Braunschweig
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Untersuchungen zur Darstellung des Expressionsmusters des Transkriptionsfaktors Oct-4 in murinen, porcinen
und bovinen präimplantatorischen Embryonen
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Nicole Kirchhof
aus Laatzen
Hannover 2000
1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann
2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. S. Meinecke-Tillmann
Tag der mündlichen Prüfung: 29. Mai 2000
nicht im Erreichten.
Mahatma Ghandi
2 SCHRIFTTUM 4
2.1 Genexpression 4
2.1.1 Regulation der Genexpression 4
2.1.1.1 Chromatinstruktur und Genexpression 5
2.1.1.2 Transkription 7
2.1.1.3 Prozessierung der mRNA 7
2.1.1.4 Transport nukleärer mRNA 9
2.1.1.5 Translation 9
2.2 Transkription 10
2.2.1 Ablauf der Transkription 10
2.2.2 Regulatorische Elemente der Transkription 12
2.2.2.1 Promotor 12
2.2.2.2 Proximale Regulationselemente 14
2.2.2.3 Distale Regulationselemente 15
2.3 Transkriptionsfaktoren 18
2.3.1 Allgemeine Transkriptionsfaktoren 18
2.3.2 Regulatorische Transkriptionsfaktoren 20
2.4 Strukturmotive (DNA-Bindungsdomänen) 22
2.4.1 Zink-Finger-Motiv 22
2.4.2 Leucin-Zipper (bZip-Motiv) 24
2.4.3 Helix-loop-Helix-Motiv (HLH) 26
2.4.4 Helix-Turn-Helix-Motiv (HTH) 28
2.4.4.1 Homeodomäne (Homeobox) 30
2.4.5 POU-Proteine 33
2.5 Oktamer-bindende Faktoren 37
2.5.1 Oct-4 (Octamer-transcription factor 4) 38
2.5.1.1 Expression von Oct-4 in der frühen Embryonalentwicklung 39
2.5.1.2 Regulation der Oct-4-Expression 43
2.5.1.3 Zielgene 47
2.5.1.4 Oct-4 und die Entwicklungspotenz der Zellen 51
2.6 Nachweismöglichkeiten der Genexpression 55
2.6.1 Untersuchungen der Genexpression und Proteinlokalisation mit Hilfe von
Reportergenen 58
2.6.2 Das grün fluoreszierende Protein (GFP) 63
2.6.2.1 Biolumineszenz 63
2.6.2.2 GFP in der Molekularbiologie 64
2.6.2.3 Struktur 66
2.7 Immunozytochemie 68
2.7.1 Prinzip und Methodik der Immunozytochemie 68
2.7.2 Die Wahl des Antikörpers 69
2.7.3 Markierungsverfahren 70
2.7.4 Markierungsstrategien 73
2.7.4.1 Direkte Markierung 73
2.7.4.2 Indirekte Markierung 73
2.7.5 Unspezifische Bindungen 75
3 MATERIAL UND METHODEN 78
3.1 Gewinnung der Embryonen verschiedener Spezies 78
3.1.1 Tiermaterial und Tierhaltung 78
3.1.1.1 Mäuse 78
3.1.1.2 Schweine 78
3.1.1.3 Rinder 79
3.1.2 Superovulationsbehandlungen 79
3.1.2.1 Mäuse 79
3.1.2.2 Schweine 80
3.1.2.3 Rinder 80
3.1.3.2 Schweine 83
3.1.3.3 Rinder 83
3.1.4 Gewinnung und Erzeugung von Blastozysten 84
3.1.4.1 In-vivo-Blastozysten der Maus 84
3.1.4.2 In-vivo-Blastozysten des Schweines 85
3.1.4.3 In-vitro-Blastozysten des Schweines 86
3.1.4.4 In-vivo-Blastozysten des Rindes 86
3.2 In-vitro-Produktion von Rinderembryonen 87
3.2.1 Medien 87
3.2.1.1 PBS 87
3.2.1.2 Sammelmedium für KOKs (Kumulus-Oozyten-Komplexe) 87
3.2.1.3 Maturationsmedium 87
3.2.1.3.1 Zusätze zum Maturationsmedium 88
3.2.1.4 Medium für die In-vitro-Kultur 88
3.2.1.5 Fertilisierungsmedium 88
3.2.2 Gewinnung von Ovarien 91
3.2.3 Gewinnung von KOKs 91
3.2.4 Beurteilung der KOKs 91
3.2.5 In-vitro-Reifung (In Vitro Maturation, IVM) 92
3.2.6 In-vitro-Fertilisierung (In Vitro Fertilization, IVF) 93
3.2.7 In-vitro-Kultivierung (In Vitro Culture, IVC) 94
3.3 Morphologische Beurteilung der Embryonen 94
3.4 Mikroinjektionsversuche 96
3.4.1 Erstellung des Genkonstruktes 96
3.4.1.1 Minipräparation von Plasmid-DNA 97
3.4.1.2 Analytischer Verdau der DNA durch Restriktionsendonukleasen 98
3.4.1.3 Auftrennung von DNA durch Elektrophorese 99
3.4.1.4 Midipräparation von Plasmid-DNA 99
