Aus dem Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Molekulargenetische Untersuchungen zur Hornlosigkeit beim Rind
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades einer
D O K T O R I N D E R V E T E R I N Ä R M E D I Z I N (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Anke Bader, geb. Stephan aus Soltau
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. O. Distl
1. Gutachter: Prof. Dr. O. Distl 2. Gutachter: Prof. Dr. H.Y. Naim
Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.2001
Meinen Eltern und meinem Mann
Gefördert durch das Bayerische Staatsministerium für Ernährung, Landwirtschaft, und Forsten, München, die Dr. Dr. h.c. Karl Eibl-Stiftung, Neustadt/Aisch und die FAZIT Stiftung, Frankfurt am Main.
1 Einleitung 1
2 Literatur 2
2.1 Hornentwicklung und Aufbau des Hornes 2 2.2 Hornlosigkeit und Vererbung der Hornausprägung 3 2.3 Hornlosigkeit beim Deutschen Fleckvieh 4
2.4 Genomkartierung 6
2.4.1 Genetische Kartierung 6
2.4.2 Physikalische Kartierung 8
2.4.3 Vergleichende Genomkartierung 12 2.5 Stand der Genomkartierung beim Rind 15 2.6 Kartierung des Gens für die Hornlosigkeit 17
beim Rind (Polled-Locus)
2.7 Lokalisation der Gene für Hornlosigkeit bei Schaf und Ziege 19 2.8 Indirekte Gendiagnose am Polled-Locus 21
3 MMMMethoden 25
3.1 Molekularbiologische Methoden 27
3.1.1 Isolierung genomischer DNA 27
3.1.1.1 DNA-Isolierung aus Blut 27
3.1.1.2 DNA-Isolierung aus Sperma 28
3.1.1.3 Schätzung der DNA-Konzentration 28 3.1.2 Vermehrung und Isolierung von Plasmid-DNA 28
3.1.2.1 Bakterienkultur 28
3.1.2.1.1 Flüssigkultur 28
3.1.2.1.2 Plattenkulturen 29
3.1.2.2 Transformation kompetenter E. coli 29 3.1.2.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 30 3.1.2.3.1 Plasmidisolation durch alkalische Lyse 30 3.1.2.3.2 Isolierung hochreiner Plasmid-DNA 30
Inhaltsverzeichnis
3.1.2.4 Isolierung von BAC-DNA aus E. coli 31 3.1.2.4.1 Schnellaufschluss zur Isolierung von BAC-DNA 31 3.1.2.4.2 Isolierung von BAC-DNA mit QIAGEN Plasmid Kits 32 3.1.2.4.3 Abschätzung der Plasmid-DNA-Konzentration 33 3.1.2.5 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten 33
aus Agarosegelen
3.1.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) 34
3.1.3.1 Standard PCR-Ansätze 34
3.1.4 Spaltung von DNA in Lösung 35 3.1.5 Ligation von PCR-Produkten in Plasmidvektoren 35 3.1.6 Detektion von DNA-Fragmenten 36
3.1.6.1 Agarosegelelektrophorese 36
3.1.6.2 Pulsfeldgelelektrophorese 36
3.1.6.3 Southern Blotting 37
3.1.6.4 Markierung von DNA-Sonden und Hybridisierung 38 3.1.6.4.1 Nichtradioaktive Hybridisierung und Detektion von 38
DNA-Fragmenten
3.1.6.4.2 Radioaktive Hybridisierung 38 3.1.6.4.3 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung 39
3.1.7 Automatische Sequenzierung 40
3.1.8 Polyacrylamidgelelektrophorese 40 3.1.8.1 Sequenzier- und Mikrosatellitengele 40 3.1.8.2 Auswertung der Mikrosatelliten- und Sequenzgele 41
3.2 Statistische Auswertung 42
3.2.1 Auswertung der Genotypen 42
3.2.2 Berechnung der genetischen Karte 42
3.2.3 Radiation Hybrid Mapping 43
3.2.4 Sequenzvergleich 43
3.2.5 Primerauswahl 43
4 Ergebnisse 44
4.1 Radiation Hybrid Mapping 44
4.1.1 Auswahl und Überprüfung der cDNA-Klone 44
von HSA21 und HSA3 4.1.2 Auswahl der Primer aus der Region für das 46
Polled-Intersex-Syndrome (PIS) auf Ziegenchromosom 1 (CHI1) 4.1.3 Hybridisierung an der Rinder-BAC-Banken 47
4.1.4 Charakterisierung der BAC-Klone 50
4.1.5 Sequenzierung und Primerauswahl 54
4.1.6 RH-Kartierung der Gene 56
4.1.7 Überlappungen der BAC-Klone 65
4.1.8 Vergleichende Kartierung der Gene von HSA21 68
4.2 Genetische Kartierung des Mikrosatelliten PRKCBP2_ MS 70
am Internationalen Bovinen Referenz Familien Panel 4.3 Typisierung des Fleckvieh-Tiermaterials und 74
genetische Kartierung 4.3.1 Auswahl polymorpher Marker 74
4.3.2 Typisierung der Marker an den 7 Fleckviehfamilien 76
4.3.3 Allelfrequenzen 85
4.3.4 Bestimmung der Kopplungsphase 86
4.3.5 Haplotypenanalyse der heterozygot hornlosen Nachkommen 86
4.3.6 Kopplungsanalyse 91
5 Diskussion 93
5.1 Radiation Hybrid Mapping 93
5.2 Vergleichende Kartierung 96
5.3 Genetische Kartierung 98
6 Zusammenfassung 101
Inhaltsverzeichnis
7 Summary 103
8 Literaturverzeichnis 105
9 Anhang 121
9.1 BAC-Bibliotheken und RH-Panel 121
9.2 Klone, Vektoren 121
9.2.1 cDNA-Klone 121
9.2.2 Vektoren 123
9.3 Verbrauchsmaterial 123
9.3.1 Chemikalien 123
9.3.2 Enzyme 124
9.3.3 Kits 124
9.3.4 Primer und dNTPs 124
9.3.5 Medien 127
9.3.6 Lösungen und Puffer 127
9.3.7 Geräte 131
9.3.8 Einwegartikel und Filme 132
9.4 EDV-System und Computerprogramme 133
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
Abb. Abbildung
APS Ammoniumpersulfat
Aqua bidest. Aqua bidestillata, doppelt destilliert
BAC künstliches Bakterienchromosom (bacterial artificial chromosome)
BLAST basic local alignment search
bp Basenpaar(e)
BPES Blepharophimosis Ptosis Epicanthus inversus Syndrome BSA Rinderserumalbumin (bovines Serumalbumin) BTA Chromosom von Bos taurus
bzw. beziehungsweise
CHI Chromosom von Capra hircus
cM CentiMorgan
dATP Desoxyadenintriphosphat dCTP Desoxycytosintriphosphat dGTP Desoxyguanosintriphosphat dTTP Desoxythymidintriphosphat dUTP Desoxyuraciltriphosphat
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat ddNTP Didesoxyribonukleosidtriphosphat CTBP2 C-terminal binding protein 2
Diss. Dissertation
DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EMBL European Molecular Biology Laboratory et al. et alii
Abkürzungsverzeichnis
f weiblich Fachber. Fachbereich
FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung FOXL2 putative forkhead transcription factor
G Guanin
GART phosphoribosylglycinamide formyltransferase
GB Gigabyte
GCFC human GC-rich sequence DNA-binding factor candidate GRIK1 human glutamate receptor (GLUR5)
h Stunde
H Allel des Hornlocus des Rindes Ha African Horn Gen des Rindes HH1 Halo hair Locus des Schafes HoP, Ho+, Hoh1 Allele des Ho-Locus des Schafes IBRP International bovine reference panel IFNAR1 Interferon alpha/beta receptor IFNAR2 Interferon alpha receptor
IL10RB Inteleukin10-Receptorcomplex, transmembranase receptor protein
INRA Institute National de la Recherche Agronomique
KCNE2 human minK-related peptide1, potassium channel subunit
kB Kilobasen
kBp Kilobasenpaare
KIAA0539 human mRNA for KIAA0539 protein LOD dezimaler Logarithmus der odds ratio
log10like. log10likelihood, dekadischer Logarithmus der Likelihood
M molar
m Meter, männlich
µ micro-
mA Milliampere
Min Minute
ml Milliliter
µl Mikroliter
mM millimolar
µM Mikromolar
ng Nanogramm
nm Nanometer
P dominantes Allel des Polled-Locus des Rindes p rezessives Allel des Polled-Locus des Rindes p.a. pro analysis
PAA Polyacrylamid
PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) PFGE Pulsfeldgelelektrophorese
PIS Polled-Intersex-Syndrome PRED33 putative serine threonin kinase
PRKCBP2 human protein kinase C-binding protein
RFLP Restriktions Fragment Längenpolymorphismus RH Radiation Hybrid
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT Raumtemperatur
RUNX1 acute myeloid leukemia 1 protein (oncogene AML-1), core- binding factor alpha subunit
s Sekunde
Sc dominantes Allel des Scurs-Locus des Rindes sc rezessives Allel des Scurs-Locus des Rindes SDS Natriumdodecylsulfat
SINE short interspersed nuclear element SOD1 Cu/Zn superoxide dismutase SSC Natriumchlorid-Natriumcitrat
SYNJ1 synaptojanin-1,polyphosphoinositide phosphatase
T Thymidin
θ Rekombinationsfrequenz
Abkürzungsverzeichnis
TAMU Texas A&M University Angleton Families
Tab. Tabelle
TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TE Tris-EDTA-Puffer
TEMED N-N-N`-N`-Tetramethylethylendiamid
TIAM1 human T-lymphoma invasion and metastasis inducing TIAM1 protein
Tris Aminohydroxymethylpropandiol U Units (Enzymeinheiten)
USDA U. S. Department of Agriculture UV ultraviolett
V Volt
Vers. Version
v/v Volumen zu Volumen w/v Gewicht zu Volumen
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid YAC künstliches Hefechromosom (yeast artificial chromosome)
1 Einleitung
Die Hornlosigkeit bei Rindern gewinnt im Hinblick auf die wachsende Bedeutung der Laufstallhaltung in der Milchviehproduktion und Ausdehnung der Mutterkuhhaltung zunehmende Relevanz. Üblicherweise werden die Kälber in einem frühen Lebensalter enthornt, um das Verletzungsrisiko der Tiere untereinander und für die Tierbesitzer zu minimieren. Dieser Eingriff, der auch nach der Novellierung des Tierschutzgesetzes (25. Mai 1998) bis zu einem Lebensalter von 6 Wochen keiner Betäubung bedarf, ist mit Schmerzen und der Gefahr von Folgeschäden verbunden.
