Experimentelle Untersuchungen zum assistierten Zonaschlupf im Rahmen des kommerziellen Embryonentransfers beim Rind

(1)

Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover

___________________________________________________________________

Experimentelle Untersuchungen zum assistierten Zonaschlupf im Rahmen des kommerziellen

Embryotransfers beim Rind

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Michael Rüther aus Büren in Westfalen

Hannover 2005

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. S. Meinecke-Tillmann

1. Gutachterin : Prof. Dr. Meinecke-Tillmann

2. Gutacher : Prof. Dr. Rath

Tag der mündlichen Prüfung: 01. Juni 2005

(3)

Sandra und meinen Eltern

(4)

(5)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung... 9

2 Literaturübersicht... 10

2.1 Zona pellucida... 10

2.1.1 Struktur und Funktion... 11

2.1.2 Natürlicher Blastozystenschlupf ... 15

2.1.3 Einflüsse der Kultivierung auf die Zona pellucida... 16

2.1.4 Einflüsse der Kryokonservierung auf die Zona pellucida... 18

2.2 Eingriffe an der Zona pellucida... 19

2.2.1 Behandlung mit saurer Tyrodelösung ... 19

2.2.2 Behandlung mit Pronaselösung ... 22

2.2.3 Mikrochirurgie... 25

2.2.3.1 Mechanische Eingriffe... 25

2.2.3.2 Lasereingriffe ... 29

2.2.3.3 Laser-assistierter Blastozystenschlupf ... 30

3 Eigene Untersuchungen ... 33

3.1 Material und Methoden... 33

3.1.1 Embryonenspender... 33

3.1.2 Embryonenempfänger... 34

3.1.3 Brunstsynchronisation... 34

3.1.4 Superovulation ... 35

3.1.5 Spül-, Aufbewahrungs-, Manipulations- und Kryokonservierungsmedien ... 38

3.1.6 Embryogewinnung ... 39

3.1.7 Embryobeurteilung ... 41

3.1.8 Kryokonservierung ... 42

3.1.9 Auftauen von Embryonen... 43

3.1.10 Embryonenmikrochirurgie ... 44

(6)

3.1.10.1 Mikromanipulatoren ... 44

3.1.10.2 Mikroinstrumente ... 45

3.1.11 Partielle Zonadissektion ... 45

3.1.12 Embryonentransfer... 48

3.1.13 Photographische Dokumentation der Embryonen... 50

3.1.14 Digitale Bildanalyse... 50

3.1.15 Erfassung der ET-Ergebnisse ... 51

3.1.16 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaues und der Datenerfassung ... 52

3.2 Statistik... 55

4 Ergebnisse ... 56

4.1 Geborene Kälber nach Embryonentransfer... 56

4.1.1 Einfluss der Embryonenqualität auf die Kalberate... 60

4.1.2 Kalbungen nach Transfer frisch gewonnener Embryonen ... 62

4.1.3 Kalbungen nach Transfer kryokonservierter Embryonen ... 65

4.1.4 Einfluss des embryonalen Entwicklungsstadiums auf die Kalbeergebnisse... 69

4.1.4.1 Einfluss der partiellen Zonadissektion im Entwicklungsstadium einer Morulae auf die Abkalbungsrate ... 72

4.1.4.2 Einfluss der partiellen Zonadissektion im Entwicklungsstadium einer frühen Blastozyste auf die Abkalbungsrate ... 73

4.1.4.3 Einfluss der partiellen Zonadissektion im Entwicklungsstadium einer Blastozyste auf die Abkalbungsrate ... 75

4.1.5 Geschlechtsverteilung der geborenen Kälber ... 79

4.2 Weitere Einflussfaktoren auf den Erfolg des Embryonentransfers ... 80

4.2.1 Operateur... 80

4.2.2 Jahreszeit... 80

4.2.3 Embryonenspender... 81

4.2.3.1 Alter ... 81

4.2.3.2 Rasse... 82

(7)

4.2.4 Embryonenempfänger... 82

4.2.4.1 Alter ... 82

4.2.4.2 Rasse... 83

4.2.4.3 Zyklussynchronisation... 83

4.2.4.4 Transfer in das rechte oder linke Uterushorn ... 84

4.2.4.5 Zyklustag/embryonales Entwicklungsstadium... 84

4.3 Messungen an der Zona pellucida und den Embryonen ... 85

4.3.1 Zonadicke ... 85

4.3.1.1 Entwicklungsstadien/Kalbungen ... 86

4.3.2 Embryonendurchmesser ... 87

4.3.3 Eigentlicher Embryonendurchmesser ... 88

5 Diskussion ... 90

5.1 Embryonentransfer... 90

5.2 Partielle Zonadissektion ... 92

5.3 Einfluss weiterer Parameter auf den Embryonentransfer ... 96

5.4 Messungen der Zonadicke und der Embryonendurchmesser ...100

5.5 Einsatzmöglichkeiten der partiellen Zonadissektion und Ausblicke...101

6 Zusammenfassung...102

7 Summary ...106

8 Schrifttumsverzeichnis...110

9 Anhang ...150

9.1 Tabellenanhang ...150

9.2 Tabellenverzeichnis...163

9.3 Abbildungsverzeichnis...166

(8)

Verzeichnis der Abkürzungen

Abb. = Abbildungen

AH = assistierter Zonaschlupf

ArF = Argon Fluorid

BSE = Bovine Spongiforme Encephalopathie

bzw. = beziehungsweise

D = Tag

eCG = equines Choriongonadotropin Er:YAG = Erbium:Yttrium Aluminium Garnet

ET = Embryonentransfer

et al. = et alii (und andere)

F1 = erste Generation nach einer Kreuzung zweier Rassen f. Blastozyste = frühe Blastozyste

FSH = Follikel stimulierendes Hormon

Ho:YSGG = Holmium:Yttrium Scandium Gallium Garnet IVF = In-vitro-Fertilisation

K = Kontrollgruppe

KrF = Krypton Fluorid

PBS = Phosphat gepufferte Salzlösung

Tab. = Tabelle

u. a. = unter anderem

V = Versuchsgruppe

XeCL = Xenon Chlorid

XeF = Xenon Fluorid

Z.p. = Zona pellucida

ZpA bis C = Zona pellucida Protein A, B bzw. C (1, 2 bzw. 3)

(9)

1 Einleitung

Der Embryotransfer (ET) wird seit den 1970er Jahren routinemäßig in der Rinder- zucht durchgeführt, doch wurde in jüngerer Zeit eine sinkende Nachfrage von Seiten der Züchter verzeichnet, die auf die Entwicklung in der Landwirtschaft (u.a. Preisver- fall, BSE-Problematik) oder das Verbot der Nutzung von FSH-Präparaten zurückzu- führen war.

Die Wirtschaftlichkeit des ET steigt mit verbesserten Embryogewinnungs- und Trans- ferergebnissen. Es gibt deshalb Bemühungen, einerseits den Superovulationserfolg und die Befruchtungsrate zu erhöhen, auf der anderen Seite wird daran gedacht, die Implantationsrate positiv zu beeinflussen.

Eine wesentliche Voraussetzung für die erfolgreiche Kontaktaufnahme des Embryos mit dem mütterlichen Endometrium und die Etablierung der Gravidität ist das recht- zeitige Verlassen der Zona pellucida und die so ermöglichte Elongation der Blastozy- ste, die bei den Wiederkäuern und dem Schwein für die Signalübermittlung zwischen Muttertier und Frucht erforderlich ist.

Um diesen Zonaschlupf positiv zu beeinflussen, wird insbesondere in der Humanme- dizin im IVF-Bereich der assistierte Zonaschlupf („assisted hatching“, AH) beziehungsweise die partielle Zonadissektion beim Embryo durchgeführt. Es wurden va- riable Ergebnisse und nur wenige kontrollierte Studien publiziert. Der assistierte Zo- naschlupf erfolgte hier durch einfache mechanische oder enzymatische Eingriffe an der Zona pellucida oder durch Laserbehandlung, wobei die erzeugten kleinen Lö- cher, größeren Öffnungen oder die partielle Verdünnung der Zona pellucida es dem Embryo erleichtern sollten, die Zona problemlos zu verlassen.

Bei Tieren existieren dagegen bisher nur einige Berichte, die sich auf Maus und Rind beschränken.

Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, in einer kontrollierten Studie unter kommerziellen Bedingungen und unter Berücksichtigung verschiedener Einflussfaktoren zu analysieren, ob sich mittels eines assistierten Zonaschlupfes beim Rinderembryo die ET-Ergebnisse effizient verbessern lassen.

(10)

2 Literaturübersicht

2.1 Zona pellucida

Die Zona pellucida ist die so genannte sekundäre Hülle der Oozyte und des daraus entstehenden Embryos. Bis heute ist ihr Entstehungsort nicht für alle Säugetiere ge- nau geklärt. GREVE et al. (1982), WASSARMAN (1988), EL-MESTRAH et al. (2002) und ZENG und SCHULTZ (2003) wiesen die Synthese der murinen Zona pellucida der Oozyte zu. Auch die Bildung der Zona pellucida von Primaten und Menschen soll durch die Oozyte erfolgen (EBERSPAECHER et al. 2001), während JEWGENOW und FICKEL (1999) für die Katze und BLACKMORE et al. (2004) für den Hund eine Beteiligung der Follikelzellen an der Synthese nachwiesen. Auch für das Rind konnten WICHE (1994) und HINSCH et al. (2003) zeigen, dass Fragmente der Zona pellucida in der Oozyte und in den Follikelzellen vorhanden sind. Diese ließen auch hier auf eine Synthese der Zona pellucida durch die Follikelzellen und die Oozyte schlie- ßen. KOLLE et al. (1998) bestätigten dies für das bovine Zp3-Protein und konnten zeigen, dass die Synthese des Proteins bis zur Befruchtung der Oozyte abgeschlos- sen ist (Spezies-Übersicht: WOLGEMUTH et al. 1984, DUNBAR et al. 2000).