3.4.1.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen 100
3.4.3.1 Anordung der Instrumente 103
3.4.3.2 Durchführung der Mikroinjektion 104
3.4.3.3 In-vitro-Kultur der mikroinjizierten Zygoten/Kontrollgruppen 110 3.4.4 Beurteilung des Expressionsmusters der mikroinjizierten DNA 111 3.4.5 Beurteilung der Furchungs- und Entwicklungsraten 112
3.4.6 Allgemeiner Versuchsablauf 115
3.5 Indirekte Immunozytochemie 117
3.5.1 Verwendete Lösungen und Reagenzien 117
3.5.2 Chromatographische Reinigung Oct-4-spezifischer Immunglobuline 118
3.5.3 Durchführung der Immunozytochemie 119
3.5.3.1 Vorbehandlung 120
3.5.3.2 Inkubation mit dem spezifischen Oct-4-Antikörper 122 3.5.3.3 Markierung der Ag-Ak-Komplexe mit einem Peroxidase-gekoppelten
Zweitantikörper 122
3.5.3.4 Beurteilung der DAB-Reaktion 123
3.5.3.5 Markierung der Ag-Ak-Komplexe mit einem Fluorochrom-gekoppelten
Antikörper 123
3.5.3.6 Propidiumjodidfärbung 124
3.5.3.7 Einbetten der Blastozysten 124
3.5.3.8 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie 125
3.6 Allgemeiner Versuchsablauf 130
3.6.1 Bestimmung der optimalen Bedingungen zur Markierung von Oct-4-Protein in
der Maus 132
3.6.2 Bestimmung der optimalen Bedingungen zur Markierung von Oct-4-Protein bei
Schwein und Rind 132
3.6.3 Darstellung von Oct-4-Protein mit Alexa™-konjugiertem Antikörper 133
3.7 Statistische Auswertung 133
4.1 Erstellung transgener Embryonen 135 4.1.1 Furchungs- und Entwicklungsraten mikroinjizierter Zygoten 135
4.1.2 EGFP-positive Embryonen 138
4.1.3 Expressionsmuster des mikroinjizierten DNA-Konstruktes 139
4.2 Immunozytochemie 145
4.2.1 Bestimmung der optimalen Bedingungen bei murinen Embryonen 145 4.2.2 Bestimmung der optimalen Bedingungen bei bovinen und porcinen Embryonen 146
4.2.3 Darstellung des Oct-4-Proteins mit DAB 146
4.2.3.1 Maus 146
4.2.3.2 Schwein 149
4.2.3.3 Rind 151
4.2.4 Darstellung des Oct-4-Proteins mit dem Alexa™-konjugiertem Antikörper 153
4.2.4.1 Maus 153
4.2.4.2 Schwein 155
4.2.4.3 Rind 158
5 DISKUSSION 163
5.1 Erstellung transgener Embryonen unter Verwendung des Genkonstruktes
GOF 18 ∆∆PE-EGFP 164
5.1.1 Entwicklungs- und Furchungsraten der mikroinjizierten Zygoten 164
5.1.2 Beurteilung der EGFP-Expression 166
5.2 Bestimmung des Expressionsmusters des endogenen Oct-4-Gens in
murinen, bovinen und porcinen Blastozysten 169
5.2.1 Methodische Aspekte der Immunozytochemie zum Nachweis von Oct-4-
Protein 169
5.2.2 Lokalisation von Oct-4-Protein in Blastozysten verschiedener Spezies 172 5.2.3 Oct-4-Expression bei in vivo und in vitro produzierten Embryonen 176
5.3 Zusammenfassende Betrachtung und Schlußfolgerungen 177
7 SUMMARY 183
8 LITERATURVERZEICHNIS 187
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 243
10 TABELLENANHANG 249
11 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN 252
12 VERZEICHNIS DER TABELLEN 256
1 EINLEITUNG
Die Phase der präimplantatorischen Entwicklung, von der Zygote bis zur Implantation der Blastozyste, ist durch eine Vielzahl einschneidender Ereignisse auf molekularer und zellulärer Ebene charakterisiert (MAGNUSON u. EPSTEIN 1981; KIDDER 1992). Für die Ausbildung und Aufrechterhaltung der einzelnen Entwicklungsschritte (Kompaktierung, Kavitation, Expansion u.a.) werden die Produkte verschiedener Gene des maternalen und/oder embryonalen Genoms verantwortlich gemacht (KIDDER 1992). Die Entschlüsselung regulatorischer Netzwerke, welche die zeitliche und räumliche Expression von Genen während der Embryogenese ermöglichen, ist eines der zentralen Themen der biologischen Forschung.