Daher erscheint es sinnvoll auf Hornlosigkeit zu züchten. In der Population des Deutschen Fleckviehs begann man bereits vor 30 Jahren mit der Selektion auf Hornlosigkeit. Die Hornlosigkeit beim Rind wird dominant vererbt. Der für die Horn- losigkeit verantwortliche Genort, der sogenannte Polled-Locus, wurde bei verschiedenen Rassen durch Kopplungsanalyse auf dem proximalen Abschnitt des Rinderchromosoms 1 (BTA1) lokalisiert. Es ist bisher nicht gelungen, das Gen aufzufinden und molekulargenetisch zu charakterisieren. Bisher existiert nur ein indirekter Gentest, der unter optimalen Voraussetzungen eine Wahrscheinlich- keitsberechnung für die Unterscheidung zwischen homozygot und heterozygot hornlosen Tieren zulässt. Dieser Test verliert an Aussagekraft, wenn bei einer weiteren Selektion auf Hornlosigkeit in den folgenden Generationen nur hornlose Tiere auftreten. Der bisherige Stand des Testsystems lässt somit nur in der Anfangsphase der Zucht auf Hornlosigkeit zuverlässige Ergebnisse erwarten. Eine Verbesserung des bestehenden Testsystems soll durch Entwicklung und Kartierung neuer polymorpher Marker im proximalen Abschnitt vom Rinderchromosom 1 (BTA1) erzielt werden. Da der proximale Abschnitt von BTA1 Homologien zum humanen Chromosom 21 (HSA21) aufweist, erleichtert die vergleichende Genomkartierung die Aufklärung des Polled-Gens wesentlich. Allerdings ist aus der vergleichenden Genomkartierung zwischen Mensch und Maus zu erwarten, dass in diesem Bereich, der das Polled-Gen enthält, viele Rearrangements von Gensegmenten stattgefunden haben. Deshalb soll mit Hilfe der vergleichenden Genkartierung zwischen Rind und Mensch eine fein auflösende Genkarte des proximalen Abschnitts von BTA1 erstellt werden, mit der die Bruchpunkte der Rearrangements zwischen BTA1 und HSA21 möglichst genau eingegrenzt werden können. Somit sollte die Genregion, in der der Polled-Locus liegt, weiter eingegrenzt werden. Zusätzlich soll geklärt werden, ob das FOXL2-Gen, das bei der Ziege als Kandidatengen für die Hornlosigkeit diskutiert wird, in der Genomregion des Polled-Locus kartiert.
2 Literatur
2 Literatur
2.1 Hornentwicklung und Aufbau des Hornes
Das Horn der Hauswiederkäuer setzt sich aus einer knöchernen Grundlage und einem haar- sowie drüsenlosen Hautüberzug mit stark verhornter Epidermis zusammen. Es kommt in der Regel bei beiden Geschlechtern vor, wobei die Hörner beim männlichen Geschlecht stärker entwickelt und breiter an der Basis sind als beim weiblichen Tier. Der Hornfortsatz (Processus cornualis) des Stirnbeines (Os frontale) bildet die Grundlage des Hornes. Er entwickelt sich erst einige Wochen nach der Geburt sichtbar und ist in den ersten Lebensmonaten ein massives Gebilde, das mit etwa 6 Monaten durch das Einwachsen der Stirnhöhlenschleimhaut pneumatisiert wird. Beim Rind entsteht dieser Fortsatz als direkte Wucherung des Stirnbeines, ist also eine Exophyse (ZIETZSCHMANN 1942). Bei Schaf und Ziege dagegen wird der Hornfortsatz als isolierter, periostaler Knochenkern angelegt, der sich sekundär mit dem Stirnbein vereinigt (HABERMEHL 1996). Das Hornwachstum unterliegt einer periodisch unterschiedlich starken Ausbildung in Abhängigkeit von Trächtigkeiten beim weiblichen Tier, Krankheiten und Futterversorgung. Jedoch bleibt es zeitlebens bestehen. Die Ausprägung der Hörner unterliegt innerhalb und zwischen den Rassen sehr großen Variationen. Als hornlos (polled) bezeichnet man Tiere, die keinerlei Horngebilde aufweisen. Tiere mit kleinen oder verkümmerten, nur lose mit der Haut verbundenen Hörnern oder Hornschuppen an den Hornansatzstellen gelten nicht als hornlos (LANGE 1989). Neben der Hornlosigkeit treten aber auch in vielen Rassen vereinzelt Tiere mit unvollständiger Hornausbildung auf. Diese werden als Wackelhörner (scurs) bezeichnet.
Wackelhörner weisen keine knöcherne Verbindung mit dem Stirnbein und keine Pneumatisierung auf (WILLIAMS u. WILLIAMS 1952; SIEGERT 1955; BREM et al.
1982).
2.2 Hornlosigkeit und Vererbung der Hornausprägung
Die Hornlosigkeit beim Rind wird schon im dritten Jahrtausend vor Christi im Alten Ägypten beschrieben. Rinderrassen mit einem großen Anteil von hornlosen Tieren waren in Europa vor allem in Skandinavien, Island, Estland, Nordrussland, Irland und Schottland anzutreffen. Die bekanntesten Rassen, in denen die Hornlosigkeit fixiert ist, sind Aberdeen Angus, Galloway, Polled Hereford und Red Poll. Diese Mutation der Hornausprägung tritt neben den hornlosen Rassen auch in Rassen mit überwiegend gehörnten Tieren wie z.B. beim Deutschen Fleckvieh, bei Deutschen Holsteins, Deutschem Braunvieh, Charolais und Limousins auf. Das Auftreten der Spontanmutationen vom gehörnten zum hornlosen Phänotyp wird von WHITE und IBSEN (1936) auf eine Rate von 1:20000 und von ROSENBERGER (1981) auf 1:50000 bis 1:100000 geschätzt. Tiere, die eine solche Mutation aufweisen, können zur Einführung der Hornlosigkeit in eine gehörnte Rasse genutzt werden.
Andererseits kann man die Hornlosigkeit aber auch durch das Einkreuzen von Tieren hornloser Rassen und anschließender Verdrängungskreuzung einführen. Auf der Grundlage von Kreuzungsversuchen zwischen hornlosen Galloways und Rindern der Rasse Holstein Friesian entwickelten WHITE und IBSEN (1936) ein Modell, bei dem die Hornlosigkeit von einem Genort und die Hornausprägung von mehreren Loci beeinflusst wird.
Der H-Locus ist der Genort, der für die Ausprägung der mit dem Stirnbein verwachsenen echten Hörner verantwortlich. Für ihn ist nur das Allel H beschrieben.
Der Polled-Locus mit den Allelen P (hornlos) und p (gehörnt) ermöglicht die Ausbildung der Hornlosigkeit, wobei das P-Allel dominant über p und epistatisch über das Allel H am Genort für Hornbildung ist. Bei Bos indicus hat das African Horn Gen mit den Allelen Ha und ha eine geschlechtsabhängige Wirkung auf die Hornbildung, spielt jedoch in europäischen Rinderrassen (Bos taurus taurus) keine Rolle. Die Wackelhornausbildung (Scurs) wird von einem Genort mit den Allelen Sc und sc beeinflusst. Er wirkt bei Tieren mit dem Polled-Genotyp P- epistatisch, allerdings ist diese Epistasie geschlechtsabhängig. Es wird angenommen, dass männliche Tiere, die heterozygot Sc sc sind, auch am Polled-Locus heterozygot sein
4 Literatur
müssen, um Wackelhörner ausprägen zu können, während solche weiblichen Tiere hornlos sein werden. Unabhängig vom Geschlecht zeigen alle Tiere, die homozygot Sc Sc sind, Wackelhörner, wenn sie mindestens ein P-Allel besitzen (LONG u.
GREGORY 1978). BREM et al. (1982) haben die Vererbung der Hornlosigkeit beim Deutschen Fleckvieh untersucht. Sie kamen dabei zu der Ansicht, dass beim Deutschen Fleckvieh das Allel Ha nicht vorhanden ist und der Genotyp am H-Locus mit homozygot HH für die Hornausbildung fixiert ist. BRENNEMAN et al. (1996) vertreten eine Vererbungshypothese mit drei Genloci. Hierbei werden sowohl die Hornlosigkeit als auch die Hornausprägung allein vom Polled-Locus kontrolliert. Der Scurred-Locus kontrolliert die Ausprägung von Wackelhörnern und das African Horn Gen wirkt als Sonderform der geschlechtsbeeinflussten Hornentwicklung bei Rassen mit Zebuanteil auf die Hornausbildung ein. LAMMINGER (1999) stellt beim Deutschen Fleckvieh Inkonsistenzen in den Erbgangsmodellen von BREM et al.
