4 Ergebnisse
4.1 Radiation Hybrid Mapping
4.1.1 Auswahl und Überprüfung der cDNA-Klone
Aus einem ca. 5 Mb umfassenden Abschnitt des humanen Chromosoms 21, flankiert von den Genen GRIK1 und RUNX1, wurden 15 Gene ausgewählt, die beim Rind kartiert werden sollten. Bei der Auswahl wurden davon schwerpunktmäßig 10 Gene aus dem ca. 1,6 Mb großen Abschnitt zwischen den Genen SOD1 und IFNAR1 ausgewählt, da hier ein homologer Bereich zur Polled-Genomregion beim Rind vermutet wird. In Tabelle 1 sind diese Gene mit ihrer Position innerhalb der vollständigen HSA21-Sequenz dargestellt. Außerdem wurde das Gen FOXL2 ausgewählt, welches als Kandidatengen für die Hornlosigkeit bei der Ziege gilt und beim Menschen auf HSA3 lokalisiert ist.
Tab. 1: Position der 15 ausgewählten Gene auf HSA21 (nach HATTORI et al. 2000)
Gen Genbezeichnung Position in Mb
(Anfang) Position in Mb (Ende) GRIK1 human glutamate receptor
(GLUR5) 16,50 16,88
TIAM1 human T-lymphoma invasion and
metastasis inducing TIAM1 protein 18,06 18,50 SOD1 Cu/Zn superoxide dismutase 18,60 18,61
CTBP2 C-terminal binding protein 2 18,61 18,65 PRED33 putative serine threonin kinase 18,82 18,95 KIAA0539 human mRNA for KIAA0539
protein 19,25 19,29
SYNJ1 synaptojanin-1,
polyphospho-inositide phosphatase 19,57 19,64 GCFC human GC-rich sequence
DNA-binding factor candidate 19,68 19,71 PRKCBP2 human protein kinase C-binding
protein 19,97 19,97
IFNAR2 Interferon alpha receptor 20,17 20,21 IL10RB Interleukin10-Receptorcomplex,
transmembranase receptor protein 20,21 20,24 IFNAR1 Interferon alpha/beta receptor 20,27 20,30
GART phosphoribosylglycinamide
formyltransferase 20,45 20,49 KCNE2 human minK-related peptide1,
potassium channel subunit 21,31 21,32 RUNX1
acute myeloid leukemia 1 protein (oncogene AML-1), core-binding
factor alpha subunit 21,77 21,83
Anhand der Sequenzen dieser Gene wurden cDNA-Klone bestellt mit denen die RPCI-42 Male Bovine BAC Library (WARREN et al. 2000) gescreent werden sollte.
Zunächst wurde aus diesen sogenannten IMAGE-Klonen die cDNA isoliert und die cDNA-Inserts mit Restriktionsenzymen aus den Vektoren herausgespalten (Abb. 8).
Die Insertbanden wurden aus einem präparativen Gel ausgeschnitten und für ihre weitere Verwendung als Sonde aufgereinigt. Die Größe der Inserts konnte nach Agarosegelelektrophorese abgeschätzt werden und ist in Tabelle 2 dargestellt. Mit der anschließenden Sequenzierung sollte sichergestellt werden, dass der gewünschte DNA-Abschnitt auch tatsächlich in den Klonen enthalten ist.