Wesentliche Einblicke in grundlegende molekulare Mechanismen regulatorischer Abläufe während der Embryogenese wurden durch die Klonierung und Charakterisierung von Genen aus Drosophila melanogaster gewonnen (INGHAM 1988). Dagegen sind die molekularen Grundlagen, welche die Entwicklung von Vertebraten bestimmen, noch weitgehend uner- forscht. Bisher sind erst wenige Gene bekannt, die für die Regulation in der präimplantatori- schen Entwicklung essentiell sind (MAGNUSON 1986; COPP 1995).
Ein wichtiges Kandidatengen, das im Rahmen der frühembryonalen Entwicklung eine bedeut- same Rolle spielt, ist der Transkriptionsfaktor Oct-4, der zur Familie der POU-Proteine ge- hört. Untersuchungen bei Maus (SCHÖLER et al. 1989a, 1990a; ROSNER et al. 1990) und Rind (GANDOLFI et al. 1995, 1997; VAN EIJK et al. 1999) haben gezeigt, daß Oct-4 bereits in präimplantatorischen Embryonen exprimiert wird. Damit liegt die Expression zeitlich noch vor der Expression anderer bereits bekannter Gene, die eine regulatorische Bedeutung in dieser frühen Phase der Entwicklung besitzen, wie etwa die Hox- oder Pax-Gene (KESSEL u.
GRUSS 1990). Das bisher identifizierte Expressionsmuster von Oct-4 bei der Maus deutet auf eine aktive Rolle von Oct-4 bei den ersten Differenzierungsvorgängen während der früh- embryonalen Entwicklung hin. Die Expression von Oct-4 kann in der Oozyte, in frühen Fur- chungsstadien und in der Blastozyste nachgewiesen werden. Während der weiteren Differen- zierung der Zellen kommt es jedoch zu einer „Downregulation“ von Oct-4 und die Expression ist ab Tag 8 p.c. auf die Primordialkeimzellen beschränkt (SCHÖLER et al. 1990a; ROSNER et al. 1990). Auch in undifferenzierten Zellinien der Maus (ES-, EC- und EG-Zellen) ist eine
Oct-4-Expression nachweisbar (MINUCCI et al. 1996; OKAZAWA et al. 1991; YEOM et al.
1996). Aufgrund dieses Expressionsmusters im sogenannten „totipotenten Zyklus“ (YEOM et al. 1996) wird Oct-4 mit dem undifferenzierten oder totipotenten Status embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) korreliert. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, daß Oct-4 auch Aufschluß darüber geben könnte, zu welchem Zeitpunkt in anderen Spezies die Differenzierung der toti- bzw. pluripotenten embryonalen Zellen beginnt. Bei Restriktion der Oct-4-Expression auf undifferenzierte Zellen in präimplantatorischen Embryonen auch bei den Nutztierspezies könnte Oct-4 nicht nur als möglicher Marker für eine korrekte präimplan- tatorische Embryonalentwicklung in vitro produzierter Embryonen sondern auch für undiffer- enzierte Zellen im präimplantatorischen Embryo dienen. Damit könnte Oct-4 zur Generierung stabiler pluripotenter oder totipotenter Zellinien von Nutztieren eingesetzt werden. Trotz viel- fältiger Bemühungen ist es bisher nicht gelungen, embryonale Stammzellen mit totipotenten Eigenschaften bei anderen Spezies als bei der Maus sicher zu etablieren. In Versuchen zur Erstellung pluripotenter ES-Zellen bei landwirtschaftlichen Nutztierspezies gelang es bisher lediglich, stammzellähnliche Zellen zu isolieren, die in vitro aber nur eine geringe Prolifera- tionsrate und mit zunehmender Dauer abnehmende Vitalität zeigen (WILMUT et al. 1991).
Für die erfolgreiche Isolierung und Kultivierung geeigneter totipotenter Zellinien bei Nutz- tieren sind genaue Kenntnisse über die präimplantatorische Embryonalentwicklung und vor allem die Erfassung des Entwicklungsstadiums, bei dem noch undifferenzierte Zellen vor- handen sind, notwendig.
Um die Bedeutung von Oct-4 in der Embryonalentwicklung bei Rind und Schwein zu unter- suchen, wurden in der vorliegenden Arbeit zwei methodische Ansätze gewählt.