Beim Rind konnten die ersten zusammenhängenden Zonafragmente zum Zeitpunkt des Primärfollikels zwischen Follikelzellen und Eizelle nachgewiesen werden, wobei es gelang, schon in der Phase des Primordialfollikels Zonamaterial in den Zellen nachzuweisen (WICHE 1994, KOLLE et al. 1998). Dies stimmt mit den Ergebnissen von GREVE et al. (1982) und WASSSARMAN (1988) überein, da auch sie Anzei- chen für die Bildung der Glykoproteine der Zona pellucida schon in der frühen Ooge- nese erhielten. Des weiteren stellten GREVE et al. (1982) und WASSSARMAN (1988) mittels unterschiedlicher Verfahren fest, dass die Vorläufer dieser Glykopro- teine eine Syntheseleistung des rauen endoplasmatischen Retikulums und des Gol- gi-Apparates der Oozyte sowie von Follikelzellen sind (Übersichten: DIETL 1986, HERRLER und BEIER 2000). GREVE et al. (1982) und WASSARMAN (1988) gehen weiter davon aus, dass sie als so genannte Golgi-Vesikel ausgeschleust werden,

(11)

sich dann im extrazellulären Raum zwischen Follikelzellen und Oozyte zusammenla- gern und so die Zona pellucida bilden.

Damit steht die Entwicklung der Zona pellucida von Säugetieren im Gegensatz zu denen der niederen Vertebraten, bei denen die Hülle um die Eizelle ausschließlich von den Follikelzellen oder den Helferzellen gebildet wird (WASSARMAN 1988, Übersicht: BLEIL et al. 1981, HERRLER und BEIER 2000).

2.1.1 Struktur und Funktion

Die Zona pellucida stellt sich bei den meisten Säugetieren als eine im Lichtmikroskop amorphe azelluläre Matrix dar (Übersichten: WASSARMAN und MORTILLO 1991, PRASAD et al. 2000).

Im Elektronenmikroskop zeigt sich die Zona pellucida der meisten Säugetieren als eine aus Fibrillen fadenartig zusammengefügte Struktur, die sich allerdings mit der Entwicklung von der Oozyte bis zum Embryo verändert (WASSARMAN 1988, WASSARMAN u. MORTILLO 1991, RIDDELL et al. 1993, STEYER 1994, VANROOSE et al. 2000).

Die Zona pellucida ist am besten bei der Maus erforscht. Man hat aber in den meisten vergleichenden Studien sehr ähnliche Ergebnisse bei anderen Säugetieren er- halten (Übersicht: PRASAD et al. 2000, DENKER 2000, HERRLER et al. 2002). Die Zona besteht aus Glykoproteinen, die in drei verschiedene Proteinfamilien (ZPA bis C) unterteilt werden können (BLEIL et al. 1981, NOGUCHI et al. 1994, BERCEGEAY et al. 1995, RANKIN et al. 1999, GUPTA et al. 2004). Die Proteinstruktur, die Amino- säuresequenzen, das Molekulargewicht und einige weitere Parameter wurden für alle drei Proteinfamilien (ZPA bis C) bei den verschiedenen Säugetieren bereits untersucht (Maus: BLEIL et al. 1981, Rind: FLORMAN u. FIRST 1988, TOPPER et al.

1997, YONEZAWA et al. 2001, Übersicht: PRASAD et al. 2000).

Das bisher am besten erforschte Glykoprotein ist das ZP3-Molekül. Seine Hauptauf- gabe ist es, als ein Rezeptor für die speziesspezifische Spermienbindung an der Zo-

(12)

na pellucida zu wirken (BURKS et al. 1995, TOPPER et al. 1997). Zudem soll es als Rezeptormolekül an der Auslösung der Akrosomreaktion beteiligt sein (WASSARMAN und MORTILLO 1991, BURKS et al. 1995, TOPPER et al. 1997, HANNA et al. 2004).

Durch Veränderungen des ZP2-Proteins soll der Polyspermieblock ausgelöst werden, um eine polysperme Befruchtung zu verhindern. Bei dieser so genannten Zona- Reaktion wird die Zona pellucida ganz oder teilweise modifiziert, so dass Spermien sie nicht mehr penetrieren können (MOLLER und WASSARMAN 1988, WASSARMAN 1988, HINSCH et al. 2003).

Über das größte Glykoprotein (ZP1) wird im internationalen Schrifttum berichtet, dass es als strukturelle Verbindung dient und dass ohne dieses Protein keine einheitliche Struktur der Zona pellucida möglich sei (GREVE et al. 1982, WASSSARMAN 1988, RANKIN et al. 1999, IKEDA et al. 2002). Dies wird mit den von dem ZP-1 ausgebilde- ten Disulfidbrücken, die bei der Maus nachgewiesen wurden, erklärt (HINSCH et al.

1999). Beim Rind (TOPPER et al. 1997, YONEZAWA et al. 2001) wie auch beim Schwein (NOGUCHI et al. 1994) kann zudem von zwei Komponenten der ZP1- Protein-Famlie ausgegangen werden. Eine Beteiligung der ZP1-Protein-Familie an der Spermienbindung an die Zona pellucida wird des weiteren diskutiert (IWAMOTO et al. 1999, RANKIN et al. 1999, SKINNER et al. 1999).

Die Funktionen der Zona pellucida sind ebenso komplex wie vielfältig.

Direkt nach ihrer Entstehung übernimmt sie die Rolle einer zusätzlichen Membran zwischen Follikelzellen und der nicht ovulierten Oozyte, die es verschiedenen Mole- külen nicht mehr erlaubt, zu passieren (WOLGEMUTH et al. 1984, Übersicht:

HERRLER und BEIER 2000).

Nach der Ovulation dient sie als eine natürliche Barriere, die es der Eizelle ermög- licht, das entstandene Mikromilieu aufrecht zu halten (SUDIK et al. 1989). Hierfür spricht auch die Beobachtung von FLEMING et al. (1987). Sie zeigten unter In-vitro- Kultivierungsbedingungen, dass Mäuseembryonen, bei denen die Zona pellucida entfernt wurde, stärker auf suboptimale Medien reagierten und dabei eine verzögerte Entwicklung im Vergleich zu Embryonen mit intakter Zona eintrat.

(13)

Die Angaben, in welchem Größenbereich Moleküle die Zona passieren können, sind unterschiedlich und von der Spezies sowie dem Entwicklungsstadium der Oozyte abhängig (VANROOSE et al. 2000). WASSARMAN (1988) beschrieb, dass Enzyme, Glykoproteine und Immunglobuline die murine Zona durchdringen können.

VANROOSE et al. (1998), BIELANSKI et al. (2001) und WALDROP et al. (2004) erhielten keine Anhaltspunkte für die Übertragung und/oder die Infektion von Embryo- nen mit Viren bei intakter Zona pellucida, obwohl sie eine Anhaftung der Viren nur durch Waschen mit Trypsin aufheben konnten (Übersicht: GUERIN et al. 1997). Die Ergebnisse der elektronenmikroskopischen Untersuchungen von RIDDELL et al.

(1993), STEYER (1994) und VANROOSE et al. (2000) zeigten allerdings, dass die Poren in der bovinen Zona pellucida in ihrer Größe variieren und diese auch vom Entwicklungsstadium der Oozyte/des Embryos abhängig sind. Der Durchmesser ist aber nach ihren Erkenntnissen immer deutlich kleiner als 1 µm.

Wichtig scheint nach derzeitigen Erkenntnissen die Ablagerung verschiedener Pro- teine, die vom Ovidukt oder dem Uterus gebildet werden, im perivitellinen Raum zu sein, nachdem sie die porzine, bovine oder equine Zona pellucida durchdrungen haben. Diese Proteine sollen sowohl die Spermienbindung als auch die Penetration der Spermien beeinflussen (BUHI et al. 2000, DENKER 2000, Übersicht: HERRLER et al. 2000, 2002).

Während der Befruchtung der Eizelle ist die Zona pellucida für die speziesspezifische Spermienbindung, die Akrosomreaktion und den Polyspermieblock mit verantwortlich (TOPPER et al. 1997, HINSCH et al. 2003, SINOWATZ et al. 2003, LINDSAY und HEDRICK 2004)

Eine nicht zu vernachlässigende Funktion der Zona pellucida ist der Schutz der Ei- zelle bis zur Blastozyste während ihrer Wanderung vom Ovar über den Eileiter zur Gebärmutter (CHANGHUN et al. 2002, Übersicht: LETTERIE 1997).

Des weiteren wird der immunologische Schutz der Eizelle und des Embryos vor dem Muttertier beschrieben (PATANKAR et al. 1997, KAEOKET et al. 2002, Übersicht:

DENKER 2000). Allerdings sind aber auch autoimmune Reaktionen der Mutter gegen die Zonaproteine bekannt (KAMADA et al. 1992 und PATANKAR et al. 1997).

(14)

Die Autoren SUN et al. (1999), PATERSON et al. (2000) und GORMAN et al. (2002) nutzten diese Erkenntnisse und konnten durch eine Immunisierung von Muttertieren gegen die einzelnen Zonaproteine ein Ausbleiben der Befruchtung von Eizellen erreichen. Allerdings gelang es bis jetzt nur unzureichend, auf diese Weise Schwan- gerschaften/Trächtigkeiten zu verhüten (LOU et al. 1996, Übersicht: DUNKBAR et al.

2001).

Somit bietet die Zona pellucida einen mechanischen Schutz zur Erhaltung des Zell- verbandes, in vitro einen Schutz vor Einflüssen der Kultivierung sowie einen immuno- logischen Schutz von Eizelle/Embryos vor der körpereigenen Abwehr des Muttertie- res.

Zudem scheinen die verschiedenen Proteine der Umgebung aus Eileiter und Uterus die Zona pellucida kontinuierlich für die gerade zu bewältigenden Aufgaben neu zu strukturieren oder sie in ihrer Funktion zu unterstützen (BUHI et al. 2000, O'DAY- BOWMAN et al. 2002).

(15)

2.1.2 Natürlicher Blastozystenschlupf

Nachdem der Embryo das Stadium der expandierten Blastozyste erreicht hat, ist der Raum, den die Zona pellucida umschließt, für das weitere Wachsen des Embryos hinderlich und der Embryo verlässt die Zona pellucida (DE VOS und VAN STEIRTEGHEM 2000, Übersicht: GOLFF 2002).

Dies geschieht bei den einzelnen Spezies auf unterschiedliche Weise.

Die Zona pellucida von Mäuse- und Kaninchenembryonen soll enzymatisch aufgelöst werden, ein rein mechanischer Zonaschlupf gilt bei diesen Tierarten als artifizielle Erscheinung in vitro kultivierter Embryonen. Das Enzym Strypsin, welches vom Em- bryo und den Uterusdrüsen gebildet wird, soll für den Blastozystenschlupf verantwortlich sein (FISCHER et al. 1991, SCHIEWE et al. 1995b, LEE et al. 1997, O´SULLIVAN et al. 2002).

