des enzymatisch aktivierten (S7)2K-PEG im Vergleich zu den Frequenzverschiebungen des nicht-aktivierten Vorläufers und des chemischen Analogons der Suppressions-domäne IF7^CHEM sowie der TEV Protease [56 Units]. Für die Aktivierung wurden 1.00 mg (S7)²K-PEG für 16 Stunden mit 56 Units TEV Protease in Gegenwart des Protease-Puffers bei einer Temperatur von 30 °C inkubiert und die Lösung nach einer Verdünnung von 1:17 (v/v) in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) aufgetragen. Das nicht-aktivierte (S7)²K-PEG und des chemischen Analogon der Suppressionsdomäne IF7^CHEM sowie die Enzymreferenz wurden ebenfalls mit Protease-Puffer behandelt und nach einer Verdünnung von 1:17 (v/v) in 20 mM phosphat-Puffer (pH 7.0) vermessen. Bedingungen: Die titanbeschichteten Sensoren wurden mit 20 mM Natrium-phosphat-Puffer (pH 7.0) äquilibriert, danach mit der jeweiligen Aktivierungs- bzw. Referenzlösung inkubiert und anschließend mit Puffer gespült.

Für die Enzymreferenz von 56 Units TEV Protease konnte während der Inkubationsphase eine Frequenzänderung von − 3 Hz verzeichnet werden. Die verminderte Oberflächenhaftung – verglichen mit der zuvor durchgeführten Referenzmessung des aktivierten Unimeres S4-PEG unter Verwendung einer geringeren Konzentration von 28 Units Enzym (vgl. Kapitel 3.1.3.1 Seite 42) – konnte durch die Verwendung der neuen Enzymcharge erklärt werden.^[267] Auch wenn eine saubere Präparation eines rekombinant exprimierten Enzyms ohne nachweisbare Mengen anderer, kontaminierender Proteine vorliegt, enthält diese sowohl aktives als auch inaktives Protein.^[325] Folglich kann der Anteil an aktiver Enzymspezies einer Charge gemessen an der Gesamtproteinmenge variieren. Deshalb wird die spezifische Aktivität für jede Enzym-präparation neu ermittelt und ist somit nur auf den Anteil an katalytisch aktivem Protein geeicht.^[278] Die proteolytische wirksame Konzentration der für Prozessierung des Dimer-Substrates (S7)2K-PEG verwendeten Enzymcharge wurde durch den Hersteller Roboklon auf 10 Units∙μL⁻¹ bestimmt. Diese war damit zweifach so hoch konzentriert wie die zuvor eingesetzte Präparation mit 5 Units∙μL⁻¹. Folglich beinhaltete erstere einen deutlich geringeren Anteil an inaktivem Protein. Dadurch konnte die unspezifische Oberflächenhaftung der viralen Cysteinprotease entscheidend reduziert werden, obwohl eine höhere Enzymkonzentration für die Substratumsetzung eingesetzt wurde. Dies konnte an Hand von Kreuzexperimenten unter Verwendung der jeweils anderen Enzymcharge belegt werden (vgl. Kapitel 5.7.10 Seite 162).

Die Adsorptionsmessungen wurden unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität und den entsprechenden Aktivierungskonzentrationen durchgeführt.

Darüber hinaus konnte die Effektivität der enzymatisch erzeugten Beschichtung dem Adsorp-tionsverhalten des reinen Biokonjugates (G-TBP)2K-PEG^CHEM sowie einer artifiziellen Referenz REF2^CHEM [79 %] gegenüber gestellt werden (vgl. Abbildung 3.22). Dabei bewirkte die Inkuba-tion des synthetischen Binders (G-TBP)²K-PEG^CHEM eine leicht erhöhte Frequenzverschiebung von − 44 Hz innerhalb von 90 Minuten verglichen mit der des enzymatisch aktivierten Biokon-jugates (S7)²K-PEG von − 39 Hz.

Abbildung 3.22. Adsorptions- und Desorptionsisothermen des synthetischen Dimer-Binders (G-TBP)²K-PEG^CHEM und der artifiziellen Referenz REF2^CHEM [79 %] entsprechend des ermittelten Substratumsatzes von 79 % bestehend aus den synthetischen Analoga (G-TBP)²K-PEG^CHEM und IF7^CHEM sowie dem verbleibenden Edukt (S7)²K-PEG. Der Binder (G-TBP)²K-PEG^CHEM und die artifiziellen Referenz REF2^CHEM [79 %] wurden mit Protease-Puffer behandelt und nach einer Verdünnung von 1:17 (v/v) in 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) vermessen. Bedingungen: Die titanbeschichteten Sensoren wurden mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.0) äquilibriert, danach mit der jeweiligen Referenzlösung inkubiert und anschließend mit Puffer gespült.