Zunächst wurde das murine Oct-4-Gen, gekoppelt an die kodierende Sequenz des GFPs (green fluorescent protein) als Reportergen, in Zygoten von Rind, Schwein und Maus mikroinjiziert und das räumliche und zeitliche Expressionsmuster während der präimplantatorischen Entwicklung untersucht. Durch Analyse transgener boviner und porciner Embryonen, die den 5´-regulatorischen Bereich von Oct-4 gekoppelt an das Reportergen enthalten, konnte die Oct-4-Expression während der präimplantatorischen Embryonalentwicklung indirekt detektiert werden. Neben der geringen Effizienz der Mikroinjektion bei den Nutztieren gelten aber der zufällige Einbau und die variable
Expression des Transgens als Hauptnachteile der Mikroinjektion (BRINSTER et al. 1985;
PALMITER u. BRINSTER 1986; CLARK et al. 1994; DOCHERTY 1996). Diese Nachteile führen zu einem räumlichen und zeitlichen Expressionsmuster des Transgens, das oftmals nicht dem Expressionsmuster des entsprechenden endogenen Gens entspricht. Um diese Nachteile der Mikroinjektion zu vermeiden, wurde das Expressionsmuster des endogenen Oct-4-Proteins mit Hilfe der sogenannten indirekten „whole-mount“-Immunozytochemie bei Blastozysten der drei genannten Spezies untersucht. Diese Methode hat gegenüber histolo- gischen Schneideverfahren den Vorteil, die Verteilung der Oct-4-Proteine innerhalb des gesamten Embryos wiederzugeben. Da in einigen Arbeiten gezeigt worden ist, daß in Abhängigkeit von den In-vitro-Kulturbedingungen Gene entweder abgeschaltet oder induziert werden und auch die relative Häufigkeit von Transkripten im Vergleich zu den In-vivo- Stadien beträchtlich differieren kann (WRENZYCKI et al. 1996; ECKERT u. NIEMANN 1998; DE SOUSA et al. 1998; NIEMANN u. WRENZYCKI 2000), wurden bei bovinen und porcinen Blastozysten jeweils in vitro erzeugte Blastozysten bzw. in vivo fertilisierte/in vitro kultivierte Stadien mit in vivo gewonnenen Stadien verglichen.
2 SCHRIFTTUM 2.1 Genexpression
2.1.1 Regulation der Genexpression
Unter Genexpression wird die Umsetzung der in der DNA kodierten genetischen Information über mRNAs zum Genprodukt und die damit gekoppelte Merkmalsausprägung verstanden.
Der erste Schritt der Genexpression, die RNA-Synthese mittels einer DNA-abhängigen RNA- Polymerase, wird als Transkription bezeichnet (LEWIN 1997a). Der zweite Schritt, die Um- setzung der Information der mRNA, wird als Polypeptidsynthese bzw. Translation bezeichnet (STRACHAN u. READ 1996a). Damit verläuft der genetische Informationsfluß wie folgt:
DNA RNA Protein
Transkription Translation
Aufgrund seiner Universalität wird der Fluß der genetischen Information von der DNA über die RNA zum Protein als das zentrale Dogma der Molekularbiologie bezeichnet.
Höhere Organismen enthalten in ihrem Genom die Information für ca. 100.000–140.000 verschiedene Genprodukte (LIANG u. PARDEE 1992; ABBOTT 1999), von denen in jeder Zelle aber jeweils nur ein kleiner Teil exprimiert wird. Die phänotypische Vielfalt der Orga- nismen und die funktionalen und morphologischen Unterschiede zwischen den spezialisierten Zelltypen der Organismen sind ein Ergebnis der Zelldifferenzierung, d.h. der selektiven Reali- sierung bestimmter Teile der gleichen genetischen Information (NOVER 1978). Dieser Auf- fassung liegt das Postulat zugrunde, „that two cells are differentiated with respect to each other if, while they harbour the same genome, the protein pattern which they synthesize is different“ (JACOB u. MONOD 1963).
Einmal eingeleitet, muß die Expression eines Gens nicht automatisch bis zum Ende, also bis zur Synthese des jeweiligen Proteins weiterlaufen. Bevor ein Gen exprimiert werden kann, sind noch weitere Schritte nötig:
1. die strukturelle Aktivierung des Gens (Veränderung der Chromatinstruktur), 2. der Beginn seiner Transkription,
3. die Prozessierung seines Transkripts (posttranskriptionelle Modifizierungen), 4. der Transport des Transkripts ins Zytoplasma und
5. die Translation dieser mRNA.
Jeder Schritt bildet eine potentielle Kontrollebene und ist möglicher Ansatzpunkt für Regula- tionsvorgänge, die von Gen zu Gen anders gestaltet sein können (DARNELL 1982; LEWIN 1997c).
Im folgenden wird kurz auf die Kontrollmöglichkeiten der genannten Ebenen eingegangen.
2.1.1.1 Chromatinstruktur und Genexpression
Die DNA bildet im Zellkern mit Histonen und anderen Proteinen assoziiert das Chromatin (VAN HOLDE et al. 1995). Die kleinste Einheit des Chromatins bilden die Nukleosomen, die durch Aufwicklung der DNA um einen Proteinkern entstehen. Die doppelsträngige Nuklein- säure ist zweimal um ein Histonoktamer gewunden, das aus je zwei Molekülen der Core- Histone H 2A, H 2B, H 3 und H 4 aufgebaut ist. Die DNA zwischen zwei Nukleosomen wird als Linker-DNA bezeichnet (ARENTS u. MOUDRIANAKIS 1993). Das Histon 1, mit einem stark konservierten, zentralen globulären Abschnitt und variablen amino- und carboxytermi- nalen Enden, bindet mit seinem mittleren Anteil an das Nukleosom und mit den peripheren Bereichen an die Linker-DNA. Auf diese Weise führt das Histon 1 zu einer Verdichtung des Chromatins.