Beim Rind konnten dagegen keine lytischen Enzyme nachgewiesen werden. Hier wird davon ausgegangen, dass durch den aufgebauten Druck der Zellen der wach- senden Blastozyste (Expansion/Kollabieren) zuerst ein Verdünnen (COATES und MENIO 1994, SCHMOLL et al. 2003) und dann ein Aufbrechen der Zona pellucida in vivo bis Tag 9 nach Befruchtung (MADDOX-HYTTEL et al. 2003) erreicht wird.

Dieser Blastozystenschlupf erfolgt beim Rind und Schwein nach ungefähr der Hälfte der Lebensspanne vor der Implantation, während beim Kaninchen, der Maus und dem Menschen dieses implantationsnah geschieht (BETTERIDGE 1995).

Bei Kaninchen und Pferd bilden sich zusätzlich zu der Zona pellucida akzessorische Proteinhüllen aus, die vom Ovidukt bzw. dem Uterus gebildet werden. Diese so genannte Neozona ist selektiv permeabel für verschiedene Botenstoffe von Uterus und Embryo (BETTERIDGE und FLECHON 1988, DENKER 2000).

(16)

2.1.3 Einflüsse der Kultivierung auf die Zona pellucida

Die mit den verschiedenen Funktionen der Zona pellucida einhergehende Verände- rung ihrer Proteine ist bekannt (MOLLER und WASSARMAN 1989, CANNON und MENINO 1998, IWAMOTO et al. 1999, DENKER 2000, SUN et al. 2003, LINDSAY und HEDRICK 2004). Aber auch die Probleme einer ungewollten Veränderung der Zona pellucida und der Eizelle durch die Kultivierung in vitro werden diskutiert (DUCIBELLA et al. 1995, DE MEESTERE et al. 1997, VANSTEENBRUGGE et al.

1997, LANDIM-ALVARENGA et al. 2002, COY et al. 2005). Aufgrund der im Kultur- medium enthaltenen Proteine, die sich von denen im Ovidukt in vivo unterscheiden (GONZALES et al. 2001, O`DAY-BOWMAN et al. 2002), kann der physiologische Umbau der Zona pellucida beeinflusst werden (WEGNER u. KILLIAN 1991, BUHI et al. 2000).

Zudem ist ein Kultivierungsmedium ohne jeglichen Proteinzusatz in der Lage, den Prozess des so genannten „Zona hardening“, eine Veränderung im Proteinaufbau der Zona, die einen natürlichen Blastozystenschlupf behindert, in jedem Fall zu be- schleunigen und einen natürlichen Blastozystenschlupf (in vitro) bei der Maus signifikant negativ zu beeinflussen (ALIKANI et al. 1994, COHEN et al. 1992). Des weiteren ist bekannt, dass die Temperatur und die Ionen des vorhandenen Mediums in vitro ebenfalls diese Veränderung der Zona pellucida hervorrufen können (WASSARMAN und MORTILLO 1991). Andererseits scheint BSA als makromolekularer Zusatz zum Medium die Beschleunigung des natürlichen „Zona hardening“ bei in vitro produzierten Rinderembryonen nicht zu beeinflussen. Außerdem konnte durch Zugabe von Fetuin in das Medium dieser positive Effekt verstärkt werden (LANDIM-ALVARENGA et al. 2002).

Auch Prozeduren wie das Entfernen der Kumuluszellen wurden als potentiales Risi- ko genannt, wodurch das natürliche „Zona hardening“ zu schnell vorangetrieben und der Blastozystenschlupf behindert wird. TANGHE et al. (2003) beschrieben den positiven Effekt auf das Verlangsamen des „Zona hardening“ durch die Anwesenheit der Kumuluszellen bei der Befruchtung und gingen davon aus, dass die Sekretion der

(17)

Kumuluszellen und die Wechselwirkung mit den Spermien bei der In-vitro- Befruchtung ausschlaggebend waren.

KATSKA et al. (1999) erklärten den Zeitpunkt des Entfernens der Kumuluszellen bei Rinderembryonen als verantwortlich für das „Zona hardening“ und nicht das verwandte Medium. Dieser Befund steht im Gegensatz zu den Versuchen bei Mäuse- embryonen, bei denen man von einem „Zona hardening“ durch das Medium ausge- hen kann. Allerdings konnten De MEESTERE et al. (1997) zeigen, dass eine Beein- flussung des „Zona hardening“ durch das Medium bei der Maus nicht für alle Ent- wicklungsstadien zutraf.

YUAN et al. (2003) beschrieben, dass eine 2 - 5 %ige Sauerstoffatmosphäre wäh- rend der In-vitro-Kultivierung von Rinderoozyten bis hin zu transfertauglichen Em- bryonen einen positiven Einfluss auf die Schlupfergebnisse hatte.

Aber nicht nur die Struktur der Zona pellucida kann durch die verschiedenen Kultur- medien beeinflusst werden, sondern auch ihre Funktion. So konnten SINOWATZ et al. (2003) zeigen, dass die bovine Zona pellucida in vitro eine Akrosomreaktion bei porcinen Spermien auslöst und eine Bindung von equinen Spermien möglich ist. Bei dem Vergleich von Oozyten, die zu verschiedenen Zeitpunkten ihrer Reifung in verschiedenen in vitro Medien befruchtet wurden, und in vivo gereiften und befruchteten Embryonen konnten RIZOS et al. (2002) allerdings nur Unterschiede in der Entwick- lung bis zur Blastozyste bei Oozyten zeigen, die nach dem LH-Anstieg im Blut des Rindes gewonnen wurden, jedoch nicht bei den unterschiedlichen Kultivierungsver- fahren, so dass sie auf eine untergeordnete Rolle des Mediums in Zusammenhang mit einer Beeinflussung des Embryos und/oder der Zona pellucida schlossen.

(18)

2.1.4 Einflüsse der Kryokonservierung auf die Zona pellucida

Dass die verschiedenen Kryokonservierungsverfahren die Erfolgsrate des Embryo- transfers negativ beeinflussen können, ist bekannt (LEHN-JENSEN und RALL 1982), wobei man überwiegend davon ausging, dass die embryonalen Zellen selbst beein- trächtigt werden (SHAMSUDDIN et al. 1994, NEMATOLLAHI und VALOJERDI 1999, Übersicht: LEIBO und LOSKUTOFF 1993). LEHN-JENSEN und RALL (1982) zeigten, dass es so genannte „Zonabrüche“ beim Einfrieren gibt. Dies sind Beschädigun- gen der Zona pellucida, die durch den Gefrierprozess hervorgerufen werden und einen erfolgreichen Embryotransfer teilweise verhindern können. Zudem konnte das natürliche „Zona hardening“ durch die eigentliche Kryokonservierung beeinflusst werden (KARRAN und LEGGE 1996, MATSON et al. 1997). Aber auch die Zeit zwischen der Embryonengewinnung und dem Tiefgefrieren der Embryonen kann die Entwicklung bis zur geschlüpften Blastozyste nach dem Auftauen in vitro bei in vivo gewonnen Rinderembryonen signifikant negativ beeinflussen (JOUSAN et al. 2004).

Ob allerdings die Zeit zwischen der Gewinnung und der Kryokonservierung sich negativ auf die Zellen der Embryonen oder die Zona pellucida auswirkt, wurde von ihnen nicht geklärt.

Die Erfolgsrate von IVF-Rinderembryonen, die nach dem Tiefgefrieren einem assistierten Zonaschlupf unterzogen wurden, war in bezug auf die weitere Entwicklung signifikant besser (VATJA et al. 1997). Dies berichteten bereits TUCKER et al. (1991) für humane Embryonen und sie folgerten aus ihren Untersuchungen, dass das Phä- nomen des „Zona hardening“ auch durch die Kryokonservierung entstehen kann und einen großen Einfluss auf die Erfolgsrate des Embryonentransfers hat.

(19)

2.2 Eingriffe an der Zona pellucida

Im Rahmen der dem Embryonentransfer assoziierten Biotechnologien wurde die Zo- na pellucida mittels der unterschiedlichsten Verfahren manipuliert, so sind zum Bei- spiel Spermieninjektionen in die Oozyte durchgeführt, Zellen aus dem Furchungssta- dium oder der Blastozyste entnommen bzw. in diese übertragen, Embryonen geteilt oder Vesikel sowie dem Embryo nicht mehr zugehörige Zellen entfernt worden. Man konnte zeigen, dass verschiedene Techniken möglich sind, um die verschiedenen Eingriffe an der Zona pellucida zu erreichen, die jedoch mit Risiken für die weitere Entwicklung der Embryonen behaftet sind (Übersichten: BREM 1986, ALIKANI und COHEN 1992, VEIGA und BOISO 2000, LETTERIE 1997, DE VOS und VAN STEIRTEGHEM 2000)

2.2.1 Behandlung mit saurer Tyrodelösung

Ursprünglich wurde die Lösung von TYRODE (1910) zur Gewebekultur und -konservierung entwickelt. Dass diese Lösung angesäuert (pH < 3) auch die Glyko- proteine der Zona pellucida auf chemische Weise auflöst, wurde von JOHNSON et al. (1990) genutzt, wobei sie durch die saure Tyrodelösung eine Aktivierung von humanen sowie murinen Oozyten auslösten: Obwohl ein Spermium fehlte, begannen die Oozyten mit den Furchungen.

Dieses Phänomen konnten LAI et al. (1994) nicht beobachten. Die von ihnen verwendeten kryokonservierten murinen Oozyten, bei denen nach dem Auftauen die Zona pellucida mittels saurer Tyrode entfernt wurde, waren in der Weiterentwick- lungsrate gegenüber den Embryonen der Kontrollgruppe mit unbehandelter Zona pellucida im Vorteil. Die höchste Weiterentwicklungsrate erhielten sie allerdings, wenn die Zona-Entfernung mechanisch erfolgte.

CHATZIMELETIOU et al. (2001), die die Lebensfähigkeit von Blastomeren bei Mäu- seembryonen nach der Zonaentfernung mittels saurer Tyrode untersuchten, be-

(20)

stätigten eine signifikant verlangsamte weitere Entwicklung durch die Behandlung mit saurer Tyrode gegenüber einer Laserbehandlung, wobei sie aber eine Schädigung von Blastomeren nicht beobachten konnten.