P11 P12 P13 P14 1kb Ladder P11 P12 P13 P14 1kb Ladder
Insert Vektor
1018 1636 506, 517 3054
bp
a) b)
Abb. 8: Spaltung der IMAGE-Klone
a) Präparatives Agarosegel (1% TBE-Agarose, mit Ethidiumbromid) b) Aufgereinigte Inserts (1% TBE-Agarose, mit Ethidiumbromid)
46 Ergebnisse
Tab. 2: IMAGE-Klone und deren Insertgrößen
Sonden-Nr.: Gen cDNA-Klon Insertgröße in bp P1 SOD1 IMAGp998 B131026 650 P2 IL10RB IMAGp998 E042085 1450 P3 GCFC IMAGp998 E201067 650 P4 IFNAR1 IMAGp998 F016055 1500 P5 IFNAR2 IMAGp998 G12119 840 P6 KIAA0539 IMAGp998 G19138 2000 P7 PRED33 IMAGp998 H161890 800 P8 SYNJ1 IMAGp998 M235017 600 P9 PRKCBP2 IMAGp998 P045361 1100 P10 CTBP2 IMAGp998 P233777 600 P11 TIAM1 IMAGp998 M16163 3700 P12 GART IMAGp998 J037162 2600 P13 KCNE2 IMAGp998 A245722 700 P14 RUNX1 IMAGp998 J23798 1600 P16 GRIK1 IMAGp998 I10155 1400 P25 FOXL2 IMAGp998 P198095 900
Zur Überprüfung der humanen IMAGE-Klone wurde ein Datenbankvergleich der ermittelten Sequenzen mittels BLASTN durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die cDNA-Klone IMAGp998E201067 und IMAGp998M16163, die den Genen GCFC (human GC-rich sequence DNA-binding factor candidate) und TIAM1 (human T-lymphoma invasion and metastasis inducing TIAM1 protein) entsprechen sollten, nicht die erwartete Sequenz enthielten. Daraufhin wurden diese beiden cDNA-Klone nicht als Sonden zum Screening der BAC-Bank verwendet.
4.1.2 Auswahl der Primer aus der Region für das Polled-Intersex-Syndrome (PIS) auf dem Ziegenchromosom 1 (CHI1)
Die Mikrosatelliten LSCV098 und LSCV202 sind auf dem Ziegenchromosom 1 in der Region lokalisiert, in der das Polled-Intersex-Syndrome vermutet wird. Aus der veröffentlichten Sequenz dieser Mikrosatelliten wurden die Primer CH098_F und CH098_R sowie CH202_F und CH202_R ausgewählt (Anhang Tab. 27c) und eine PCR auf genomischer Rinder-DNA durchgeführt. Da die Amplifikate nach der PCR
mit CH098 spezifischer waren als die von CH202 und außerdem ein Allel des Mikrosatelliten LSCV098 mit dem Polled-Intersex-Syndrome bei der Ziege assoziiert wird, wurde im folgenden dieses PCR-Produkt kloniert und dann als Sonde CH098 eingesetzt.
4.1.3 Hybridisierung an Rinder-BAC-Banken
Die Auswertung der Röntgenfilme nach der ersten Hybridisierung mit den Sonden P2, P4, P5, P6 und P8 auf den Filtern der RPCI-42 Bovine BAC-library und der Screen mit den Sonden P1, P7, P9 und P10 auf den Filtern der Bovine BAC Library 750 (ZHU et al. 1999) , durchgeführt am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) in Heidelberg, ergaben 23 positive BAC Klone. Der Screen mit der Sonde aus dem PCR-Produkt von CH098 ergab 6 positive Klone. Außerdem wurde eine Wiederholung des Screens mit den Sonden P2, P6, P7, P8 und P9 auf den Filtern der RPCI-42 Bovine BAC-library durchgeführt, woraus sich nochmals 20 BAC-Klone ergaben. Das Durchmustern ergab also insgesamt 61 BAC-Klone (Tab. 3a-d).
Abbildung 9 zeigt den Ausschnitt eines Röntgenfilms, der 22 h mit der radioaktiven Hybridisierung auf Filter 9 der RPCI-42 BAC-Genbank exponiert war. In diesem Fall wurde mit der Sonde P14 hybridisiert. Jeder Filter war in 6 Panel unterteilt, abgebildet sind hier Panel 5 und Panel 3. Die positiven Signale hatten die Koordinaten 395 A10, 399 I1 und 411 D17.
Abb. 9: Radioaktive Hybridisierung
Darstellung von drei positiven Signalen auf der RPCI-42 Bovine BAC-library nach Hybridisierung mit 32P-markierter humaner cDNA Sonde.
48 Ergebnisse
Da teilweise mit zwei bzw. drei Sonden gleichzeitig hybridisiert wurde, musste in einem weiteren Hybridisierungsschritt geklärt werden, welcher Klon welcher Sonde zugeordnet werden kann. Zusätzlich sollten falsch positive Klone, z.B. durch Vektor verunreinigte Klone, ausgeschlossen werden.