Die Verpackung der chromosomalen DNA in Chromatin hat vielfältige Konsequenzen für die Transkription. Stark kondensiertes Chromatin läßt keine Transkription zu (FELSENFELD 1992, CROSTON u. KADONAGA 1993). Jedoch beeinflußt nicht nur der übergeordnete Verpackungszustand des Chromatins die Transkription, sondern auch das Nukleosom selbst (KORNBERG u. LORCH 1999). Die Histone der Nukleosomen können durch Acetylierung,
Phosphorylierung und Methylierung modifiziert werden, was ihre Bindungsaffinität zur nega- tiv geladenen DNA beeinflußt (WU et al. 1986). Während man vor einigen Jahren noch davon ausging, daß die Linker-Histon-Phosphorylierung direkt mit einer Zunahme der Chromo- somenkondensation und mit einer Abnahme der Transkription einhergeht, müssen diese Zu- sammenhänge heute differenzierter betrachtet werden (ROTH u. ALLIS 1992, PATTERTON u. WOLFFE 1996). Das Histon 1 ist in den Phasen des Zellzyklus unterschiedlich stark phos- phoryliert (ROTH u. ALLIS 1992). Durch Hyperphosphorylierung des Histon 1 in der Mito- sephase des Zellzyklus kommt es zu einer Zunahme der negativen Ladungen. Die Bindungen zur DNA werden gelockert, was der DNA eine offenere Konformation gibt. Transkriptionell aktive Bereiche zeichnen sich durch stärker phosphorylierte Histon 1 Moleküle aus. Den gleichen Effekt haben auch die Acetylierungen der Core-Histone (KORNBERG u. LORCH 1999). Sowohl Phosphorylierungen als auch Acetylierung destabilisieren die Nukleosomen- struktur und schaffen so Anlagerungsmöglichkeiten für Transkriptionsfaktoren und Polymera- sen (PATTERTON u. WOLFFE 1996).
Neben der unterschiedlichen Organisation des Chromatins wird auch der Methylierung von DNA eine regulatorische Funktion bei der Genexpression zugeschrieben (RAZIN u. CEDAR 1991). Die Methylierung, d.h. die kovalente Anheftung von Methylresten an bestimmte Basen innerhalb des DNA-Stranges, erfolgt bei den Vertebraten in der Regel an der Base Cytosin an Position C5 (5 Methyl-Cytosin), bevorzugt an den Cytosin-Resten innerhalb der Basense- quenz 5´-CpG-3´. In Vertebraten sind 60-90 % aller CpGs methyliert. Die meisten unmethy- lierten CpGs befinden sich in den Promotoren der Gene (HUCK-HUI u. BIRD 1999). Die Methylierung der Vertebraten-DNA wird mit einer generellen Unterdrückung der Transkrip- tion in Verbindung gebracht, unmethylierte Sequenzen werden dagegen meist stark transkri- biert (DOERFLER 1983, CEDAR 1988). Der Verlust der Expression von artifiziell methy- lierten Genkonstrukten nach Transfektion von Zellen in Zellkulturen unterstützt diese Hypothese (REIK u. WALTER 1998). Andererseits findet man aber auch stark methylierte Gene, die exprimiert werden und unmethylierte Gene, die nicht exprimiert werden (DYNAN 1989a). Neuere Untersuchungen zeigen, daß insbesondere in Krebszellen eine Methylierung mit einer Expressionsinduktion einhergehen kann (JONES 1999). Die DNA-Methylierung erzeugt daher möglicherweise übergeordnete Signale auf dem DNA-Strang, die nicht direkt die Transkription sondern die Transkribierbarkeit beeinflussen (IBELGAUFTS 1993). So
führt die Methylierung dazu, daß viele DNA-bindende Proteine nicht mehr mit der funktionell erforderlichen Stringenz binden, wenn Basen innerhalb ihrer Erkennungssequenz methyliert sind (EDEN u. CEDAR 1994). Vermutlich geht die Methylierung der DNA mit einer Deace- tylierung der Histone einher, so daß diese sich wieder fester an die DNA binden können und dadurch die Nukleosomenstruktur stabilisiert wird (HUCK-HUI u. BIRD 1999). Das Methy- lierungsmuster, welches letztendlich über die genetische Aktivität eines Chromatinabschnittes entscheidet, wird vermutlich in der Ontogenese bei der gewebespezifischen Differenzierung einer Zelle festgelegt (TE KRONNIE u. SAMALLO 1993).
2.1.1.2 Transkription
Bei der Umsetzung der Nukleotidsequenz eines kodierenden DNA-Bereiches in die Basen- folge der RNA kommt es zu Wechselwirkungen zwischen DNA und der RNA-Polymerase II (CONAWAY u. CONAWAY 1993) sowie weiteren Proteinen, den sogenannten Transkrip- tionsfaktoren (WASYLYK 1988). Die Transkription kann über die Beeinflussung aller an diesem Prozeß beteiligten Moleküle gesteuert werden. Für die meisten Gene bildet die Initia- tion der Transkription die wesentliche Kontrollinstanz. Auf die Transkription und dessen Regulation wird ausführlich in Kapitel 2.2 eingegangen.