(1982) und LONG u. GREGORY (1978) fest. Durch die Einführung des maternalen Imprinting für das Sc-Allel können diese Inkonsistenzen zwischen den Generationen in der Ausbildung von Wackelhörnern erklärt werden.
2.3 Hornlosigkeit beim Deutschen Fleckvieh
Das Fleckvieh gilt als Zweinutzungsrasse, welches vor allem in den Alpen- und Voralpenländern (Deutschland, Österreich, Schweiz, Frankreich und Italien) und Deutschland vor allem in Süddeutschland gezüchtet wird. In den wichtigsten Importländern Nord- und Südamerika, Großbritannien, Südafrika und Australien wird es vorwiegend als Fleischrind gehalten und gezüchtet (KRÄUSSLICH, 1981;
SAMBRAUS, 1996), während in Ungarn und der Schweiz das Fleckvieh durch Einkreuzung von Red Holstein Bullen einseitig auf Milchleistung gezüchtet wurde. Es wird als mittelgroßes bis großwüchsiges Rind mit kräftigen Knochen beschrieben.
Das Haarkleid ist gescheckt, gelegentlich auch gedeckt und variiert in der Farbe von hellgelb bis dunkelrotbraun. Die weiße Färbung des Kopfes wird dominant vererbt (KRÄUSSLICH, 1981; FRAHM, 1990 und SAMBRAUS, 1996). Das Deutsche
Fleckvieh ist Ergebnis einer in der ersten Hälfte des 19. Jahrhunderts begonnenen Verdrängungskreuzung einheimischer Landschläge mit aus der Schweiz importierten Simmentalern. Die gezielte Zucht auf Hornlosigkeit wird beim Fleckvieh seit 1974 bearbeitet (RÖHRMOSER UND WINTERSPERGER 1996). In einigen bayerischen Betrieben mit Milchleistungsprüfung (MLP) wurden einige wenige hornlose Tiere (Mutationen) gefunden, die in einem Zuchtversuch der Bayerischen Landesanstalt für Tierzucht eingesetzt wurden. Vor allem die Bullen „Holler 14/29196“ und
„Embargo 99/99882“ hatten großen Anteil bei der Einführung des Merkmals Hornlosigkeit im Deutschen Fleckvieh. Seit 10 Jahren besteht eine Nachkommenprüfung für hornlose Jungbullen der Rasse Deutsches Fleckvieh. Die besten hornlosen Jungbullen mit interessanter Abstammung werden in Zusammenarbeit mit einigen bayerischen Besamungsstationen im Prüfeinsatz an gehörnte Fleckviehkühe in MLP-Betrieben angepaart. Folgende Daten werden dabei im Rahmen der MLP erhoben und ausgewertet: der Hornstatus bei einer Stichprobe von 30 Nachkommen, Daten über den Kalbeverlauf und Daten über die Fleischleistungsprüfung bei den männlichen Nachkommen. Außerdem werden eine gelenkte Feldprüfung in Ringbetrieben und eine ungelenkte Feldprüfung durchgeführt. Weitere Daten werden von weiblichen Nachkommen im Rahmen der Milchleistungs- und Melkbarkeitsprüfung und Exterieurbeurteilung erhoben. Bei homozygoten Vätern wird eine Stationsprüfung mit 10 bis 12 Nachkommen durchgeführt (RÖHRMOSER UND WINTERSPERGER 1996).
6 Literatur
2.4 Genomkartierung
2.4.1 Genetische Kartierung
Markerkarten sollen möglichst viele, gleichmäßig über das Genom verteilte hochpolymorphe Markerloci beinhalten. Somit können unbekannte Gene bei Nachweis von Kosegregation mit einem oder mehreren chromosomal bereits lokalisierten DNA-Markern einer Chromosomenregion zuordnen. Diese Region kann man mittels zusätzlicher Marker und diverser Klonierungsstrategien soweit einengen, dass man die genaue Position des Gens erhält. Dies wird als positionelles Klonieren bezeichnet (COLLINS 1992). Es wird zwischen genetischen und physikalischen Genkarten unterschieden. Die genetische Karte wird durch Kopplungsanalyse erstellt (MORTON 1955). Die Grundlage der Kopplungsanalyse ist das Auftreten von Rekombinationsereignissen. Bei der Meiose kann es durch Aneinanderlagern homologer Chromosomen zu einem Crossing-over kommen. Das Austauschen der Chromosomenabschnitte führt zur Rekombination. Die Abstände zwischen den Genen oder genetischen Markern werden aufgrund der beobachteten Rekombinationshäufigkeiten zwischen zwei oder mehreren Genorten bei der Vererbung von Haplotypen innerhalb von Familien bestimmt. Die genetische Distanz zwischen zwei Loci ergibt sich dabei aus der Rekombinationsfrequenz und wird in centiMorgan (cM) angegeben. 1 cM entspricht etwa einer Rekombinationsfrequenz von ungefähr 1 %, also dem Auftreten von einem Crossing-over auf 100 Meiosen.
Ein cM auf einer genetischen Karte entspricht einem Abstand von durchschnittlich 1000000 Basenpaaren (bp). Je weiter zwei Genorte auf einem Chromosom voneinander entfernt liegen, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Rekombinationsereignis auftritt. Mit Kartierungsfunktionen, z.B. nach Kosambi, kann die Rekombinationsfrequenz (θ) in die genetische Distanz umgerechnet werden (OTT 1991). Bei freier Rekombination zwischen zwei Genorten beträgt die Rekombinationsfrequenz θ = 0,5. Je geringer der Abstand zwischen den Genorten auf einem Chromosom ist, desto häufiger werden sie gekoppelt vererbt, dabei ist 0 ≤ θ < 0,5. Bei der Kopplungsanalyse wird θ am genotypisierten Familienmaterial
geschätzt und getestet, wie groß die Wahrscheinlichkeit für Kopplung ist. Dabei wird ein LOD-Score [logarithm of the odds: Z(θ)= log10 L(θ)/ L(0,5)] als kritischer Wert bestimmt. Der LOD-Score ist ein Maß, um beim Test die Nullhypothese mit freier Rekombination, also keine Kopplung, zu verwerfen. Ist der LOD-Score für die maximierte Likelihoodfunktion ≥ 3, so betrachtet man die Genorte als gekoppelt. Bei einem Wert gleich oder kleiner als -2 kann man die Kopplung für die betrachteten Genorte ausschließen. Zur Durchführung von Kopplungsanalysen stehen verschiedene Computerprogramme, z.B. LINKAGE (LATHROP u. LALOUEL 1984) und CRI-Map (LANDER u. GREEN 1987) zur Verfügung.
Für die Kopplungsanalyse werden ein geeignetes Familienmaterial und hoch- polymorphe Marker benötigt. Je polymorpher sich ein Marker verhält, desto höher ist die Chance informative Meiosen zu beobachten, bei denen die Weitergabe der Markerallele an die Nachkommen verfolgt werden kann (FRIES 1993). Als Polymorphismus bezeichnet man das Auftreten von verschiedenen Varianten (Allelen) an einem Genort. Zu den DNA-Loci, die als genetische Marker eingesetzt werden, gehören z.B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs), SNPs (single nucleotide polymorphisms), SSCPs (single strand conformation polymorphisms) und Mikrosatelliten. RFLPs werden beobachtet, wenn durch Basenaustausch die Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease verändert wird. Das Fehlen oder Vorhandensein der betreffenden Schnittstelle in einem DNA- Fragment kann durch gelelektrophoretische Auftrennung nachgewiesen werden.
Dabei werden die durch Restriktionsenzymabbau entstandenen unterschiedlichen Fragmente als Allele betrachtet. Häufig sind RFLP-Marker nur diallel (WHITE u.
LALOUEL 1988) und daher für Kopplungsanalysen oft nicht ausreichend informativ.
Mikrosatelliten-Marker sind dagegen wesentlich polymorpher als RFLPs. Sie bestehen in der Regel aus einer Aneinanderreihung von Mono-, Di-, Tri- oder Tetra- Nukleotidsequenzen, wobei die Motivlänge zwischen 1-10 Basenpaare variieren kann (TAUTZ 1989). Die Anzahl der Wiederholungen dieser Nukleotidsequenzen beträgt bis zu 30 und mehr, wodurch hintereinander liegende, sogenannte Tandem- Wiederholungen entstehen (HAERNE et al. 1992). Die CA-Dinukleotid- wiederholungen stellen die größte Klasse dar. Sie sollen laut BARON et al. (1992)
8 Literatur
und TAUTZ (1989) 50000 bis 100000 mal im Säugergenom vorkommen. Es sind demnach alle 10 bis 100 kb Mikrosatelliten-Kopien zu erwarten (STALLINGS et al., 1991; WINTERO et al., 1992), jedoch wird die Häufigkeit von Mikrosatelliten im Rindergenom von SOLINAS-TOLDO et al. (1993), VAIMAN et al. (1994) und MOORE (1994) niedriger geschätzt.