Dem gegenüber stehen die Beobachtungen von JI und BAVISTER (2000) bei Ham- sterembryonen. Sie erhielten keine Unterschiede in der Entwicklung bis zum Blasto- zystenstadium bei der Gruppe von In-vitro-Embryonen mit entfernter Zona pellucida gegenüber der Kontrollgruppe.

Eine weitere Methode, um die Zona pellucida zu öffnen, stellt das so genannte „Zona drilling“ dar. Hierbei wird die Zona pellucida mit saurer Tyrode punktuell geöffnet (COHEN et al. 1992, BIDER et al. 1997, GRAHAM et al. 2000). Mit dieser Methode gelang es CHECK et al. (1996), kryokonservierte humane Embryonen nach dem Auf- tauen mit einer deutlich gesteigerten Schwangerschaftsrate zu übertragen. TUCKER et al. (1996) konnten mittels des „Zona drilling“ einen Vorteil in der Konzeptionsrate bei Frauen über 36 Jahren erzielen. LANZENDORF et al. (1998) und GABRIELSEN et al. (2004) verifizierten das Ergebnis in der altersunabhängigen Gruppe.

LIU und SERVY (2000) konnten bei dem In-vitro-Vergleich zwischen einer partiellen Zonadissektion und dem „Zona drilling“ von Rinderembryonen gegenüber der Kon- trollgruppe mit intakter Zona pellucida einen signifikant schnelleren Blastozy- stenschlupf erzielen.

Die Autoren MALTER und COHEN (1989), KHALIFA et al. (1992), HSIEH et al.

(2002), KAHRAMAN et al. (2000) und JORIS et al. (2003) erhielten allerdings bei vergleichenden Untersuchungen zum assistierten Zonaschlupf nur gleiche oder bessere Schlupfergebnisse in den Gruppen von Blastozysten, bei denen sie einen assistierten Blastozystenschlupf mechanisch oder mit einem Laser erzeugten, als wenn sie die Manipulation mittels des „Zona drilling“ durchführten.

SILLS et al. (2000) und SCHACHTER et al. (2001) beobachteten bei ihren Untersu- chungen keinen signifikanten Zusammenhang zwischen „Zona drilling“ und Zwil- lingsgeburten, obwohl bei dieser Manipulationsart eine erhöhte Zwillingsgeburtenrate aufgrund eines möglichen Abschnürens von Embryonalenzellen diskutiert worden ist (WENSTROM et al. 1993, ALKANI et al. 1994, HERSHLAG et al. 1999).

(21)

SCHACHTER et al. (2001) dokumentierten aufgrund ihrer eigenen Beobachtungen im Hinblick auf Zwillingsgeburten sowie in einer Zusammenstellung von Ergebnissen anderer Autoren, welche sich mit dem Phänomen der Zwillingsgeburten beschäftig- ten, keinen Zusammenhang mit dem assistierten Blastozystenschlupf, obwohl eine Beeinflussung des Ablaufes des Blastozystenschlupfes durch diese Prozedur von MALTER und COHEN (1989) beschrieben wurde.

In Tabelle 2.3 sind einige der in diesem Kapitel beschriebenen Methoden aufgeführt.

Tab. 2.3 Übersicht zum assistierten Zonaschlupf mittels saurer Tyrode Zona pellucida Behandlung Embryonen

n

Entwicklung

%

Spezies Autoren

punktuelle Auflösung (∅≈ 20µm)

mit saurer Tyrode (pH 2,3)

Intakte Z. p.

183

188

99,0***

86,0****

Maus NEEV et al. 1993

vollständige Auflösung mit saurer Tyrode 1-2 min (pH 2,5)

Intakte Z. p.

192

498

41,7****

26,1****

Maus LAI et al. 1994

punktuelle Auflösung (∅ ≈ 20µm)

Intakte Z. p.

269

284

13,7****

5,3 %****

Mensch CECK et al. 1996

punktuelle Auflösung (∅ ≈ 20µm)

Intakte Z. p.

180

212

11,3****

11,1****

Mensch LANZENDORF et al. 1998

vollständige Auflösung mit saurer Tyrode 1-2 min(pH 2,5)

Intakte Z. p.

71 87

52,0****

51,0****

Hamster JI und

BAVISTER 2000

Z. p. = Zona pellucida min = Minuten

* = Zonaschlupf

** = Schwangerschaften

*** = Entwicklung bis zum Stadium einer Blastozyste

**** = Weiterentwicklung nach Gefrieren und Auftauen der Embryonen

(22)

2.2.2 Behandlung mit Pronaselösung

Pronase ist ein Pilzmetabolit, welcher unspezifisch Peptidbindungen spalten kann.

Somit kann auch die Struktur der Zona pellucida auf enzymatischem Wege aufgelöst werden (BOOTH et al. 2001, FREISTEDT et al. 2001).

Diese Methode ähnelt dem natürlichen Blastozystenschlupf der Maus. Hier wird allerdings das vom Embryo und von den Uterusdrüsen synthetisierte Enzym Strypsin genutzt, um die Zona pellucida zu verdauen (O´SULLIVAN et al. 2002).

Die unten genannten Autoren benutzten ein Verfahren, bei dem die Oozy- ten/Embryonen in einem Tropfen unter Zusatz von 0,05 %iger Pronase mehrmals für 2 - 3 Sekunden bis zur Auflösung der Zona pellucida (JI und BAVISTER 2000) bis hin zu 1 %iger Pronase für 3 Minuten (ROTTMANN und LAMPETER 1981) inkubiert werden. ROTTMANN und LAMPETER (1981) zeigten, dass sie die Zona pellucida mittels Pronase entfernen konnten, verdeutlichten jedoch, dass eine unbeeinträchtig- te Entwicklung der Embryonen nur bei murinen, jedoch nicht bei cuniculiden Em- bryonen auftritt. JOHNSON et al. (1990) stellten keine Anzeichen einer pathologi- schen Aktivierung der Oozyten bei dem Gebrauch von Pronase im Gegensatz zu ihren Versuchen mit saurer Tyrodelösung fest. FONG et al. (2001), die Blastozysten der Pronaselösung aussetzten, erhielten keine Anhaltspunkte für eine Zellschädi- gung. Bei ihren Untersuchungen wurden die verwendeten menschlichen Embryonen in ihrer Morphologie verändert und die Zellen der Blastozysten wurden geschädigt, wenn die Exposition in Pronase-Medium über mehr als zwei Minuten andauerte. Sie sahen allerdings keine Anzeichen für eine Zellschädigung (vakuolisiertes Zytoplasma und Zellmembranschäden), bei einer Verweildauer der Embryonen in Pronase von weniger als 1,5 Minuten. Somit führten sie anschließend diese Prozedur erfolgreich mit einer Dauer von weniger als 1,5 Minuten durch.

BEEBE et al. (2004) konnten bei den Versuchen die Zona pellucida von Schweine- blastozysten mittels Pronase zu entfernen zwar keinen Unterschied in der weiteren Entwicklung gegenüber der Kontrollgruppe darstellen, allerdings war die Zellzahl in der Versuchsgruppe signifikant erniedrigt. JI und BAVISTER (2000) diskutierten eine zu lange Exposition in Pronase allerdings als entwicklungshemmend. Deshalb wur-

(23)

den bei ihren Studien die Embryonen mehrmals nur für 2 - 3 Sekunden bis zur Auflö- sung der Zona pellucida in das mit Pronase versehene Medium gegeben. Auf diese Weise konnten sie eine Schädigung der Embryonen verhindern. Somit postulierten sie, dass die Entwicklungshemmung der Embryonen und die pathologische Aktivie- rung von Oozyten nur durch eine zu lange (standardisierte) Inkubationszeit im Pro- nase-Medium provoziert würde.

COMIZZOLI et al. (2001) nutzten Pronase, um die Zona von Rinderoozyten zu entfernen und hier die Bindungsfähigkeit und Qualität von aufgetautem Rehsperma zu bestimmen. Bei dem erfolgreichen Versuch, Schweineoozyten von Eber-, Ratten- und Bullenspermien penetrieren zu lassen, ergab sich bei ZHAO et al. (2002) kein Unterschied zwischen Zona-intakten sowie Pronase-behandelten Oozyten.

BOEDIONO et al. (1993) konnten bei der Herstellung von Chimären aus IVF- Rinderembryonen signifikant mehr Blastozysten erzeugen, wenn sie die Zona pellucida mittels des mikrochirurgischen Verfahrens entfernten, als wenn sie mit Pronase arbeiteten. BOOTH et al. (2001) nutzen zur Entfernung der bovinen Zona pellucida vor dem Kerntransfer sowohl bei der aktivierten Oozyte als auch bei der Zygote Pro- nase, damit auch ungeübte Personen einen Kerntransfer schnell und erfolgreich durchführen können. In Tabelle 2.4 sind einige der in diesem Kapitel beschriebenen Methoden der Zonaentfernung mittels Pronase ausgeführt.

(24)

Tab. 2.4 Übersicht zur Auflösung der Zona pellucida mittels Pronase Zona pellucida Behandlung Embryonen

n

Erfolgsrate

%

Spezies Autoren

3 min. in 1 % Pronase

Intakte Z. p.

25

28

0*

50*

Kaninchen ROTTMANN und LAMPETER

1981 wiederholt 3 - 5 sec. in

0,05 % Pronase Intakte Z. p.

87

75

42*

47*

Hamster JI und

BAVISTER 2000 2 - 3 min. in 0,05 % Pronase

Intakte Z. p.

256 168

60*

53*

Rind VATJA et al. 2000 Auflösung der Zona pellucida

in 0,05 % Pronase Intakte Z. p.

74

75

44,6

51,8

Rind BOOTH et al. 2001

1,5 min. in 1 % Pronase 2 min. in 1 % Pronase 5 min. in 1 % Pronase Intakte Z. p.