Die Referenz REF2^CHEM [79 %] setzte sich aus den synthetischen Analoga des adhäsiven Dimer-Binders (G-TBP)2K-PEG^CHEM und der Suppressionsdomäne IF7^CHEM sowie dem verbleibenden Substrat (S7)²K-PEG zusammen. Im Vergleich zu (G-TBP)²K-PEG^CHEM erzielte REF2^CHEM [79 %]

eine nahezu identische Massenanlagerung wie das aktivierte (S7)²K-PEG gemessen an der Frequenzänderung von − 40 Hz während der Inkubationsphase. Hinsichtlich der Bindungs-kinetiken der synthetischen Referenzen konnten im Vergleich zum aktivierten Dimer-Substrat (S7)2K-PEG leichte Unterschiede verzeichnet werden. Entsprechend der Frequenzverschie-bungen nach 3 Minuten Inkubation konnten (G-TBP)²K-PEG^CHEM und REF2^CHEM [79 %] zu etwa 73 % bzw. 82 % an der Oberfläche angereichert werden. Da beide Referenzlösungen kein Enzym enthielten, wurde für die enzymatisch erzeugte Beschichtung haftungsverstärkende Effekte durch die Coadsorption^[288] des Biokonjugates (G-TBP)²K-PEG^ENZ und der TEV Protease vermutet. Auch wenn die Cysteinprotease eine vergleichsweise geringe Oberflächenaffinität aufwies, könnten dennoch geringe Mengen des katalytisch aktiven Proteins das Adsorptions-verhalten des divalenten Binders beeinflussen und in die Beschichtung eingelagert werden.

Eine Analyse der viskoelastischen Eigenschaften der gebildeten Beschichtungen an Hand der Auftragung der Dissipationsänderungen gegenüber den Frequenzverschiebungen sollte zur Aufklärung des beschriebenen Aspektes beitragen. In Abbildung 3.23 sind die entsprechenden Graphen für die Inkubationsphase der QCM-D-Messungen des enzymatisch aktivierten Substrates (S7)²K-PEG und des synthetischen Dimer-Binders (G-TBP)²K-PEG^CHEM sowie der artifiziellen Referenz REF2^CHEM [79 %] dargestellt.

Abbildung 3.23. Auftragung der Dissipationsänderungen gegenüber den Frequenzverschiebungen zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften der Beschichtungen des enzymatisch aktivierten (S7)2K-PEG und des synthe-tischen Dimer-Binders (G-TBP)2K-PEG^CHEM sowie der artifiziellen Referenz REF2^CHEM [79 %] im Vergleich zu den Verhältnissen ΔD/Δf des nicht-aktivierten (S7)2K-PEG und der TEV Protease [56 Units].

Sowohl für die Beschichtungen von (G-TBP)²K-PEG^CHEM als auch von REF2^CHEM [79 %] konnte ein hyperbolischer Zusammenhang zwischen den Dämpfungseigenschaften und der Massen-adsorption festgestellt werden. Dabei bewirkte die initiale Haftung der Referenzen zunächst einen ähnlichen Anstieg der Dissipationen auf Werte um 2.8∙10^–6 bzw. 2.6∙10^–6, welche im Bereich der maximalen Frequenzänderungen geringfügig abnahmen. Die leicht verminderten Viskoelastizitäten der Beschichtungen mit zunehmenden Massenanlagerungen könnten durch eine verringerte Beweglichkeit der gebundenen Biomakromoleküle auf der Sensoroberfläche zu erklären sein.[289, 293, 294] Die Adsorption des enzymatisch aktivierten Substrates (S7)²K-PEG

dagegen führte zu einem deutlich flacheren Anstieg des Verhältnisses ΔD/Δf und einer gerin-geren Dissipationsänderung im Bereich von 2.0∙10^–6. Dies deutete darauf hin, dass verglichen mit den Beschichtungen der synthetischen Systeme (G-TBP)²K-PEG^CHEM und REF2^CHEM [79 %]

ein weniger viskoelastischer Film auf der Metalloxid-Oberfläche gebildet wurde.^{[291, 292]} Vermut-lich veränderten die Coadsorption^[288] der höhermolekularen TEV Protease die Dämpfungs-eigenschaften der Beschichtung. Darüber hinaus konnte an Hand der Auftragung von ΔD gegenüber Δf keine Verdrängung des adsorbierten Peptid-PEG-Konjugates (G-TBP)2K-PEG^ENZ durch das virale Enzym nachgewiesen werden. Sowohl für die Adsorption des nicht-aktivierten Dimeres (S7)²K-PEG als auch der TEV Protease [56 Units] ergab sich eine lineare Abhängigkeit des Verhältnisses von ΔD/Δf (vgl. Abbildung 3.23). Aufgrund der deutlich geringeren Dissipationsänderungen im Bereich von 1.3∙10^–6 bzw. 0.7∙10^–6 bewirkten die Massenanlage-rungen der beiden Referenzen die Ausbildung rigiderer Filme.

Neben der Beschreibung des Adsorptionsverhaltens an Hand der Frequenzänderungen und der Charakterisierung der viskoelastischen Eigenschaften der gebildeten Beschichtungen durch die Auftragung von ΔD gegenüber Δf konnten die Materialanreicherungen auf Titandioxid-Oberflächen quantitativ erfasst werden. Zur Bestimmung der adsorbierten Massen wurden die Beschichtungen des enzymatisch aktivierten Dimer-Substrates und der entsprechenden Aktivie-rungsreferenzen durch die physikalischen Modelle von SAUERBREY und VOIGT interpretiert.