2.4.2 Physikalische Kartierung
Die physikalische Kartierung dient der Positionierung eines Genlocus auf den Chromosomen und gibt die Entfernung zu anderen Genen auf demselben Chromosom in absoluten Werten an. Die genaueste Methode ist die DNA- Sequenzierung, mit der die Abstände zwischen den Genen auf dem Chromosom in Basenpaaren ausgedrückt werden können. Weitere Methoden für die Erstellung einer physikalischen Karte sind z.B. die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und das Radiation Hybrid Mapping. Die zytogenetische Technik der Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung (FISH, SOLINAS-TOLDO et al., 1993) bedient sich der Darstellung von DNA-Sonden mit einer Größe von mindestens mehreren kb, auf Metaphase- Chromosomen. Die Zellen werden in der Metaphase auf einem Objektträger fixiert und denaturiert. Die doppelsträngige DNA wird dadurch in Einzelstrang DNA überführt. Die DNA-Sonde, mit der nun die Hybridisierung erfolgt, ist durch den Einbau modifizierter Nukleotide markiert. Danach erfolgt ein Auswaschen der überschüssigen Sondenmoleküle und Inkubation in einer Lösung, die ein fluoreszenzmarkiertes Affinitätsmolekül enthält. Dieses Molekül bindet dabei an das Reportermolekül der markierten Sonde. Positive Signale von Genen kann man als zwei fluoreszierende Signale erkennen. Sie entsprechen der Sonde, die an die beiden Schwesterchromatiden gebunden hat. Der Vorteil der FISH-Methode besteht darin, dass sie schnell Ergebnisse liefert, welche man im Fluoreszenzmikroskop leicht erkennen kann. Das Radiation Hybrid (RH) Mapping ist eine Methode, bei der durch Bestrahlung von z.B. bovinen Zellen mit Röntgen- oder γ-Strahlung Radiation Hybrid Panels erstellt werden (GOSS u. HARRIS 1975). Mit genau dosierten
Röntgenstrahlen spaltet man die Chromosomen der Hybridzelle an zufälligen Positionen in relativ kurze Fragmente. Die Länge der erwarteten Fragmente wird über die Bestrahlungsdosis gesteuert. Um daraus die Fragmente der Chromosomen zu isolieren, verschmilzt man die letal bestrahlten Hybridzellen mit einer Nagerzelllinie (z.B. Hamster- oder Mauszelllinien). Ein Selektionssystem sorgt dafür, dass nur Hybridzellen überleben (WALTER et al. 1994). Die entstandenen Bestrahlungshybridzellen enthalten verschiedene Fragmente der Chromosomen, die an beliebigen Stellen in die Nagetierchromosomen integriert wurden. In Abbildung 1 wird die Herstellung konventioneller Bestrahlungshybride am Beispiel menschlicher Zellen dargestellt.
10 Literatur
X rays
Human fibroblast cell Recipient rodent cell line
Selectable marker Human Chromosomes
Rodent Genome
Rodent Genome
Fusion
Selection
Whole Genome Radiation Hybrid
lethally Irradiated Selected against
Human fibroblast cell Recipient rodent cell line
Abb. 1: Herstellung konventioneller Bestrahlungshybridzellen
Es ist möglich, die lineare Anordnung und die physikalische Distanz zwischen den Genen zu schätzen, indem die Häufigkeit, mit der gekoppelte Gene zusammen in ein Hybrid gebracht werden, gemessen wird (GOSS u. HARRIS 1975; COX et al. 1990).
Dazu werden die Genorte unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion (PCR) an den Zelllinien typisiert und die Ergebnisse werden statistisch (RHMAP 3.0) zur Kartierung ausgewertet. Die Anordnung der Marker und deren physikalische Distanz zueinander kann man aus der Kombinationshäufigkeit, mit der die Marker gemeinsam in einem Zellhybrid vorkommen, ableiten. Je enger zwei DNA-Sequenzen auf einem Chromosom benachbart sind, um so geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie durch eine zufällige Bruchstelle getrennt werden. Allerdings enthalten die Hybridzellen häufig mehr als ein chromosomales Fragment. Dies erschwert die Schätzung der Häufigkeit eines Bruchs zwischen zwei Markern, welche durch den Wert θ definiert wird. Zwei Marker A und B können zusammen in einem Hybrid vorhanden sein, wenn sie nicht durch einen Bruch getrennt wurden und zusammen auf einem Fragment liegen oder wenn sie durch einen Bruch getrennt wurden und dann auf zwei verschiedenen Fragmenten in einer Hybridzelle liegen.
Gleichermaßen kann ein Fehlen der Marker A und B aus einem Bruch zwischen A und B und gleichzeitigem Verlust beider Fragmente resultieren, oder A und B sind nicht durch einen Bruch getrennt und fehlen durch den Verlust eines Fragments.
Deshalb ist es nicht möglich die Bruchfrequenz zwischen zwei Markern direkt aus der in den Hybriden beobachteten Markersegregation zu bestimmen. Wenn jedoch vorausgesetzt wird, dass das Auftreten von Brüchen zwischen zwei Markern unabhängig vom Verbleib der Marker und der Verbleib eines Fragments unabhängig von jedem beliebig anderen Fragment ist, dann kann die Bruchfrequenz θ nach folgender Gleichung geschätzt werden:
θ = [(A+B-) + (A-B+)] / [T(RA + RB - 2 RARB)]
Dabei entspricht (A+B-) der beobachteten Anzahl Hybride, welche Marker A, aber nicht Marker B enthalten, und (A-B+) entspricht der beobachteten Anzahl Hybride, welche Marker B, aber nicht Marker A enthalten. RA entspricht der Fraktion aller auf Marker A untersuchten Hybride, die A enhalten. RB entspricht der Fraktion aller auf B untersuchten Hybride, welche B enthalten. Der Wert θ entspricht der
12 Literatur
Rekombinationshäufigkeit bei der genetischen Kartierung, variiert hier jedoch von 0 (die Marker werden nie getrennt) bis 1 (die Marker werden immer getrennt). Da der Abstand zwischen zwei Markern, die auf einem Chromosom sehr weit voneinander entfernt liegen, von θ als zu gering angegeben wird, erlaubt eine Kartierungsfunktion mit D = -ln(1-θ) eine genauere Abstandsbestimmung (COX et al. 1990). D wird in centiRays (cR) gemessen und, da der Wert von der Strahlendosis abhängig ist, bezieht man D immer auf eine rad-Menge. Eine Entfernung von 1 cR5000 zwischen zwei Markern bedeutet also, dass es bei bei einer Bestrahlung mit einer Röntgenstrahlendosis von 5000 rad mit einer Häufigkeit von einem Prozent zu einem Bruch zwischen diesen Markern kommt. Von Vorteil ist, dass bei dieser Kartierungsmethode keine hochpolymorphen DNA-Marker benötigt werden, sondern es genügen bereits spezifische DNA-Sequenzen für die Auswahl geeigneter PCR- Primer zur Amplifikation eines Genortes (COX et al. 1990; WALTER et al. 1994;
YANG et al. 1998). Die RH-Karten besitzen ein 15 bis 20-fach höheres Auflösungsvermögen als die mit Kopplungsanalysen berechneten Linkage-Karten (WALTER et al., 1994). Das Auflösungsvermögen kann gezielt gesteuert werden, da es von der Art und der Intensität der verwendeten Strahlung abhängt (COX et al.
1990; WALTER et al. 1994).
2.4.3 Vergleichende Genomkartierung
Ziel der vergleichenden Genomkartierung ist es, homologe Chromosomenabschnitte zwischen den verschiedenen Spezies darzustellen. Außerdem können die Informationen von bereits existierenden detaillierten Genomkarten (z.B. von Mensch und Maus) auch für weniger gut kartierte Arten nutzbar gemacht werden. Hierzu untersucht man sowohl einzelne Genorte und deren Lage auf den Chromosomen als auch die Anordnung ganzer Gruppen von Genen, die zwischen den Spezies konserviert sind (O´BRIEN et al., 1993; WOMACK u. MOLL 1986; WOMACK 1994).
Dadurch ist es auch möglich, Homologien zwischen humanen und bovinen Chromosomenabschnitten aufzuzeigen (FRIES et al. 1993). Für die vergleichende
Genomkartierung finden in der Regel Gene oder codierende Regionen Verwendung, deren Anwendung speziesübergreifend möglich ist und deren Genfunktion bekannt und charakterisiert ist. Als Typ-I Marker oder Ankergenorte können sie, über das Genom verteilt, zur Verknüpfung von Spezieskarten dienen (O´BRIEN et al. 1993) und für Kandidatengenanalysen nützlich sein (SOLINAS-TOLDO et al. 1993;
FERRETTI et al. 1997). Auch Mikrosatelliten, die von speziesspezifischen Primersequenzen flankiert werden, können bei nah verwandten Arten, wie z.B. Rind und Schaf, als Marker für die Kartierung bei diesen genutzt werden (CRAWFORD et al. 1995). Selbst bei entfernter verwandten Arten wie Mensch, Schwein und Rind, lassen sich konservierte Mikrosatelliten finden und amplifizieren (MOORE et al.
1991; SUN u. KIRKPATRICK 1996). Mit der Zoo-FISH-Methode bietet sich die Möglichkeit, auch über größere Bereiche konservierte Regionen zwischen den Spezies aufzufinden (SCHERTAN et al. 1994) Chromosomale Homologien zwischen Mensch und Schwein (RETTENBERGER et al. 1995) sowie zwischen Mensch und Rind (SOLINAS-TOLDO et al. 1995) wurden auf diese Weise dargestellt. Eine Verfeinerung der vergleichenden Kartierung kann durch die Kartierung an einem Radiation Hybrid Panel erreicht werden. 1998 erfolgte eine vergleichende Kartierung des Rinderchromosom 19 (BTA19) und des humanen Chromosoms 17 (HSA17) (YANG u. WOMACK 1998). Eine vergleichende Kartierung des Rinderchromosoms 1 (BTA1) und HSA21 erfolgte 1999 (Abb. 2). Die Kartierung von humanen Genen auf dem proximalen Abschnitt von BTA1 zeigte dabei Inversionen zwischen den syntänischen Regionen bei Rind und Mensch (REXROAD et al. 1999 b). BAND et al.