18 5 3 11

o. Sch.**

e. Sch.**

l. Sch.**

o. Sch.**

Mensch FONG et al. 2001

min = Minuten

sec = Sekunden

Erfolgsrate = Weiterentwicklung in vitro nach der Behandlung mit Pronase oder ohne Behandlung

* = Implantation nach Embryonentransfer

** = Aufgrund der elektronenmikroskopischen Untersuchungen war eine weitere

= Kultivierung und Entwicklung der Embryonen nicht möglich o. Sch. = ohne Schädigung der Embryonen

e. Sch. = mit elektronenmikroskopischen Schäden der Embryonen

l. Sch. = mit licht- und elektronenmikroskopischen Schäden der Embryonen

(25)

2.2.3 Mikrochirurgie

2.2.3.1 Mechanische Eingriffe

Es gibt verschiedene Methoden des manuellen Eingriffes an der Zona pellucida. Eine mit dem geringsten Materialaufwand zu realisierende Methode, ist das so genannte

„Freihandverfahren“, welches mittels Rasierklinge oder einer dünnen Stahlkanüle, wie von POKORNY et al. (1996) und KAWASE et al. (2002) beschrieben, eine Mani- pulation ermöglicht. Allerdings kann die Rasierklinge oder die feine Kanüle auch mit einem Mikromanipulator kombiniert werden und so die Manipulation an Embryonen durchgeführt werden (LOPATAROVA et al. 2001).

Eine weitere Methode besteht darin, zwei Mikromanipulatoren zu verwenden, an de- ren Halterungen Glaskapillaren befestigt sind, wobei die eine der Fixation des Em- bryos dient und die andere für die eigentliche Manipulation zur Verfügung steht (DOKRAS et al. 1994, CIESLAK et al. 1999, VANDERZWALMEN et al. 2003). Man kann zudem auch wie NAKAYAMA et al. (1999) Piezo-Mikromanipulatoren für den assistierten Blastozystenschlupf nutzen. Des weiteren ist es möglich die Anzahl der Manipulatoren auch noch zu vergrößern, um differenziertere Eingriffe vorzunehmen.

BREM (1986) nutzte drei Manipulatoren an einem Objekttisch. Er beschrieb allerdings, dass aufgrund ihrer Anordnung am Arbeitsplatz zwei manuelle und ein elek- tromechanischer Mikromanipulator genutzt wurden, um eine optimale Handhabung aller drei Manipulatoren zu gewährleisten.

2.2.3.1.1 Assistierter Blastozystenschlupf

Der assistierte Blastozystenschlupf wurde als erstes erfolgreich von COHEN et al.

(1990) durchgeführt. In der Arbeit von COHEN et al. (1990) werden zwei Verfahren zum assistierten Blastozystenschlupf beschrieben. Zum einen wird die Zona mittels

(26)

saurer Tyrode punktuell geöffnet, zum anderen wird das mikrochirurgische Verfahren angewendet. Des weiteren beschrieben die folgenden Autoren einen assistierten Zo- naschlupfes mittels mikrochirurgischer Verfahren:

Mensch: TUCKER et al. (1991), ALIKANI und COHEN (1992), LIU et al. (1993), NIJS et al. (1993), DOKRAS et al. (1994), BARNES et al. (1995), STEIN et al. (1995), HELLEBAUT et al. (1996), HU et al. (1996), PARIKH et al. (1996), WIEMER et al.

(1996), CHAO et al. (1997), MAHADEVAN et al (1998), ALIKANI et al. (1999), CIES- LAK et al. (1999), EDIRISINGHE et al. (1999), HSU et al. (2000), BALABAN et al.

(2002), MILKI et al. (2002) und VANDERZWALMEN et al. (2003),

Maus: KHALIFA et al. (1992), CHEN et al. (1995) und KAWASE et al. (2002),

Rind: LOSKUTOFF et al. (1993), KRÜGER et al. (1995), POKORNY et al. (1996), VATJA et al. (1997), AMANO et al. (1999), DOCHI und IMAI (2001), LOPATAROVA et al. (2001) und ITOH et al. (2003).

Die partielle Zonadurchtrennung kann mechanisch mittels verschiedener Verfahren erreicht werden. Hierbei ist es notwendig, die Stelle des größten perivitellinen Rau- mes für die Dissektion zu nutzen, um die embryonalen Zellen nicht zu beschädigen (KHALIFA et al. 1992, POKORNY et al. 1996, CIESLAK et al. 1999, VANDERZWALMEN et al. 2003).

POKORNY et al. (1996) und KAWASE et al. (2002) beschrieben die Zonapunktion beim Rinderembryo bzw. Mäuseembryo unter zu Hilfenahme einer feinen Stahlkanü- le, die von ihnen mit der freien Hand geführt wird und eine Öffnung der Zona pellucida hervorruft. Diese partielle Zonadissektion ergab bei ihren Versuchen einen positiven Effekt im Hinblick auf die Trächtigkeitsrate gegenüber der Kontrollgruppe.

Zudem wurde ein assistierter Blastozystenschlupf mit einer Rasierklinge durchge- führt. Circa ein Drittel der Zona pellucida wurde so entfernt (BOEDIONO et al. 1993, VATJA et al. 1997, CHOI et al. 2001). Um die Oozyten/Embryonen während der Ma- nipulation zu fixieren, gebrauchten CHOI et al. (2001) PBS ohne Proteinzusatz und VATJA et al. (1997) nutzten eine Haltepipette. Im Anschluß daran kann der Embryo, wie bei BOEDIONO et al. (1993) beschrieben, auch aus der Zona entnommen werden.

(27)

Ein weiteres Verfahren zur partiellen Zona-Öffnung ist die Fixation der Oozyte / des Embryos mit einer Haltepipette, worauf dann mittels einer zweiten Pipette die Dissek- tion vorgenommen werden kann (COHEN et al. 1990, DOKRAS et al. 1994, VATJA et al. 1997, KAWASE et al. 2002). Nach dem Durchstechen der Zona pellucida kann die Nadel gegen die Haltepipette „gerieben“ werden (TUCKER et al. 1991, NIJS et al.

1993, DOKRAS et al. 1994, CHEN et al. 1995 und STEIN et al. 1995).

Die Autoren KHALIFA et al. (1992), CIESLAK et al. (1999), VANDERZWALMEN et al. (2003) nahmen eine so genannte dreidimensionale Öffnung der Zona vor. Bei diesem Verfahren werden zwei gekreuzte Schnitte mit einer feinausgezogenen Glas- nadel durchgeführt, während der Embryo mit einer Haltepipette fixiert ist.

Die Ergebnisse der einzelnen Autoren sind unterschiedlich. Meist wurde kein gene- reller Vorteil für die gesamte Gruppe von Embryonen erreicht, bei denen ein assistierter Schlupf vorgenommen wurde. Jedoch waren in Abhängigkeit vom Alter des Individuums von dem der Embryo stammte oder von der Zonadicke Steigerungen in

der Blastozystenschlupfrate gegenüber den Kontrollgruppen vorhanden.

EDI-OSAGIE et al. (2003) geben eine Übersicht über die Publikationen, bei denen ein assistierter Blastozystenschlupf bei humanen Embryonen vorgenommen wurde.

Sie konnten hier keine tatsächliche Geburtensteigerung feststellen. Zudem stellten sie fest, dass nur wenige Doppeltblindstudien vorhanden sind und der Erfolg des assistierten Blastozystenschlupfes nicht auf einheitliche Weise dargestellt wird (Schlupfrate, Implantationsrate, Schwangerschaftsrate, Geburtenrate).

In der nachstehenden Tabelle 2.5 sind die Publikationen einiger Autoren, die die verschiedenen Verfahren genutzt haben, aufgeführt.

(28)

Tab. 2.5. Übersicht zum assistierten Zonaschlupf mittels Mikrochirurgie Methode Embryonen

n

Erfolgsrate

%

Spezies Autoren

p. Zonadis. an D 2 Embryonen p. Zonadis. an D 3 Embryonen p. Zonadis. an D 5 Embryonen Intakte Z. p.

15 15 18 100

53,0,*0*

33,00*0*

50,0,**0 22,0,**0

Mensch DOKRAS et al. 1994

p. Zonadis. (4-6 Zellstadium) Intakte Z. p.

230 295

6,5**

4,1**

Mensch STEIN et al. 1995 Zonapunktion mittels Kanüle

(Freihand; III. Qualität) Intakte Z. p. (III. Qualität)

282

122

65,0**0

34,0**0

Rind POKORNY u.

POKORNY 1996 Zonaschnitt (20 bis 25 %)

mittels Glassnadel und Mikromanip.

Zonaschnitt (20 bis 25 %)

mittels Rasierklinge (Freihand)

Intakte Z. p.

358 315 639

64,0*

82,0*

68,2*

Rind VATJA et al. 1997

Zonaschnitt (30µm bis 50µm)

mittels Rasierklinge und Mikromanip.

Intakte Z. p.

268 265

53,4*

44,9*

Rind LOPATAROVA et al. 2001 Zonaschnitt (20µm bis 40µm)

mittels Stahlkanüle (Freihand)

Intakte Z. p.

115 104

9,0**0 74,0*0*

Maus KAWASE et al. 2002

Erfolgsrate = Weiterentwicklung in vitro bis zum Blastozystenschlupf

* = Schwangerschaften bzw. Trächtigkeiten nach Embryonentransfer p. Zonadis. = partielle Zonadissektion mittels Glaspipette und Mikromanipulator Mikromanip. = Mikromanipulator

Z. p. = Zona pellucida

III. Qualität = Embryonen der dritten Qualitätskategorie

(29)

2.2.3.2 Lasereingriffe

Der Einsatz von Lasertechniken in den assistierten Biotechnologien ist vielfältig, be- schränkt sich aber im wesentlichen auf zwei verschiedene Methoden (Übersicht:

TADIR et al. 1991). So werden Er:YAG-Laser und Nd:YAG-Laser genutzt, bei denen der Laserstrahl mittels eines Glasfaserkabels direkt mit dem Objekt in Kontakt steht (CODDINGTON et al. 1993, STROHMER und FEICHTINGER 1992, OBRUCA et al.1994, ANTINORI et al. 1996a, KONIG et al. 1996, OBRUCA et al. 1994). Des weiteren werden sogenannte kontaktlose Laser wie ArF-, KrF-, XeCl-, XeF-Excimer oder Ho:YSGG-, PALM- und Dioden-Laser verwendet, bei denen der Laserstrahl von au- ßen durch das Medium in dem sich das Objekt befindet einwirkt (PALANKER et al.

1991, BLANCHET et al. 1992, EL DANASOURI et al. 1993, LAUFER et al. 1993, MUNNE et al. 1993, NEEV et al. 1993, CONIA und VOELKEL 1994, GERMOND et al. 1995, GOA et al. 1995, NEEV et al. 1995, SCHIEWE et al. 1995a, ANTNORI et al.