Tab. 3: Positive BAC-Klone nach dem Genbank-Screening a) Screen 1 (Sonden P2, P4, P5, P6 und P8)
Herkunft Gen Sonde BAC Labor-Nr.:
HSA21 IL10RB P2 RPCI42 52 K19 BAC1 HSA21 IFNAR1 P4 RPCI42 98 N14 BAC2 HSA21 IFNAR2 P5 RPCI42 159 I09 BAC3 RPCI42 187 F19 BAC4 RPCI42 214 C03 BAC5 RPCI42 246 H13 BAC6 RPCI42 198 H13 BAC17 RPCI42 262 C03 BAC18 HSA21 KIAA0539 P6 RPCI42 282 C13 BAC7 HSA21 SYNJ1 P8 RPCI42 327 B11 BAC8 RPCI42 346 C13 BAC9 RPCI42 365 B18 BAC10 RPCI42 410 L20 BAC11 RPCI42 428 E12 BAC12 RPCI42 430 B16 BAC13 RPCI42 446 F09 BAC14 RPCI42 487 L23 BAC15 RPCI42 572 E03 BAC16
b) Screen 2 (Sonden P1, P7, P9 und P10 in Heidelberg)
Herkunft Gen Sonde BAC Labor-Nr.:
HSA21 SOD1 P1 BBI B750 G148Q2 BAC25 HSA21 PRED33 P7 BBI B750 C513Q2 BAC26 HSA21 PRKCBP2 P9 BBI B750 D334Q2 BAC27 HSA21 CTBP2 P10 BBI B750 H148Q2 BAC28 BBI B750 K648Q2 BAC29
Fortsetzung Tab.3 Positive BAC-Klone nach dem Genbank-Screening
c) Screen 3 (PCR-Produkt von CH098 als Sonde)
Herkunft PCR-Produkt Sonde BAC Labor-Nr.:
CHI1 CH098 CH098 RPCI42 448 P17 BAC19 RPCI42 350 L07 BAC20 RPCI42 547 H17 BAC21 RPCI42 386 K12 BAC22 RPCI42 431 O23 BAC23 RPCI42 351 N09 BAC24
d) Screen 4 (Sonden P2, P6, P7, P8 und P9)
Herkunft Gen Sonde BAC Labor-Nr.:
HSA21 IL10RB P2 RPCI42 413 G1 BAC46 RPCI42 465 N16 BAC47 RPCI42 484 C15 BAC48 RPCI42 554 P19 BAC49 HSA21 KIAA0539 P6 RPCI42 46 I17 BAC40 HSA21 PRED33 P7 RPCI42 104 G19 BAC41 RPCI42 199 N3 BAC42 RPCI42 213 N17 BAC43 RPCI42 238 C02 BAC44 RPCI42 266 O23 BAC45 HSA21 SYNJ1 P8 RPCI42 104 N24 BAC30 RPCI42 111 O13 BAC31 RPCI42 217 G23 BAC32 RPCI42 223 B7 BAC33 HSA21 PRKCBP2 P9 RPCI42 351 B8 BAC34 RPCI42 437 C5 BAC35 RPCI42 448 J14 BAC36 RPCI42 505 H24 BAC37 RPCI42 520 B20 BAC38 RPCI42 576 K10 BAC39
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Fortsetzung Tab.3 Positive BAC-Klone nach dem Genbank-Screening
e) Screen 5 (Sonden P12, P13, P14 und P15)
Herkunft Gen Sonde BAC Labor-Nr.:
HSA21 GART P12 RPCI42 108 K14 BAC50 HSA21 KCNE2 P13 RPCI42 167 I16 BAC51
RPCI42 182 B8 BAC52
RPCI42 244 B6 BAC53
HSA21 RUNX1 P14 RPCI42 322 K8 BAC54
RPCI42 372 A20 BAC55
RPCI42 384 J18 BAC56
RPCI42 399 I1 BAC57
HSA21 GRIK1 P16 RPCI42 433 I12 BAC58
RPCI42 508 N7 BAC59
RPCI42 510 P12 BAC60 RPCI42 563 A18 BAC61