(2000) gelang die Anordnung von zahlreichen humanen EST-Sequenzen (expressed sequence taggs) an allen Rinderchromosomen. Die vollständige Sequenz des humanen Chromosoms 21 (HATTORI et al., 2000), bietet die Möglichkeit zur Anordnung bisher nicht kartierter Gene auf BTA1 über die Vergleichende Genomkartierung.
14 Literatur
(Mb)
HSA21
APP
ETS2
BTA1
AGLA17 KAP8 IFNAR BM6438 TGLA49 BSMIT BMS1928 APP SOD1 BMS2321
TGLA57 CSSM4 BMS2725
POUF1
ETS2
6,0 5,9 18,1 19,7 22,7 24,8 30,8 49,8 54,0
77,7 30,1 44,7 136,1
706,7 STCH
1,41
12,83
SOD1
18,61
IFNAR
20,27
ATP5O
20,85
SLC5A3 (SMIT)
21,02
25,75
ATP5O
(cR ) 5000 Distanzen in cR 5000
19,7 30,8
5,9
24,8
54,0
Abb. 2: RH-Karte für den proximalen Abschnitt von BTA1 im Vergleich zu HSA21 (nach REXROAD und WOMACK, 1999 und BAND et al., 2000)
2.5 Stand der Genomkartierung beim Rind
Bovine genetische Karten sind von FRIES et al.(1993), BARENDSE et al. (1994), BISHOP et al. (1994), MA et al. (1996), BARENDSE et al. (1997) und KAPPES et al.
(1997) veröffentlicht worden. Die Karte von BARENDSE et al. (1997) hat eine Länge von 3567 cM für männliche und 3765 cM für weibliche Tiere und deckt mit 746 Markern über 95 % des bovinen Genoms ab. Sie ist in der Cattle Genome Database (CGD) enthalten und im Internet frei zugänglich (URL:http://spinal.tag.csiro.au). Die Karte von KAPPES et al. (1997) (URL:http://sol.marc.usda.gov) enthält 1250 Marker und deckt 2990 cM ab. Sie hat einen durchschnittlichen Markerabstand von 2,5 cM und ist somit dichter als die Karte von BARENDSE et al. (1997) mit einem Markerabstand von durchschnittlich 5,3 cM. Einen Überblick über alle zur Zeit verfügbaren Karten erhält man im Anubis Map Screen, welcher im Internet über das Roslin Institute zugänglich ist (URL:http://www.ri.bbsrc.ac.uk/anubis/). Hier besteht die Möglichkeit zytogenetische, genetische und eine über Radiation Hybrid Mapping erstellte Karte nebeneinander darzustellen und zu vergleichen.
Abbildung 3 zeigt beispielhaft den Stand der Genomkarte des proximalen Abschnitts von BTA1 nach VAIMAN et al. (1997) und BARENDSE et al. (1998). In der Veröffentlichung von VAIMAN et al. (1997) konnten die Marker KAP8 und INRA117 nicht eindeutig lokalisiert werden und sind hier deshalb eingeklammert dargestellt.
Sie wurden in dem 5 cM großen Bereich zwischen SOD1 und DVEPC117 positioniert, ohne die genaue Lokalisation oder die Abstände anzugeben. Bei BARENDSE et al. (1998) ließen sich die Marker ARO9, ARO24, BMS1928, IFNAR1, INRA212, KAP8 und SLC5A3 nicht mit einem LOD-Score ≥ 3 anordnen. Sie wurden mit Entfernungen zu dem am nächsten gelegenen angeordneten Markern veröffentlicht. So liegen z. B. ARO9, BMS1928 und KAP8 in 2,0 cM Abstand zu INRA117.
16 Literatur
Abb. 3: Genetische Karten vom proximalen BTA1-Abschnitt (Distanzen in cM)
Inzwischen stehen mehrere mittels Radiation Hybrid Mapping erstellte physikalische Karten des BTA1 zur Verfügung (REXROAD et al., 1999a, b; REXROAD et al., 2000;
BAND et al., 2000). Dabei konnten bekannte Mikrosatellitenmarker zu einigen Genen bzw. Sequenzen aus der Genkarte von Chromosom 21 des Menschen (HSA21) angeordnet werden (Abb. 4).
EST0601 0
ATP5O EST1413 BM6438 EST2187 PRSS7 RM095 STCH 20
40 60
BM6438 AGLA17 KAP8 IFNAR TGLA49 BSMIT BMS1928 APP SOD1 5,9
5,8 17,8 19,4 22,4 23,8 27,1 45,9
BAND et al. 2000 REXROAD et al. 1999
Abb. 4: RH-Karten vom proximalen Abschnitt von BTA1 (Distanzen in cR5000)
BM6438 AGLA17
BARENDSE et al. 1998 2,0
3,0 3,0
4,0 4,0 5,0
INRA117 TGLA49, SOD1
VAIMAN et al. 1997 INRA212 TGLA49, SOD1
DVEPC123 (KAP8) (INRA117) DVEPC088
DVEPC141
2.6 Kartierung des Gens für die Hornlosigkeit beim Rind (Polled-Locus) GEORGES et al. (1993) konnten in einem Genomscan eine Kopplung des Polled- Locus mit den Markern GMPOLL-1 (=TGLA49) und GMPOLL-2 (=AGLA17) feststellen. Die Zwei-Punkt-Kopplungsanalyse erfolgte an neun väterlichen Halbgeschwistergruppen der Rassen Hereford x Shorthorn, South Devon und Salers.
Die Familien, die aus jeweils einem heterozygot hornlosen Bullen, meist gehörnten Kühen und 138 hornlosen oder gehörnten Nachkommen bestanden, wurden mit 38 Mini- und 233 Mikrosatelliten untersucht. GMPOLL-1 und GMPOLL-2 entsprechen den auf der International Bovine Reference Panel-Karte (IBRP-Karte) lokalisierten Mikrosatelliten-Markern TGLA49 und AGLA17 (BRENNEMAN et al. 1996). Eine relative Position des Polled-Locus zu den Markern konnte nicht festgelegt werden.
TGLA49 und AGLA17 ließen sich durch Untersuchung an einem bovinen somatischen Zellhybrid-Panel in der Nähe des Superoxid-Dismutase 1-Gens (SOD1) anordnen, welches auf BTA1 kartiert wurde. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde der Polled-Locus auf dem proximalen Abschnitt von BTA1 in der Nähe des Zentromers platziert (GEORGES et al. 1993). SCHMUTZ et al. (1995) konnten die von GEORGES et al. (1993) veröffentlichte Lokalisation bestätigen, bei einer Kopplungsanalyse an fünf Charolais Familien (63 Nachkommen) mit den Markern TGLA49 und BM6438, der Robertson‘schen Translokation 1:29 und dem Polled- Locus wurde keine Rekombination zwischen den Markern und dem Polled-Locus festgestellt. Die relative Position des Polled-Locus zu den Markern konnte jedoch ebenfalls nicht bestimmt werden. BRENNEMAN et al. (1996) führten eine Kopplungsanalyse mit weiteren, über das gesamte BTA1 verteilten Markern durch.
Die Zweipunkt- und Multilocus-Kopplungsanalyse wurde mit 13 Markern an 209 Nachkommen aus gehörnten Bos indicus (Brahman) x hornlosen Bos taurus (Aberdeen Angus) Kreuzungen durchgeführt, wobei nur der Marker TGLA49 signifikante Kopplung mit dem Polled-Locus zeigte. Die Lokalisation des Polled- Locus auf dem proximalen Abschnitt von BTA1 wurde bestätigt. Obwohl keine signifikante Kopplung mit den übrigen Markern erzielt werden konnte, plazierten die
18 Literatur
Autoren den Polled-Locus proximal von TGLA49. EGGEN et al. (1996) positionierten den Polled-Locus zwischen den Markern BM6438 und INRA212.
In einer weiteren Kopplungsanalyse, die am Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Tierärztlichen Hochschule mit den Markern BM6438, TGLA49, IFNAR, KAP8, INRA212 und INRA117 von BTA1 durchgeführt wurde (HARLIZIUS et al. 1997), konnte auch für die Rassen Fleckvieh und Pinzgauer, die Lokalisation des Polled-Locus auf BTA1 bestätigt werden. Es wurde der Schluss gezogen, dass in allen Bos taurus Rassen ein Gen oder ein Gencluster für den hornlosen Phänotyp verantwortlich ist. Es gelang jedoch auch mit den in dieser Studie untersuchten Tieren nicht, den Polled-Locus in Relation zu den untersuchten Markern anzuordnen.
GRAPHODATSKAYA (1998) hat Familien von Rindern der Rassen Schweizer Simmentaler, Deutsches Fleckvieh, Pinzgauer und Nelore bezüglich der Lokalisation des Genortes für Hornlosigkeit untersucht und kam zu dem Schluss, dass das Marker-Allel mit der Länge von 116 bp von TGLA49 beim Deutschen Fleckvieh mit einer Sicherheit von 95 % mit dem hornlosen Phänotyp gekoppelt ist. Da sie bei den anderen Rassen keine Assoziation zu diesem Mikrosatelliten-Allel finden konnte, wurde vermutet, dass die Hornlosigkeit auf verschiedenen Mutationen beruht.
Der Polled-Locus wurde von EGGEN (1998) als Horned/Polled Syndrome (HPS) in der bovinen Datenbank BovMap aufgenommen (URL:http://locus.jouy.inra.fr/). Die Lokalisation des HPS erfolgte anhand von 28 informativen Meiosen der USDA- Referenzfamilien (U.S. Department of Agriculture) zwischen den Markern BM6438 und TGLA49 (KAPPES et al. 1998).
Am Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung untersuchten EICHLER et al.