1996a, ANTNORI et al. 1996b, VEIGA et al. 1997, MONTAG und VAN DER VEN 1999, PARK et al. 1999, BARUFFI et al. 2000, CLEMENT-SENGERWALD et al.

2000, GILLIS et al. 2000, MONTAG et al. 2000, BLAKE et al. 2001, MANTOUDIS et al. 2001, BALABAN et al. 2002, EBNER et al. 2002, EDENFELD et al. 2002, EROGLU et al. 2002, HORNG et al. 2002, HSIEH et al. 2002, PETERSEN et al.

2002, JORIS et al. 2003, KANYO und KONC 2003, KUNG et al. 2003, MOSER et al.

2004, PRIMI et al. 2004, LI et al. 2005, NG et al. 2005).

Bis jetzt werden die unterschiedlichen Verfahren eingesetzt, um eine Aussage über das Befruchtungspotential von Spermien treffen zu können (TADIR et al. 1989), um eine subzonale Spermieninjektion (OBRUCA et al. 1994) durchzuführen, die Zona pellucida zu verdünnen (BARUFFI et al. 2000, BLAKE et al. 2001, MANTOUDIS et al. 2001 und PETERSEN et al. 2002) oder sie zu öffnen (ANTINORI et al. 1996a, SCHMOLL et al. 2003), um nur einige der Anwendungsmöglichkeiten zu benennen.

Probleme ergeben sich im Umgang mit dem Laser zum einen durch die Absorption von Energie durch das verwandte Medium, in dem der Eingriff durchgeführt wird. Auf der anderen Seite muss die potentielle Schädigung des Embryos und des Erbgutes durch die Wellenlänge des Lasers und die beim Verdampfen der Zona pellucida ent-

(30)

stehenden toxischen Stoffe minimiert sein, damit ein positiver Nutzen entsteht (BLANCHET et al. 1992, TADIR et al. 1991, DOUGLAS-HAMILTON und CONIA 2001, SCHMOLL et al. 2003, Übersicht: SALLAM 2004).

2.2.3.3 Laser-assistierter Blastozystenschlupf

Um einen assistierten Blastozystenschlupf mittels eines Lasers durchzuführen, wurden zum einen Kontaktlaser benutzt (Mensch: STROHMER und FEICHTINGER 1992, ANTINORI et al. 1996b) und zum anderen kontaktlose-Laser eingesetzt (Mensch: ANTINORI et al. 1996b, MANDELBAUM et al. 1996, BARUFFI et al. 2000, BLAKE et al. 2001, MANTOUDIS et al. 2001, BALABAN et al. 2002, HSIEH et al.

2002, HORNG et al. 2002, KUNG et al. 2003, KANYO et al. 2004, PRIMI et al. 2004, NG et al. 2005, Rind: GAO et al. 1995, PARK et al. 1999, SCHMOLL et al. 2003, Maus: BLANCHET et al. 1992, NEEV et al. 1995, MONTAG und VAN DER VEN 1999). So wurde eine Assistenz des Blastozystenschlupfs durch eine Verdünnung der Zona pellucida erreicht (BARUFFI et al. 2000, MANTOUDIS et al. 2001) oder die Zona wurde geöffnet (BLANCHET et al. 1992, STROHMER und FEICHTINGER 1992, GOA et al. 1995, NEEV et al. 1995, MONTAG und VAN DER VEN 1999, PARK et al. 1999, BARUFFI et al. 2000, BLAKE et al. 2001, MANTOUDIS et al.

2001, HORNG et al. 2002, HSIEH et al. 2002, KUNG et al. 2003, SCHMOLL et al.

2003, PRIMI et al. 2004, NG et al. 2005).

MANTOUDIS et al. (2001) erhielten die höchsten Schwangerschaftsraten, wenn sie die Zona pellucida auf einem Viertel der gesamten Oberfläche mittels eines 1,48 µm- Dioden-Lasers (670 nm) verdünnten. BLAKE et al. (2001), die ebenfalls den 1,48 µm-Dioden-Laser (640 nm) benutzten, hatten mehr geschlüpfte humanen Blastozy- sten gegenüber den Kontrollgruppe, obwohl die partielle Verdünnung der Zona pellucida nur 80 µm lang war und die Dicke der Zona pellucida zwischen 50 und 80 % reduziert wurde. Bei ihren Versuchen mittels eines Er:YAG-Lasers die Zona pellucida um 50 % zu verdünnen (Länge der Verdünnung 20 µm), erhielten

(31)

ANTINORI et al. (1996a) ebenfalls eine signifikante Steigerung der Schwanger- schaftsrate gegenüber der Kontrollgruppe aus den humanen IVF-Programmen.

STROHMER und FEICHTINGER (1992) nahmen eine Dissektion von 20-30 µm mittels eines Er:YAG-Lasers vor. Diese war ausreichend, um einen positiven Effekt auf die Schlupfrate bei den murinen und humanen Embryonen zu erzielen. ANTINORI et al. (1996b) konnten mit einem kontaktfreien PALM-Laser und einer Dissektion der Zona pellucida von 15 - 20 µm in den beiden Versuchsgruppen einen kleinen, aber statistisch abgesicherten Vorteil gegenüber der Kontrollgruppe in Hinblick auf die Schwangerschaftsrate und die Implantationsrate erzielen. GERMOND et al. (1995) gebrauchten einen 1,48 µm-Dioden-Laser (670 nm), um auf zwei verschiedene Arten eine partielle Zonadissektion durchzuführen. Sie zeigten eine höhere Rate der humanen und murinen Versuchsgruppe gegenüber den zwei Kontrollgruppen im Hin- blick auf die Weiterentwicklung zur geschlüpften Blastozyste. SCHMOLL et al.

(2003), welche den gleichen Laser nutzten, hatten ebenfalls mit einer Öffnung der Zona pellucida (40 x 40 µm) bei bovinen Embryonen signifikant bessere Schlupfer- gebnisse in vitro.

NEEV et al. (1993) nutzten bei ihren Studien einen gepulsten XeCl-Excimer-Laser (308 nm) und beobachteten gegenüber der Gruppe, bei welcher der assistierte Bla- stozystenschlupf mit saurer Tyrode durchgeführt wurde, eine signifikant gestörte Wei- terentwicklung der murinen Embryonen der Lasergruppe. Dies bestätigte die Ergeb- nisse, die zuvor BLANCHET et al. (1992) mit einem KrF-Excimer-Laser (248 nm) er- halten hatten und die die Schädigung der Mäuseembryonen auf die entstehende Wärme und die freigesetzten Toxine aus der erwärmten Zona sowie aus dem ver- dampften Medium zurückführten.

In der Tabelle 2.6 werden einige Lasertechniken, mit denen ein assistierter Zo- naschlupf durchgeführt wurde, dargestellt.

(32)

Tab. 2.6 Übersicht zum assistierten Zonaschlupf mittels Lasertechniken Verwandter Laser

und Größe der Zonaöffnung

Anzahl n

Erfolgsrate

%

Spezies Autoren

2,9 µm Erbium-YAG-Laser

(Kontaktlaser)

Kontrollgruppe

30 30

90,0*

83,3*

Maus STROHMER u.

FEICHTINGER 1992 2,9 µm Erbium-YAG-Laser

(Kontaktlaser)

Kontrollgruppe

2,9 µm Erbium-YAG-Laser

(Kontaktlaser)

Kontrollgruppe

55 58 129 167

80,0*

29,3*

40,0*

16,2*

Maus

Mensch

OBRUCA et al. 1994

PALM pulsed nitrogen laser Kontrollgruppe

218 407

14,7*

4,7*

Mensch ANTINORI et al. 1996b 1,48 µm Dioden-Laser (Total)

1,48 µm Dioden-Laser (Part.)

1,48 µm Dioden-Laser (Qu.)

213 428 234

5,2*

18,3*

22,1*

Mensch MANTOUDIS et al. 2001

1,48 µm Dioden-Laser (Ver.)

Kontrollgruppe

110 42

17,3*

0,0*

Mensch BLAKE et al. 2001 1,48 µm Dioden-Laser (7-15 x 40 µm)

1,48 µm Dioden-Laser (40 x 40 µm)

Kontrollgruppe

48 44 49

27,1*

63,6*

42,9*

Rind SCHMOLL et al. 2003

Erfolgsrate = Weiterentwicklung in vitro bis zum Blastozystenschlupf

* = Schwangerschaften bzw. Trächtigkeiten nach Embryonentransfer Total = totale Verdünnung der Zona pellucida

Part. = Verdünnung der Zona pellucida an einer Stelle Qu. = Verdünnung von einem Viertel der Zona pellucida

Ver. = Verdünnung der Zona pellucida an einer Stelle (40 µm x 60 µm) YAG = yttrium-aluminium-garnet

(33)

3 Eigene Untersuchungen

3.1 Material und Methoden

Die Untersuchungen zum assistierten Zonaschlupf erfolgten im Rahmen des Embryonentransferprogrammes der Rinder Union West (RUW) eG, ET-Station Soest (Einzugsgebiet Westfalen) und der tierärztlichen Gemeinschaftspraxis Dr. Hoff- meister und Gehring, Marsberg (Einzugsgebiet Hessen und Thüringen). Es wurden hierbei insgesamt 765 Embryonen auf entsprechende Empfängertiere übertragen.

Der Untersuchungszeitraum erstreckte sich von September 2001 bis Juli 2002.

3.1.1 Embryonenspender

Im Untersuchungszeitraum wurden 175 Tiere (138 Kühe im Alter von 5,2 + 1,4 Jah- ren und 37 Rinder im Alter von 14,0 + 3,0 Monaten), die durch die Züchter und/oder die jeweiligen Zuchtverbände für den Embryonentransfer vorselektiert waren, auf 79 Betrieben (Ø 2,2 Tiere pro Betrieb) einer Superovulationsbehandlung mit anschlie- ßender Embryonengewinnung unterzogen. Diese Embryonenspender gehörten folgenden Rassen an:

Einhundertneunundzwanzig Deutsche Schwarzbunte (24 Rinder und 105 Kühe), 26 Deutsche Rotbunte (10 Rinder und 16 Kühe), 8 Fleckvieh (1 Rind und 7 Kühe), 9 Braunvieh-Kühe, 1 Rotvieh-Kuh, 1 Charolais-Rind und 1 Piemonteser-Rind.