2.1.1.3 Prozessierung der mRNA
Das primäre Transkriptionsprodukt der RNA-Polymerase II wird als heterogene Kern-RNA (hnRNA) oder Prä-mRNA bezeichnet (DREYFUSS et al. 1993). Die Prä-mRNA unterliegt im Zellkern verschiedenen Modifikationen, die als RNA-Prozessierung bezeichnet werden (LAMOND 1991). Insbesondere durch den Spleißvorgang, bei dem die nichtkodierenden Abschnitte (Introns) aus der hnRNA herausgeschnitten und die kodierenden Abschnitte (Exons) miteinander verknüpft werden, kann die Genaktivität modifiziert werden. Durch zusätzliches Entfernen von Exons aus einer hnRNA können verschiedene reife mRNA- Moleküle entstehen, die für unterschiedliche Proteine kodieren. Diese Form des Spleißens bezeichnet man als alternatives Spleißen (HODGES u. BERNSTEIN 1994). Manche Viren
nutzen diese Form des Spleißens, um die Möglichkeiten ihres kleinen Genoms besser auszu- schöpfen (LEWIN 1997d). Dieser Vorgang wird aber auch bei zellulären Genen gefunden.
Ein besonders markantes Beispiel für diese Art der Genregulation stellt das Spleißen der Calcitonin/CGRP Prä-mRNA dar. FISHER et al. (1983) und ROSENFELD et al. (1984) zeigten, daß in der Schilddrüse durch Spaltung der ersten Poly(A)-Stelle und durch nach- folgendes Spleißen die Calcitonin-mRNA entsteht. In der Hypophyse hingegen wird das Exon, das für Calcitonin kodiert, aus der mRNA herausgeschnitten. Auf diese Weise entsteht ein Neuropeptid, das als CGRP (calcitonin-gene-related-protein) bezeichnet wird. Es können also aus einem Gen gewebespezifische Produkte mit unterschiedlichen Funktionen entstehen.
Ein weiterer Vorgang während der Prozessierung der Prä-mRNA ist das Capping. Noch wäh- rend der Synthese der Ribonukleinsäure wird durch eine Guanyltransferase an das 5´-Ende ein 7-Methylguanosin geknüpft. Diese Struktur wird als Cap (Kappe) bezeichnet. Neben den
„internen“ Methylierungen der DNA dient diese Cap-Struktur als Substrat für mehrere Methylierungsvorgänge. Der N-7-Stickstoff des Guanins wird zunächst unter Bildung des Cap 0 methyliert. Die benachbarten Riboseeinheiten können ebenfalls methyliert werden.
Dabei entstehen dann Cap 1 und Cap 2 (STRYER 1991a). Diese Caps sind für die darauffol- genden Spleißaktionen wichtig und tragen zur Stabilität der mRNA bei, da sie deren 5´-Ende vor Phosphatasen und Nukleasen schützen. Zusätzlich verstärken die Cap-Gruppen die Trans- lation der mRNA (VARANI 1997).
Die Modifizierung der Prä-mRNA beinhaltet außerdem die sogenannte Polyadenylierung.
Poly(A)-Polymerasen katalysieren die Anheftung von Adenyl-Resten an das 3´-Ende der mRNA (EDMONDS 1990). Diese Modifikation am 3´-Ende umfaßt zwei Schritte (WAHLE u. KELLER 1994). Nach einer endonukleolytischen Spaltung jenseits des 3´-Endes der kodie- renden Sequenz folgt die Verlängerung des 5´-Fragments durch Polyadenylierung. Diese beiden Reaktionen unterliegen der Kontrolle von Steuerungssequenzen in der RNA, von denen das AAUAAA-Element als Polyadenylierungssignal bezeichnet wird. Durch die Verwendung verschiedener Polyadenylierungsstellen können, ähnlich wie beim Prozeß des alternativen Spleißens, aus einem primären Transkript unterschiedliche Produkte entstehen, die entweder für verschiedene Proteine kodieren oder sich in ihrem Transport, der Halbwertszeit und der Translationseffizienz unterscheiden. PROUDFOOT (1996) bezeichnet diese Zusammenhänge als Regulation der Genexpression durch das 3´-Ende der mRNA.
Die Bedeutung des Poly(A)-Schwanzes wird in einer Stabilisierung des Moleküls und Betei- ligung an der Translations-Initiation gesehen (KELLER 1995). So werden in einigen Fällen mRNAs in nichtpolyadenylierter Form gespeichert und erst dann mit einem Poly(A)-Schwanz versehen, wenn ihre Translation erfolgen soll (STRACHAN u. READ 1996b).
2.1.1.4 Transport nukleärer mRNA
Nach Abschluß der nukleären Modifikationen erfolgt der Transport der reifen mRNA durch die Kernporen ins Zytoplasma (MEHLIN et al. 1992). Auch der Transport unterliegt einer Regulation, die auf Protein-Nukleinsäureinteraktionen beruht (KRUG 1993).