(1999) 12 Marker an 366 Nachkommen heterozygot hornloser Bullen der Rassen Deutsches Fleckvieh, Holstein, Pinzgauer, Welsh Black und Kreuzungstieren. Es konnten vier polymorphe Marker (BM6438, SOD1MICRO2, ARO9 und BMS1928) in einem Intervall von 4,3 cM angeordnet werden. Der Polled-Locus wurde außerhalb dieses Intervalls, 2,1 cM proximal von BM6438 lokalisiert (Abb. 5).
ASAI et al. (2000) führten einen totalen Genomscan in vier, miteinander verwandten Familien der kanadischen Fleischrinder Referenzherde (Canadian Beef Cattle
Reference Herd) durch, in denen nur die männlichen Nachkommen Wackelhörner aufwiesen. Alle wackelhorntragenden männlichen Tiere waren heterozygot bezüglich des Polled-Locus.
Der Scurred-Locus, der die Ausprägung von Wackelhörnern kontrolliert, konnte in dieser Untersuchung auf Chromosom 19 (BTA19) kartiert werden.
Abb. 5: Lokalisationen des Polled-Locus auf BTA1
2.7 Lokalisation der Gene für Hornlosigkeit bei Schaf und Ziege
Die Hornausprägung wird beim Schaf von zwei Loci kontrolliert, dem Ho- und dem Halo hair-Locus (Ho und HH1) (COGNOSAG 1989). Der Ho-Locus besitzt die drei Allele HoP, Ho+ und Hoh1 (DOLLINGS 1970). Die Hornlosigkeit wird durch HoP kontrolliert. Dabei wirkt dieses Allel bei Böcken unvollständig, bei Auen vollständig dominant über die anderen Allele. Ho+ produziert Hörner in beiden Geschlechtern, Hoh1 ist für eine geschlechtsspezifische Hornausprägung verantwortlich. Der HH1- Locus kann ebenfalls die Hornausprägung bei Schafen initiieren (DRY 1955), jedoch hat er außerdem Einfluss auf die Vliesbildung. MONTGOMERY et al. (1996) konnten den Ho-Locus mit Kopplungsanalyse auf dem Schafchromosom 10 (OAR10) lokalisieren, welches homolog zu BTA12 ist (POPESCU et al. 1996). Es wird vermutet, dass der Ho-Locus dem African Horn Gen des Rindes entsprechen
SOD1MICRO2 POLLED BM6438
ARO9 BMS1928 2,0
2,0 1,0 1,0
EICHLER et al. 1999 POLLED
AGLA17 BM6438 TGLA49 BMS1928 INRA117 0,1
0,2 5,0 1,5 1,6
KAPPES et al. 1998
20 Literatur
könnte. Die Lokalisation von HH1 wurde nicht untersucht, es wird jedoch angenommen, dass es sich um ein dem Polled-Locus orthologes Gen handeln könnte, da OAR1 BTA1 entspricht und der Marker TGLA49 in der Nähe eines Genclusters auf OAR1 liegt, der Einfluss auf die Keratinbildung hat (CRAWFORD et al. 1995; WOOD et al. 1992).
Bei der Ziege ist die Hornlosigkeit mit dem Merkmal der Intersexualität gekoppelt.
Die Hornlosigkeit wird von einem Genort mit den Allelen P (hornlos) und p (gehörnt) kontrolliert (ASDELL et al. 1944; SOLLER et al. 1963) und dominant vererbt. Die Intersexualität folgt einem rezessiven Erbgang (SOLLER et al. 1963). Weibliche homozygot hornlose Ziegen zeigen Variationen der Geschlechtsorgane von fast normal weiblich bis fast männlich (HAMERTON et al. 1969). Heterozygot hornlose weibliche Ziegen zeigen eine erhöhte Fruchtbarkeit gegenüber gehörnten Tieren. Die Region, die für die Hornausbildung und die Intersexualität verantwortlich ist, wurde durch Kopplungsanalyse auf dem distalen Abschnitt des Ziegenchromosom 1 (CHI1) lokalisiert. Es wurden bisher keine Rekombinationen zwischen diesen Merkmalen beobachtet (SOLLER u. ANGEL 1964). Daher wird angenommen, dass beide Merkmale von zwei sehr eng gekoppelten Genen kontrolliert werden oder Pleiotropie vorliegt. Dabei wird die Hornlosigkeit autosomal dominant und die Intersexualität autosomal rezessiv vererbt. VAIMAN et al. (1999) konnten den Genort für das Polled-Intersex-Syndrome (PIS) in der Region zwischen den Genen ATP1B (ATPase, Na+/K+ transporting, beta 3 polypeptide) und COP (coatomer protein complex) auf dem Ziegenchromosom 1q43 anordnen. Diese ca. 1 cM umfassende Region ist homolog zu dem humanen Chromosomenabschnitt 3q23. Anhand der Ergebnisse aus genetischer, physikalischer und vergleichender Kartierung konnte die Region, in der das PIS-Gen bei der Ziege vermutet wird auf ein ca. 1 Mb großes DNA-Segment eingegrenzt werden.
Außerdem konnte durch Fluoreszenz-in–situ-Hybridisierung ein humaner YAC- Contig auf dem Ziegenchromosom 1q43 kartiert werden. In diesem Contig konnten YAC-Klone (Yeast artificial chromosome) mittels überlappender Sequenzen so angeordnet werden, dass die Genomregion für das Blepharophimosis-Ptosis- Epicanthus-inversus-Syndrome (BPES) abgedeckt ist. Diese Region, die beim
Menschen auf Chromosom 3q23 lokalisiert ist beeinflusst, unter anderem die Entwicklung und Erhaltung der Eierstocksfunktion und enthält ein Kandidatengen für das Polled-Intersex-Syndrome bei der Ziege. Bei diesem Kandidatengen handelt es sich um das FOXL2-Gen (putative forkhead transcription factor gene). In Familien, in denen Fälle von BPES Typ I oder Typ II auftraten, wurden verschiedene Mutationen im FOXL2-Gen nachgewiesen (CRISPONI et al. 2001). SCHIBLER et al. (2000) konnten für diese Region auf dem Ziegenchromosom 1 sechs BAC-Contigs (ICC1-6) konstruieren. PIS wurde in dem 1500 kb großen Contig ICC3 lokalisiert. Der Bereich in dem PIS genetisch lokalisiert ist, konnte aufgrund eines Kopplungs- ungleichgewichts auf einen ca. 0,1 cM (ca. 100 kb) großen Abschnitt eingegrenzt werden. Es wurde festgestellt, dass das Allel 1 des auf Contig ICC3 liegenden caprinen Mikrosatelliten-Markers LSCV098 Assoziation mit PIS zeigt.
2.8 Indirekte Gendiagnose am Polled-Locus
EICHLER et al. (1999) haben einen indirekten Gentest für die Hornlosigkeit beim Rind entwickelt. Bei der indirekten Gendiagnose, die auch bei vielen Erbkrankheiten des Menschen wie z.B. der Duchenneschen Muskeldystrophie, Chorea Huntington und der Cystischen Fibrose (Mukoviszidose) durchgeführt wurde bzw. wird, erfolgt eine Berechnung der Genotypwahrscheinlichkeiten am Genort der jeweiligen Erbkrankheit anhand von Pedigreeinformationen und Typisierungsergebnissen gekoppelter DNA-Marker. Dabei ist das zu untersuchende Gen selber nicht bekannt, aber in einem bestimmten Chromosomenabschnitt zu bestimmten Markern genetisch angeordnet. Beim indirekten Gentest auf Homo- oder Heterozygotie am Polled- Locus wird eine Typisierung der Mikrosatelliten-Marker BM6438, SOD1MICRO2, ARO9 und BMS1928 vorgenommen. Da in den bisher veröffentlichten Karten des Rinderchromosoms 1 Unterschiede bezüglich der Markeranordnung vorhanden sind, und auch hinsichtlich der Lokalisation des Polled-Locus widersprüchliche Ergebnisse veröffentlicht wurden, sollten Tiere mit Rekombinationen innerhalb des untersuchten Intervalls von der Berechnung ausgeschlossen werden. Bei unsicherer Marker- oder
22 Literatur
Genanordnung kann in diesem Fall keine Entscheidung für oder gegen den homozygoten Genotyp getroffen werden, da die Vererbung der Markerallele nicht mehr konkordant mit der Vererbung der den Phänotyp verursachenden Allele geschieht.
Ein Nachteil des Tests besteht darin, dass es zur Zeit auf Grund der genetischen Kartierung des Polled-Locus keinen flankierenden Marker gibt, mit dessen Hilfe sich eventuelle Rekombinationen mit größerer Sicherheit nachweisen lassen. Des Weiteren ist nur unter idealen Voraussetzungen (Bestimmbarkeit der Kopplungs- phase unter Zuhilfenahme von zwei Vorfahrengenerationen, in der auch gehörnte Tiere auftreten) eine Wahrscheinlichkeitsberechnung für die Unterscheidung zwischen homozygoten und heterozygoten Genotypen möglich. Die Kopplungsphase kann nur bestimmt werden, wenn man die Weitergabe des mit P gekoppelten Haplotyps auf die Nachkommen beobachten kann. Der Test verliert seine Aussagekraft, wenn bei einer weiteren Selektion auf Hornlosigkeit in den folgenden Generationen fast nur noch hornlose Tiere auftreten. Der bisherige Stand des Testsystems lässt somit nur in der Anfangsphase der Zucht auf Hornlosigkeit brauchbare Ergebnisse erwarten. Ein Problem bei der Entwicklung des Tests war, dass das zur Kopplungsanalyse verwendete Tiermaterial zum Großteil aus einer stark ingezüchteten Deutsch Holstein Herde stammte, und so die Kartierung vieler Marker nicht ermöglichte. Außerdem stellte es sich für die Analyse als nachteilig heraus, dass häufig hornlose Tiere miteinander verpaart wurden, und sich unter den Eltern keine gehörnten Tiere befanden. Eine Ermittlung der Kopplungsphase der Markerallele war oft nicht möglich, da die Tiere an den Markerorten homozygot und damit uninformativ für die Kopplungsanalyse waren.