Sie waren im Rahmen einer allgemeinen und einer rektalen gynäkologischen Unter- suchung zwischen D 6 - D 12 des Zyklus (D 0 = Tag des Brunstbeginns) erstmals aus einer Gruppe von 189 Tieren von den ET-Teams zur Superovulationsbehand- lung ausgewählt worden, wobei neben dem Ausschluss pathologischer Befunde ein besonderes Augenmerk auf das Vorhandensein eines Gelbkörpers gelegt wurde.

(34)

3.1.2 Embryonenempfänger

Insgesamt wurden 765 Embryonen auf 765 Tiere (516 Rinder im Alter von 18,0 Mo- naten + 3,0 Monaten und 249 Kühe im Alter von 5,5 Jahren + 2,3 Jahren) in 79 Be- trieben übertragen (1 bis 44 Tiere pro Bestand).

Die Rezipienten umfassten 521 Deutsche Schwarzbunte (351 Rinder und 170 Kühe), 141 Deutsche Rotbunte (92 Rinder und 49 Kühe), 75 Fleckvieh (47 Rinder und 28 Kühe), 5 Braunvieh (3 Rinder und 2 Kühe), 9 Charolais-Rinder und 14 Kreuzungsrin- der (F 1, Deutsche Schwarzbunte x Angus).

Die Vorselektion der Empfängertiere erfolgte aufgrund der mindestens 2 mal täglich erfolgenden Brunstbeobachtung durch den Besitzer sowie durch eine rektale gynäko- logische Untersuchung am Tag des Embryonentransfers durch die Person des jeweiligen Embryotransferteams.

Die Besitzer stellten die Rezipienten am Tag des Embryotransfers (D 6,5 - D 7) nur zur Untersuchung vor, wenn die Tiere eine zum Spendertier synchrone Brunst ge- zeigt hatten (maximale Asynchronie von + 24 h).

Bei der Untersuchung der Empfängertiere am Tag des Embryotransfers wurde wie bei der Voruntersuchung der Spendertiere vorgegangen. Auch bei dieser rektalen gynäkologischen Untersuchung wurde besonderer Wert auf das Vorhandensein eines Gelbkörpers gelegt und das Vorliegen pathologischer Befunde ausgeschlossen.

3.1.3 Brunstsynchronisation

Die Synchronisation der 175 Embryonenspender wurde mittels einer zweimaligen Cloprostenolgabe (je 500 µg Cloprostenol i. m., Estrumate^®, Essex, München) im Abstand von 12 Stunden zwischen D 12 - D 17 des Zyklus vorgenommen (Tab. 3.1).

Als Embryonenempfänger wurden 205 Tiere (136 Rinder und 69 Kühe) genutzt, die zur selben Zeit wie die Spender eine natürliche Brunst zeigten. Zusätzlich wurden 545 Tiere (357 Rinder und 188 Kühe) mit bekanntem Zyklusstadium zwischen D 6

(35)

und D 14 des Zyklus mittels einer Cloprostenolgabe (500 µg Cloprostenol i. m.) 12 Stunden vor der ersten Cloprostenolgabe an die Spendertiere synchronisiert. Die 15 Rinder, bei denen das Zyklusstadium vor der Behandlung unbekannt war, wurden zusätzlich 12 Tage zuvor ein weiteres Mal mit Cloprostenol (500 µg Cloprostenol i.m.) behandelt (Tab. 3.1).

Somit konnte die Synchronie der Empfängertiere (D 6 - D 8) am Tag des Transfers zu den Spendertieren beziehungsweise zu den übertragenen Embryonen (D 6,5 - D 7) gewährleistet werden.

3.1.4 Superovulation

Die Superovulation der Spendertiere erfolgte nach zwei verschiedenen Schemata:

Die Donoren (23 Kühe und 9 Färsen) wurden beim ET-Team Soest mittels zweimali- ger intramuskulärer Gabe von eCG im Abstand von 12 h (Intergonan^®, Intervet, Un- terschleißheim: 2000 IE/Kuh morgens und 1000 IE/Kuh abends bzw. 1000 IE/Färse abends und 1000 IE/Färse morgens) zwischen Tag 9 und Tag 14 des Zyklus supero- vuliert.

Demgegenüber fand die Superovulationsinduktion bei den 138 Donoren (28 Rinder und 106 Kühe) des ET-Teams Marsberg durch eine einmalige eCG-Applikation (Intergonan^®, 3000 IE/Kuh bzw. 2000 IE/Färse, jeweils morgens) zwischen Tag 9 und Tag 14 des Zyklus (D 9 - D 14) statt.

Zur Zyklussteuerung verwendeten beide Teams eine zweimalige Cloprostenolgabe (je 500 µg Cloprostenol i. m., Estrumate^®, Essex, München) 62 h und 74 h nach der ersten eCG-Gabe (Tab. 3.1).

Zwölf und 24 Stunden nach Brunstbeginn wurden die Spender mit je einer aufgetauten, für Deutschland handelsüblichen Besamungsportion kryokonservierten Spermas intrauterin inseminiert. Das verwandte Sperma stammte aus dem aktuellen Angebot der jeweiligen Besamungsstation (RUW eG/ZBH eG) und somit ausschließlich von geprüft fertilen Bullen.

(36)

Zehn Kühe (6 ET-Team Soest und 4 ET-Team Marsberg), welche die von den ET- Teams importierten Embryonen (siehe Kap. 3.1.9) produzierten, wurden auf nicht bekannte Weise einer Superovulationsbehandlung unterzogen.

(37)

Tabelle 3.1 Zeitlicher Ablauf der Superovulationseinleitung mit anschließendem Embryonentransfer

Zyklus- tag

Behandlung Superovulation Soest

Superovulation Marsberg

Empfänger Soest / Marsberg

D - 14

vorausgegangene spontane Brunst

(Embryonenspender)

Cloprostenol

500 µg / Tier (unbek. Zyklustag )

D - 6 Voruntersuchung

(Embryonenspender)

D - 4 (morgens)

Superovulations- induktion

eCG 2000 IE/Kuh 1000 IE/Färse

eCG 3000 IE/Kuh 2000 IE/Färse D - 4

(abends)

Superovulations- induktion

eCG 1000 IE/Kuh 1000 IE/Färse D - 2

(morgens)

Synchronisation

(Empfänger)

Cloprostenol

500 µg / Tier D - 2

(abends)

Synchronisation

(Embryonenspender)

Cloprostenol 500 µg / Tier

Cloprostenol 500 µg / Tier D - 1

(morgens)

Synchronisation

(Embryonenspender)

Cloprostenol 500 µg / Tier

D 0

Brunstbeginn

(Spender: Bes. nach 12 h und 24 h)

D 6,5/

D 7

Embryonengew./

ET

eCG = equines Choriongonadotropin ET = Embryonentransfer Bes. = Besamung Embryonengew. = Embryonengewinnung unbek. = unbekannter

(38)

3.1.5 Spül-, Aufbewahrungs-, Manipulations- und Kryokonservierungsme- dien

Zur Embryonengewinnung diente bei den ET-Teams Dulbecco´s phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS^®, Gibco Brl., Life Technology^TM, Auckland, N.Z.). Bei der ET- Station Soest wurden 5 ml emcare^®holding medium (IMMUNO-Chemical Products LTD, Auckland, N.Z.) einem Liter DPBS^®als makromolekularer Zusatz zugegeben.

Als Aufbewahrungs- und Manipulationsmedium wurden bei dem ET-Team Soest emcare^®holding medium und beim ET-Team Marsberg OVUM CULTURE MEDIUM^® auf DPBS-Grundlage (OCM^®, Biochrom KG, Berlin, D) verwendet.

Das ET-Team Soest nutzte ein 1,5-molares Ethylenglykol-Medium (1,5 M Ethylengly- kol in emcare^® holding medium) zur Kryokonservierung. Beim ET-Team Marsberg kam ebenfalls ein 1,5-molares Ethylenglykol-Medium (1,5 M Ethylenglykol in OCM^®, Biochrom KG, Berlin, D) zum Einsatz.

Zum Auftauen von in Glycerin kryokonservierten Importembryonen wurde beim ET- Team Soest zusätzlich 1-molares Saccharose-Medium (1 M Sucrose in emcare^® medium, IMMUNO–Chemical Products LTD, Auckland, N.Z.) verwendet.

Das Spülmedium wurde bei beiden ET-Teams bei Raumtemperatur (18 - 25 °C) aufbewahrt, während die Aufbewahrungs-, Manipulations- und die Kryokonservierungs- medien bei Kühlschranktemperatur (2 - 8 °C) gelagert wurden. Zu Beginn der jeweiligen Spülung wurden auch diese Medien dann auf Raumtemperatur (18 - 25 °C) er- wärmt. Das Spülmedium wurde hingegen auf eine Temperatur zwischen 35 - 38 °C eingestellt. Angebrochene Behältnisse wurden maximal 3 Tage aufbewahrt und ver- braucht.

(39)

3.1.6 Embryogewinnung

Am Tag sieben (D 6,5 - D 7) nach der Superovulationsbrunst (siehe Tab. 3.1) wurden die Embryonen unblutig beim ET-Team Soest mittels eines Gummikatheters (Modell Neustadt a. d. Aisch^®, Fa. Wörrlein, Ansbach, D) beziehungsweise beim ET- Team Marsberg mittels eines Silikonkatheters (Modell DISSI^®, Fa. Minitüb, Tiefen- bach, D) aus den eileiternahen Abschnitten der Uterushörner gewonnen. Der Durchmesser des bei Kühen verwendeten Katheters betrug 18 mm. Bei Färsen wurde ein Katheter mit einem Durchmesser von 16 mm genutzt. Vor jeder Spülung wurde die aufblasbare Manschette des Katheters mit Luft aus einer Einwegspritze (Ein- malspritze HSW-Normject^®, Inhalt 20 ml, WDT eG, Garbsen, D) gefüllt, um Undich- tigkeiten auszuschließen. Den fixierten Spendertieren wurden zur Ausschaltung der Bauchpresse 3 - 4 ml des Lokalanästhetikums Procain (Procain HCL 50^®, Medistar^®, Holzwickede, D) als kleine Epiduralanästhesie verabreicht. Der Genitalbereich wurde mit Softa-Sept^® (Softa-Sept^®, Fa. Braun, Melsungen, D, ET-Team Marsberg) oder mit körperwarmem Wasser (ET-Team Soest) gereinigt und mit Papiertüchern getrocknet.