2.1.1.5 Translation
Auch die Proteinbiosynthese unterliegt einer strikten differenzierten Regulation. Eine Über- sicht zur Translation findet sich bei LODISH et al. (1996a). Die Regulation der Genexpres- sion auf Ebene der Translation erlaubt ein schnelleres Reagieren als dies durch Transkrip- tionssteuerung möglich wäre (CURTIS et al. 1995). Insbesondere die Initiation kann durch die Struktur der mRNA beeinflußt werden (KOZAK 1991). Ähnlich wie bei der Transkription spielen auch bei der translationalen Kontrolle neben der mRNA und den Ribosomen weitere Proteine, sogenannte eukaryotische Initiationsfaktoren (eIFs), eine Rolle (PROUD 1986).
Über Modifikationen der Initiationsfaktoren (z.B. Phosphorylierungen) kann die Entstehung des Initiationskomplexes, bestehend aus der Initiations-tRNA (Met-tRNA), mRNA und der kleinen und großen ribosomalen Untereinheit, verhindert werden (PROUD 1986).
Neben den genannten Kontrollebenen gibt es noch weitere Möglichkeiten der Regulation der Genexpression. „Eine neue Ebene der Genexpressionskontrolle“ ist z.B. das RNA-Editing (HODGES u. SCOTT 1992), bei dem es zu einer weiteren Veränderung der mRNA durch Substitution, Einfügen oder Austausch von Nukleotiden in der kodierenden Region der mRNA kommt. Auch Speicherung und Abbau der mRNA stellen weitere Möglichkeiten dar, die Translationseffizienz zu beeinflussen. Nach der Translation kann zwar die eigentliche
Expression nicht mehr beeinflußt werden, doch ist es möglich, durch posttranslationale Modifikationen Struktur und Funktion von Proteinen zu beeinflussen. Der am weitesten ver- breitete Mechanismus, Struktur und Funktion der Proteine zu beeinflussen, ist die Phosphory- lierung (LODISH et al. 1996b). Andere Modifikationen sind Methylierungen, Acetylierungen oder auch Glykosylierungen.
Auch wenn feststeht, daß die Genexpression auf mehreren Ebenen kontrolliert wird und die Produktion einer RNA nicht zwangsläufig zur Produktion eines Proteins führt, erfolgt die überwältigende Mehrzahl der Regulationsvorgänge bei der Initiation der Transkription (DARNELL 1982).
2.2 Transkription
2.2.1 Ablauf der Transkription
Im Zellkern eukaryotischer Zellen ist die Transkription in drei Klassen aufgeteilt. Eukaryo- tische Gene lassen sich nach ihren Promotoren in drei Hauptgruppen einordnen, wobei jede Hauptgruppe von einer eigenen RNA-Polymerase transkribiert wird:
• RNA-Polymerase I transkribiert rRNA,
• RNA-Polymerase II transkribiert mRNA, und
• RNA-Polymerase III transkribiert tRNA und andere kleine nukleäre und zytosolische RNAs (VOET u. VOET 1992).
Eukaryotische RNA-Polymerasen sind große Proteinkomplexe, die gewöhnlich aus mehr als zehn Untereinheiten bestehen (EICK et al. 1994). Entsprechend ihren Aufgaben verteilen sich die drei eukaryotischen RNA-Polymerasen über unterschiedliche Zellkernbezirke. Ein weite- res wichtiges Unterscheidungsmerkmal der drei Polymerasen ist ihre Empfindlichkeit gegen- über dem bizyklischen Oktapeptid α-Amanitin, einem Giftstoff des grünen Knollenblätter- pilzes (IBELGAUFTS 1993). Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die Merkmale der verschie- denen RNA-Polymerasen.
Tabelle 1: Eukaryotische RNA-Polymerasen
Polymerase Lokalisation Produkt
Empfindlichkeit gegenüber α-Amanitin
RNA-Polymerase I Nukleolus ribosomale RNA unempfindlich RNA-Polymerase II Nukleoplasma Prä-mRNA (hnRNA) empfindlich RNA-Polymerase III Nukleoplasma tRNA/andere RNAs speziesabhängig
Während die RNA-Polymerase II bereits durch geringe Konzentrationen von α-Amanitin ge- hemmt wird, ist die RNA-Polymerase I unempfindlich gegenüber α-Amanitin. Die Reaktion der RNA-Polymerase III ist unterschiedlich: RNA-Polymerasen III von Hefe- und Insekten- zellen zeigen keine Reaktion, wohingegen die RNA-Polymerase III in Zellen höherer Tiere durch hohe Konzentrationen von α-Amanitin gehemmt wird (LEWIN 1997b).