BROCKMANN et al. (2000) untersuchten beim Fleckvieh mittels Kopplungsanalyse die gekoppelte Vererbung der Hornlosigkeit mit den Allelen von vier Markern in der Region des BTA1. Für die Analyse wurden Halbgeschwister von drei Bullen mit bekanntem heterozygotem Hornstatus genutzt. Alle 57 Tiere (42 hornlose und 15 gehörnte) zeigten vollständige Kopplung zu den Markern BM6438 und SOD1MICRO2. Für die markergestützte Selektion wurde die Zuverlässigkeit der Vorhersage des Hornstatus der Nachkommen eines Bullen anhand ihrer
Markergenotypen im Vergleich zur elterlichen Haplotypenphase und aus den Allelfrequenzen der mit der Hornlosigkeit gekoppelten Markerallele in der Population bestimmt. Alle Bullen wiesen für die Marker BM6438 und SOD1MICRO2 die gleichen Marker-Allele auf. Identische Kopplungsphasen könnten ein Hinweis auf Verwandtschaft sein, jedoch konnte über 6 Generationen keine Verwandtschaft nachgewiesen werden. BROCKMANN et al. (2000) kamen daher zu dem Schluss, dass die Genotypisierung der Nachkommen an den Markern BM6438 und SOD1MICRO2 ausreicht, um den bevorzugten Haplotypen nachzuweisen und somit auch die Unterscheidung zwischen heterozygot und homozygot hornlosen Tieren zu ermöglichen.
Allerdings verringert sich die Genauigkeit der Vorhersage des Polled-Genotyps, mit der Möglichkeit des Auftretens von Rekombinationen zwischen den paternalen Phasen und der Vererbung des bei gehörnten Muttertieren zufällig vorkommenden bevorzugten Haplotypen.
Der bisherige Forschungsstand bezüglich des Polled-Locus lässt sich wie folgt zusammenfassen:
Die Ausbildung der Hornlosigkeit wird beim Rind durch den sogenannten Polled- Locus mit den Allelen P (hornlos) und p (gehörnt) ermöglicht, wobei das P-Allel dominant über p ist. Der Polled-Locus konnte durch Kopplungsanalysen zentromernah auf dem proximalen Ende des Rinderchromosoms 1 (BTA1) lokalisiert werden. Allerdings ist es bisher nicht gelungen, das Polled-Gen aufzufinden und molekulargenetisch zu charakterisieren. Es wurde ein indirekter Gentest entwickelt, der unter idealen Vorraussetzungen eine Wahrscheinlichkeitsberechnung für die Unterscheidung zwischen homozygot und heterozygot hornlosen Tieren zulässt.
Nachteilig für den Test ist es, dass es aufgrund der genetischen Kartierung des Polled-Locus zur Zeit keine flankierenden Marker gibt, mit deren Hilfe eventuelle Rekombinationen mit hoher Sicherheit nachgewiesen werden könnten.
24 Literatur
Damit ergibt sich für die vorliegende Arbeit folgende Aufgabenstellung:
Zur Verbesserung des bestehenden Testsystems ist es notwendig, neue polymorphe Marker in der Region zu entwickeln und zu kartieren. Die Kartierung dieser Marker mittels Kopplungsanalyse soll an einem Tiermaterial durchgeführt werden, welches die optimalen Anpaarungen (heterozygot hornlose Bullen x gehörnte Mütter) mit der erforderlichen Anzahl von Nachkommen innerhalb einer Rasse enthält.
Die Homologien zwischen BTA1 und dem humanen Chromosom 21 (HSA21) sollen ausgenutzt werden, um über die vergleichende Kartierung mit Hilfe des RH-Mapping eine Feinkartierung des proximalen Abschnitts von BTA1 zu erreichen.
Das FOXL2-Gen, das beim Menschen auf dem Chromosomenabschnitt 3q23 lokalisiert ist, stellt ein Kandidatengen für das Polled-Intersex-Syndrom (PIS) bei der Ziege dar. Da der Chromosomenabschnitt in dem der Polled-Locus des Rindes lokalisiert ist, homolog zu HSA21 ist, ist es eher unwahrscheinlich, dass das FOXL2- Gen auch für die Hornlosigkeit beim Rind ein mögliches Kandidatengen darstellt.
Durch das Auftreten von Chromosomenrearrangements ist dies jedoch nicht völlig auszuschließen und soll deshalb überprüft werden.
3 Methoden
Ein Ziel der Arbeit ist die Feinkartierung des proximalen Abschnitts von BTA1.
Deshalb sollen mit Hilfe des RH-Mapping und der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung neue Genorte in diesem Chromosomensegment kartiert werden. Da HSA21 und der proximale Abschnitt von BTA1 Homologien aufweisen, können die bereits beim Menschen physikalisch kartierten Gene zur vergleichenden Genomkartierung beim Rind eingesetzt werden. Zusätzlich wird das bei der Ziege als Kandidatengen für die Hornlosigkeit diskutierte FOXL2-Gen untersucht. Zur besseren Übersicht sind die angewandten Arbeitsmethoden in einem Flussdiagramm Abbildung 6 dargestellt.
cDNA-Klone oder PCR-Produkt als Sonde
⇓
Radioaktive Hybridisierung auf boviner BAC-Genbank
⇓
Auswertung der Signale ⇒ Positive BAC-Klone
⇓
Platten- + Flüssigkultur (5 ml)
⇓
Mini-BAC-DNA-Präparation ⇓
Restriktionsenzymspaltung ⇒ Agarosegel ⇒ Southern Blot
⇓ ECL-Kontrollhybridisierung mit der Sonde
⇓
BAC-Flüssigkultur (500 ml)
⇓
Maxi-BAC-DNA-Präparation
⇓ ⇓
Sequenzierung der BAC-DNA Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
⇓
Randsequenzen-Primer ⇓ ⇓
PCR am RH-Panel PCR an BAC-DNA ⇓ ⇓
RH-Kartierung BAC-Contig-Erstellung
Abb. 6: Arbeitsschritte für das Radiation Hybrid Mapping und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
26 Methoden
Zur genetischen Kartierung des Polled-Locus wurde geeignetes Familienmaterial der Rasse Deutsches Fleckvieh (DFV) ausgewählt. Für die Untersuchung wurden sieben bekannt heterozygot hornlose DFV-Besamungsbullen ausgewählt. Diese Besamungsbullen waren an den Besamungsstationen Grub/Poing , Neustadt/ Aisch, Marktredwitz und am Staatlichen Versuchsgut in Neuhof im Testeinsatz. Die Anpaarung erfolgte in der Regel an gehörnte Kühe der Rasse DFV. Anschließend wurden vom Landeskuratorium der Erzeugerringe für tierische Veredelung (LKV) in Bayern die Daten für alle Nachkommen zur Verfügung gestellt. Von den Nachkommen und den Paarungspartnerinnen der sieben Bullen konnten insgesamt 241 EDTA-Blutproben (122 Nachkommen davon 117 weiblich und 6 männlich, 119 Mütter) gewonnen werden (Tab. 14). Die sterile Entnahme von 5 ml Blut erfolgte aus der Schwanzvene oder aus der Halsvene. Bei allen Tieren wurde der Hornstatus sowohl adspektorisch als auch palpatorisch erhoben. Von Tieren mit unklarem Hornstatus wurde keine Probe genommen. Das gesammelte Tiermaterial enthält also nur Tiere mit gesichertem Hornstatus. Des Weiteren lagen 12 Spermaproben von den Bullen und deren verfügbaren Vorfahren und 5 Blutproben von weiteren zusätzlichen Verwandten vor. Der Versuchsablauf der Laboruntersuchung des Tiermaterials ist in Abbildung 7 dargestellt.
DNA-Isolierung aus EDTA-Blut oder Sperma
⇓
PCR mit polymorphen Markern
⇓
Auftrennung der Markerallele mittels Polyacrylamidgelelektrophorese
⇓
Genotypisierung
⇓
Haplotypenanalyse und Kopplungsanalyse
Abb. 7: Versuchsablauf der Untersuchung des Tiermaterials
3.1 Molekularbiologische Methoden 3.1.1 Isolierung genomischer DNA
3.1.1.1 DNA-Isolierung aus Blut
Für die Isolierung der genomischen DNA aus Blut wurde das Nucleon BACC2 Kit (Amersham Pharmacia Biotech) verwendet. Es wurde 1 ml ungeronnenes, mit EDTA versetztes Rinderblut mit 3 ml eines Waschpuffers (Reagent A) versetzt, 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gemischt und anschließend bei 4000 rpm 5 Minuten zentrifugiert. Der entstehende Überstand wurde dekantiert und anschließend der Waschvorgang mit 1,5 ml Reagent A noch zweimal wiederholt. Hierbei wurden die roten Blutkörperchen lysiert und die weißen Blutkörperchen abzentrifugiert. Das zurückbleibende Pellet wurde zur Zelllyse und Deproteination in Reagent B aufgenommen, nach 5 minütigem Mischen bei Raumtemperatur wurde Natrium- perchlorat hinzugegeben. Nach Inkubation dieses Ansatzes bei 37°C für 20 min und 65°C für 20 min wurde eisgekühltes Chloroform zur Extraktion der Nukleinsäure hinzupipettiert. Nach gründlichem Mischen erfolgte die Zugabe einer Silica-Lösung, welche die Interphase deutlich sichtbar macht. Dies erleichterte die Überführung der DNA-haltigen wässrigen, oberen Phase in ein neues Reaktionsgefäß. Danach wurde Ethanol (100%) hinzugegeben und die DNA durch schwenken des Reaktionsgefäßes gefällt. Durch die kurze Präzipitation in der Gegenwart von hohen Salzkonzentrationen wurde die RNA-Menge in der DNA reduziert. Die Konzentrierung der DNA erfolgte durch Zentrifugation bei 15000 rpm für 5 min. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet zweimal in 70% Ethanol gewaschen, dabei wurde verbliebenes Salz und Chloroform entfernt. Nach dem letzten Zentrifugieren wurde das Pellet luftgetrocknet und anschließend in 1x Tris-EDTA aufgenommen.