Dann wurde der jeweilige Katheter mit Mandrin unter rektaler Kontrolle in das zu spü- lende Uterushorn eingeführt. Um den Katheter intracornual zu fixieren, wurde sein Ballon mit 15 ml (Färsen) beziehungsweise 20 ml (Kühe) Luft aus einer Einwegsprit- ze gefüllt. Nach Entfernen des Mandrins wurde der richtige Sitz des Katheters über- prüft und wenn nötig korrigiert.

Beim ET-Team Soest kam die „Gravitationsmethode“ mit dem Zweiwegehahnsystem (MINIFLUSH^TM Embryo Recovery System, Minitube of America, Inc., Verona WI., USA) und einem Embryonenfilter (Embryo Concentrator^®, Porengröße 75 µm, Ge- samtvolumen des Plastikbechers 80 ml, IMMUNO System Inc., Spring Valley, USA) bei der Embryonengewinnung zum Einsatz. Während jedes Gebärmutterhorn in Etappen mit insgesamt je 450 ml Medium gespült wurde, wurde der Überstand über dem Filter in dem Plastikbecher immer konstant in einer Höhe zwischen zwei und drei Zentimetern gehalten. Die Menge des Überstandes wurde mit Hilfe einer Klem- me unterhalb des Filtereinsatzes kontrolliert. Das aus dem Filter abgelassene Medi- um wurde verworfen. Der Überstand wurde dann zum Auffinden der Embryonen in

(40)

eine Plastikpetrischale (Ø 9 cm, Polystyrol, Becton & Dickison^TM, New York, USA/

Nunc^TM, Roskilde, DK) verbracht. Des weiteren wurde der Filter mehrmals mittels Spülmedium (15 ml) aus einer Einwegspritze abgespült, so dass dem Filter anhaftende Partikel gewonnen wurden. Der Inhalt der Plastikpetrischalen wurde dann unter ein Stereomikroskop (Stereolupe, Will & Strybin, Wetzlar, D) verbracht, um die vorhandenen Eizellen und Embryonen bei einer 13-fachen Vergrößerung aufzusu- chen. Anschließend wurden sie mittels einer Glaspipette (Glass Pipette for Embryo Handling, Fa. Minitüb, Tiefenbach, D) in ein gesondertes Plastikpetrischälchen für die Gewebekultur (Ø 3,5 cm, Polystyrol, Nunc^TM, Roskilde, DK), welches mit 3 ml Medi- um gefüllt war, umgesetzt. Anschließend wurden die Embryonen 12 mal in je 3 ml frischem Aufbewahrungsmedium gewaschen und dann bei 50-facher Vergrößerung beurteilt, um die Embryonen nun entweder dem Direkttransfer oder der Kryokonser- vierung mittels Ethylenglykol zuzuführen.

Beim ET-Team Marsberg wurde das „Ebbe-Flut-System“ verwandt. Bei diesem wurde Medium mit Hilfe von Einwegspritzen (Einmalspritzen, Inhalt 60 ml, Becton & Di- ckinson, N.J., USA) in einer ansteigenden Menge von 15 ml - 60 ml über den Kathe- ter in das jeweilige Uterushorn infundiert und wieder abgesogen. Die rückgewonnene Flüssigkeit wurde dann durch einen embryonendichten Filter (Miniflush^®, Porengröße 75 µm, Fa. Minitüb, Tiefenbach, D) der in einer Isoliertasche an einem Ständer fest installiert war, geleitet. Nachdem jedes Horn mit 500 ml Spülmedium gespült worden war, wurde wie beim ET-Team Soest vorgegangen. Jedoch kamen hier die Stereo- mikroskope N3C bzw. N3Z (Wild, Wetzlar, D) zum Einsatz und die im Gewinnungs- katheter verbliebene Spülflüssigkeit wurde in eine eigene Plastikpetrischale (Ø 9 cm, Polystyrol, Nunc^TM, Roskilde, DK) verbracht und unter dem Stereomikroskop nach Embryonen durchsucht.

(41)

3.1.7 Embryobeurteilung

Die Embryonenbeurteilung wurde nach dem Waschen der frisch gewonnen Embryo- nen vorgenommen. Zusätzlich wurden die aufgetauten Embryonen auf Abweichun- gen im Hinblick auf die Qualitätsbeurteilung vor dem Tiefgefrieren untersucht. Bei Defekten, die sich ausschließlich auf die Zona pellucida beschränkten, wurde entge- gen der Kriterien der International Embryotransfer Society, IETS, die Qualitätsstufe beibehalten. Alle anderen Embryonen wurden bei beiden ET-Teams nach diesen Kriterien in die üblichen 4 Kategorien für Embryonen eingeteilt (ROBERTSON und NELSON 1998):

I. Sehr gute Qualität (excellent or good) :

- Embryonen im Entwicklungsstadium einer kompakten Morula bis expandierten Blastozyste. Weniger als 15 % der Gesamtzellmasse sind dem Embryo nicht zuzuordnen und die Zona pellucida ist intakt;

- der Embryo ist lebens- und tiefgefrierfähig;

II. Gute Qualität (fair) :

- Embryonen im Entwicklungsstadium einer kompakten Morula bis expandierten Blastozyste. Mehr als 15 %, aber deutlich weniger als 50 % der Gesamtzell- masse sind dem Embryo nicht zuzuordnen und die Zona pellucida ist intakt;

- der Embryo ist lebensfähig, aber nur bedingt tiefgefrierfähig;

III. Mäßige Qualität (poor) :

- Embryonen im Entwicklungsstadium einer kompakten Morula bis expandierten Blastozyste. Mehr als 50 %, aber deutlich weniger als 75 % der Gesamtzell- masse sind dem Embryo nicht zuzuordnen und die Zona pellucida ist intakt;

- der Embryo ist lebensfähig, aber nicht tiefgefrierfähig;

(42)

IV. Unbefruchtete, degenerierte, retardierte oder tote Eizellen/Embryonen (unfertilised, degenerated, retarded or dead; modifiziert nach

ROBERTSON und NELSON 1998):

- Eizellen die nicht befruchtet wurden;

- Embryonen, die sich in einem früheren Entwicklungsstadium als im Stadium der kompakten Morula befinden, sowie Embryonen, bei denen weniger als 25 % der Gesamtzellmasse dem Embryo zuzuordnen sind oder die Zona pellucida nicht intakt ist;

- der Embryo ist nicht lebensfähig;

Zur Übertragung am Tag des Transfers wurden Embryonen der Qualitätsstufe I. – III.

herangezogen. Zur Kryokonservierung wurden nur Embryonen der Qualitätsstufe I.

und II. verwendet. Die Embryonen, die nach dem Auftauen lediglich einen Zonade- fekt aufwiesen der < 120 µm war, wurden der Versuchgruppe zugeteilt und der Quali- tätskategorie zugeordnet, die der eigentliche Embryo aufwies.

3.1.8 Kryokonservierung

Sowohl beim ET-Team Marsberg als auch beim ET-Team Soest wurden die Em- bryonen in einer 1,5 molaren Ethylenglykollösung kryokonserviert (ET-Team Soest:

1,5 M Ethylenglykol in emcare^®; ET-Team Marsberg: 1,5 M Ethylenglykol in OCM^®).

Es kam bei beiden ET-Teams das Gerät Freeze Controller^® (Modell CL 5000, Cryo Logic™, USA) zum Einsatz.

Die Embryonen wurden nach dem Waschen für 5 Minuten bei Raumtemperatur in 2 ml Kryokonservierungsmedium in einem Plastikpetrischälchen für die Gewebekultur (Ø 3,5 cm, Polystyrol, Nunc^TM, Roskilde, DK) äquilibriert und danach in 2 ml frisches Kryokonservierungsmedium umgesetzt. Anschließend wurden sie in die nach den internationalen Richtlinien beschrifteten Straws (Ministraw, 133 mm, 0,25 ml, Minitüb,

(43)

Tiefenbach, D) aufgezogen. Die befüllten Straws enthielten fünf Medium-Säulen durch je eine Luftblase getrennt:

Die beiden äußeren Säulen beinhalteten Aufbewahrungsmedium, wobei die beiden zur Mitte hin anliegenden Säulen aus Kryokonservierungsmedium bestanden und die mittlere Säule den Embryo in Kryokonservierungsmedium beinhaltete. Danach wurde der Straw verschlossen (ET-Team Marsberg: Polymerisationspulver IMF, Albrecht, Aulendorf, D; ET-Team Soest: Stick, IMV Technologies Cassou^TM, L´Aigle, F). So vorbereitet wurden die Embryonen nach einer Kontrolle der Straws gemeinsam in das Gefriergerät bei - 6 °C eingesetzt. Nach 2 Minuten erfolgte das „seeding“ durch Kontakt mit einer in flüssigem Stickstoff abgekühlten anatomischen Pinzette am obe- ren Ende des Straws. Hieran schloss sich eine 10-minütige Haltezeit bei - 6 °C an.

Die ET-Teams nutzten das installierte Programm Nr. 6. Bei diesem Programm werden die Embryonen um 0,5 °C/min auf - 35 °C abgekühlt. Bei - 35 °C wurden die Straws aus dem Gerät entnommen, um sie dann in flüssigen Stickstoff umzusetzen (Methode modifiziert nach WILLADSEN et al. 1978). Aus dem Stickstoffbad wurden sie in einen Stickstoffcontainer verbracht, um dort bis zum Auftauen gelagert zu werden.

3.1.9 Auftauen von Embryonen

Insgesamt wurden 397 Embryonen für den Embryotransfer aufgetaut (n = 68, ET- Team Soest und n = 329, ET-Team Marsberg). 45 Embryonen waren importierte Embryonen (n = 16, ET-Team Soest und n = 17, ET-Team Marsberg) die in Ethylen- glykol beziehungsweise in Glycerin (n = 5, ET-Team Soest) kryokonserviert worden waren.

Die Straws (The genuine CASSOU™ Straw, 133 mm, 0,25 ml, IMV Technologies Cassou^TM, L´Aigle, F) mit den Embryonen wurden aus dem jeweiligen Stickstoffcon- tainer entnommen, um dann mittels eines Einwegpapiertuches das anhaftende Was- serkondensat zu entfernen (2 Sekunden). Anschließend wurden sie 10 Sekunden in