28 Methoden
3.1.1.2 DNA-Isolierung aus Sperma
Das Sperma wurde ebenfalls mit dem Nucleon BACC2 Kit (Amersham Pharmacia Biotech) bearbeitet. Die verwendeten Besamungspailletten enthielten 200 µl bis 500 µl für die künstliche Besamung aufbereitetes, verdünntes Sperma. Es wurde nach dem mitgelieferten Protokoll vorgegangen (s.o.), wobei nach der Zugabe von Reagent B zusätzlich 1,4–Dithiothreitol (DTT) hinzugefügt wurde.
3.1.1.3 Schätzung der DNA-Konzentration
Zur Konzentrationsbestimmung wurde die DNA auf einem 0,6%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid angefärbt (3 µl Ethidiumbromid in 50 ml Agaroselösung). Die Konzentration wurde anhand der Bandenintensität geschätzt. Dafür wurden 5 µl gelöste DNA mit 3 µl Stopmix versehen und auf das Gel geladen. Als Konzentrations- und Größenstandard dienten 100 ng bzw. 200 ng DNA und 5 µl λ- Phagen-DNA / Hind III.
3.1.2 Vermehrung und Isolierung von Plasmid-DNA
3.1.2.1 Bakterienkultur (AUSUBEL et al., 1990) 3.1.2.1.1 Flüssigkultur
Autoklaviertes LB-Medium wurde nach Zugabe von Antibiotika mit Bakterien einer Plattenkultur oder einer anderen Flüssigkultur angeimpft. Die Inkubation der Flüssigkulturen erfolgte bei 37°C für 8 bis 20 Stunden auf einem Schüttler bei 225 U/min. Dem Medium wurden nach dem Autoklavieren und Abkühlen Antibiotika in folgenden Endkonzentrationen zugesetzt:
• 50 µg/ml Ampicillin
(Stammlösung 50 mg/ml in H2O bidest., gelagert bei -20°C)
• 20 µg/ml Chloramphenicol
(Stammlösung 10 mg/ml in 100% Ethanol; gelagert bei -20°C)
Antibiotikahaltige Flüssigkulturen wurden bei 4°C wenige Tage bis maximal 1 bis 2 Wochen aufbewahrt.
3.1.2.1.2. Plattenkulturen
LB-Agar wurde nach dem Autoklavieren auf ca. 50°C abgekühlt, je nach Selektionsanforderung mit Chloramphenicol (20 µg/ml) oder Ampicillin (50 µg/ml) und 40 µg/ml X-Gal (Stammlösung von 40 mg/ml in N,N-Dimethylformamid (DMF)), versetzt und ca. 5 mm hoch in sterile Petrischalen gegossen. Nach dem Erstarren wurden die Platten 40 Minuten lang offen getrocknet und danach steril verpackt.
Mittels einer sterilen Impföse wurden die Bakterien auf der Platte ausgestrichen. Die Platten wurden daraufhin 16 bis 24 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend bei 4°C bis zu mehrere Wochen aufbewahrt.
3.1.2.2 Transformation kompetenter E. coli
Die Transformation von ligierter Plasmid-DNA in die kompetenten TOP10 One Shot ® Zellen wurde nach den Herstellerangaben des Original TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) durchgeführt. Zur Selektion der transformierten Zellen trägt der eingesetzte pCR2.1 Plasmidvektor neben einem Gen für Ampicillinresistenz, ein lacZ‘ Gen für das Enzym β-Galactosidase, welches bei Klonierung eines PCR- Produkts inaktiviert wird. Daher ist eine sogenannte Blau/Weiß-Selektion nach Plattenkultur der Zellen auf 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) enthaltendem Agar möglich. Die Kolonien, die keine Rekombinanten enthalten, sind blau gefärbt.
30 Methoden
3.1.2.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 3.1.2.3.1 Plasmidisolation durch alkalische Lyse
Eine 5 ml Bakterienkultur wurde bei 5000 rpm 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 150 µl Puffer P1 resuspendiert und in ein 1,5 ml Eppendorf- Reaktionsgefäß überführt. Nach Zugabe von 150 µl Puffer P2 und vorsichtigem Mischen, wurden 150 µl Puffer P3 hinzugegeben und ebenfalls gemischt.
Anschließend wurde der Niederschlag bei 20000 rpm 15 Minuten bei 4°C in der abzentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml 100% Ethanol überführt und danach die DNA 15 min bei 20000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 1 ml -20°C kaltem 70%igem Ethanol gewaschen, in der Speed Vac 10 Minuten getrocknet und anschließend in 50 µl TE- Puffer aufgenommen.
3.1.2.3.2 Isolierung hochreiner Plasmid-DNA
Um größere Mengen hochreiner Plasmid-DNA zu isolieren, wurden QIAGEN Plasmid Kits verwendet. Die Lyse der Bakterien erfolgt dabei durch eine NaOH/SDS- Behandlung. Proteine und assoziierte genomische E. coli DNA werden durch KOAc gefällt. Die weitere Reinigung der Plasmid-DNA erfolgt durch eine Ionenaustausch- chromatographie. 50 ml Bakterienkultur wurden 10 Minuten bei 5000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde anschließend in 4 ml Puffer P1 resuspendiert. Zur Lyse der Bakterien wurde das gleiche Volumen Puffer P2 zugegeben, vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach wurde ein weiteres Volumen auf 4°C gekühlten Puffer P3 zugegeben und kräftig geschüttelt. Nach einer Inkubation von 15 Minuten auf Eis, wurde der Niederschlag 30 Minuten bei 12000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine mit Puffer QBT äquilibrierte QIAGEN-Säule aufgetragen, mit Puffer QC gewaschen und die Plasmid-DNA mit Puffer QF eluiert. Nach der Zugabe von 0,7
Volumen Isopropanol wurde die DNA für 60 Minuten bei 6000 rpm und 4°C in abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 2 ml 70%igem Ethanol gewaschen und die Reste des Ethanols anschließend mit der Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Das DNA- Pellet wurde in einem entsprechenden Volumen TE-Puffer (10/1) über Nacht bei Raumtemperatur gelöst.
3.1.2.4 Isolierung von BAC-DNA aus E. coli
3.1.2.4.1 Schnellaufschluss zur Isolierung von BAC-DNA
5 ml chloramphenicolhaltiges LB-Medium wurden mit einer einzelnen Plattenkolonie angeimpft und bei 37°C für 8 bis 20 Stunden geschüttelt. Die Bakterienkultur wurde bei 3000 rpm 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 300 µl Puffer P1 resuspendiert und anschließend 300 µl Puffer P2 zugegeben. Nach vorsichtigem Mischen erfolgt eine 5 minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Danach wurden 300 µl Puffer P3 hinzugefügt, der Ansatz gemischt und 5 Minuten auf Eis inkubiert. Bei 10000 rpm wurde nun 10 min bei 4°C der Niederschlag abzentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß mit 800 µl eiskaltem Isopropanol überführt. Nach mehrmaligem Schwenken der Reaktionsgefäße erfolgte eine nochmalige Inkubation für 5 min auf Eis. Anschließend wurde die DNA 15 min bei 10000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 500 µl 70%
Ethanol gewaschen. Danach wurde es 15 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet und in 40 µl TE-Puffer aufgenommen.
32 Methoden
3.1.2.4.2 Isolierung von BAC-DNA mit QIAGEN Plasmid Kits
Für die Isolation größerer Mengen hochreiner BAC-DNA wurden ebenfalls QIAGEN Plasmid Kits verwendet. Da aber in diesem Fall nur eine Kopie des Plasmides pro Zelle vorhanden ist (single copy plasmid), wurde ein modifiziertes Protokoll mit den gleichen Reagenzien wie in 4.1.2.3.2 angewendet. 500 ml Bakterienkultur wurden 10 Minuten bei 5000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 50 ml Puffer P1 resuspendiert. Zur Lyse der Bakterien wurde das gleiche Volumen Puffer P2 zugegeben, vorsichtig gemischt und höchstens 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 50 ml Puffer P3 zugegeben und geschüttelt. Nach einer Inkubation von 20 Minuten auf Eis, wurde 30 Minuten bei 12000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde filtriert, um Niederschlagsreste zu entfernen, und wurde dann auf eine mit Puffer QBT äquilibrierte QIAGEN-Säule aufgetragen.
Nachdem zweimaligem Waschen mit 30 ml Puffer QC, wurde die Plasmid-DNA mit 65°C warmen Puffer QF in fünf Schritten zu je 3 ml eluiert. Unmittelbar nach der Zugabe von 10,5 ml Isopropanol wurde die DNA 60 Minuten bei 6000 rpm und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 5 ml 70%igem Ethanol gewaschen und die Ethanolreste mit der Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Die DNA wurde in 150-300 µl TE-Puffer (10/1) über Nacht bei Raumtemperatur (RT) gelöst.