Nach Bindung der RNA-Polymerase II kommt es zu einer lokalen Trennung des DNA- Doppelstranges, so daß in einem kurzen Abschnitt der DNA die Nukleotide freiliegen. Einer der beiden Stränge, der kodogene Strang, dient als Matrize zur Anlagerung und Paarung komplementärer freier Ribonukleosid-Triphosphate. Zwei dieser Basenpaare werden von der Polymerase verknüpft und bilden den Anfang der entstehenden RNA-Kette. Die RNA- Polymerase wandert in 5´-3´-Richtung an der DNA entlang und entwindet dabei immer einen neuen Teil der DNA, so daß weitere Nukleosid-Triphosphate über eine Phosphodiesterbin- dung miteinander verknüpft werden können. Da sich die DNA/DNA-Helix hinter der wandernden Polymerase wieder schließt, wird die naszierende RNA vom kodogenen Strang verdrängt und aus dem Enzymkomplex freigegeben. Die Kettenverlängerung geht so lange weiter, bis das Enzym auf eine bestimmte Basenfolge, das sogenannte Terminationssignal,
trifft. Dann löst sich die Polymerase sowohl von der DNA als auch von der neu produzierten RNA-Kette und kann sich erneut an einen Promotor anlagern (ALBERTS et al. 1990).
2.2.2 Regulatorische Elemente der Transkription
Die DNA eines von der RNA-Polymerase II transkribierten Gens enthält viele regulatorische cis-Elemente, die die korrekte Expression des Gens zum richtigen Zeitpunkt und in der gewünschten Intensität regulieren. Dabei wird zwischen
• Sequenzen, die den Beginn der Transkription festlegen (Promotoren),
• Sequenzen, die das Ende der Transkription festlegen (Terminationssignal), und
• Basenfolgen, die zusätzlich modulierend auf die Transkription einwirken (proximale und distale Regulationselemente) unterschieden (PASSARGE 1994).
Die regulatorischen Elemente der Transkription bezeichnet man als cis-aktiv, da sie nur solche Gene beeinflussen können, die sich auf dem gleichen Chromosom befinden. Transkrip- tionsfaktoren dagegen sind trans-aktiv, da sie zum Teil von weit entfernt liegenden Genen, auch anderer Chromosomen, synthetisiert werden und erst dann an die Stellen, an denen sie aktiv werden, wandern müssen (BRENIG und BREM 1989).
2.2.2.1 Promotor
Als Promotor eines Gens bezeichnet man den unmittelbaren Bereich um die Startstelle der Transkription, d.h. den Bereich um die Position +1 der RNA-Synthese (DYNAN u. TJIAN 1985). Der Promotor wird für eine akkurate Initiation der Transkription benötigt (MANIATIS et al. 1987). Molekulargenetische Analysen haben gezeigt, daß die meisten eukaryotischen Promotoren ähnlich aufgebaut sind (DYNAN u. TJIAN 1985). Anhand von Sequenzanalysen konnten zwei für eukaryotische Promotoren typische Konsensussequenzen nachgewiesen werden: Eine AT-reiche Region, die als TATA-Box bezeichnet wird und ein sogenanntes Initiatorelement (KOLLMAR u. FARNHAM 1993). Bei den meisten eukaryotischen Genen
liegt die TATA-Box ca. 25-30 Basenpaare stromaufwärts vor dem Startpunkt der Transkripti- on, während der Initiator (Inr) die Positionen von –3 bis +5 umfaßt (SMALE et al. 1990).
Diese beiden Elemente stellen damit die einzigen Promotorelemente dar, deren Abstand zum Startpunkt relativ festgelegt ist. Mutationsanalysen, vor allem in Hefen, haben gezeigt, daß die kurze und hochkonservierte Basensequenz der TATA-Box einen äußerst wichtigen Faktor für die Aktivität des Promotors darstellt (STRUHL 1986). Substitutionen und Deletionen ein- zelner Basen wirken als starke „Down-Mutationen“ und setzen die Aktivität des Promotors deutlich herab. Eukaryotische Promotoren bestehen aus unterschiedlichen Kombinationen der genannten Elemente. Sie können entweder beide Elemente enthalten (TATA+ Inr+), nur eines von beiden (TATAG Inr+ oder TATA+ InrG) oder keines der beiden Elemente (TATAG InrG).
Die letzte Variante bezeichnet man als Null-Promotor (NOVINA u. ROY 1996). Ein Promo- tor, der nur aus dem Inr besteht (TATAG Inr+), hat die einfachste für die RNA-Polymerase II erkennbare Form und wird als TATA-loser-Promotor (TATA-less promoter) bezeichnet (SMALE u. BALTIMORE 1989). Gene, die einen TATA-losen Promotor enthalten, werden wesentlich schwächer exprimiert als Gene mit einer TATA-Box. TATA-Box-lose Promotoren finden sich häufig bei Genen, die nur in bestimmten Entwicklungsstadien und zellspezifisch exprimiert werden, zum Beispiel in homeotischen Genen von Drosophila und von Säugern (NOVINA u. ROY 1996). Artifiziell eingeführte TATA-Boxen führen in Verbindung mit dem Inr-Element zwar zu einem signifikanten Anstieg der Genexpression, aber auch zu einem Verlust der Zellspezifität. EICHBAUM et al. (1994) konnten zeigen, daß für die spezifische Expression in Myeloidzellen des FcγR1b-Gens und für die selektive Empfänglichkeit des Gens für Interferon-γ (IFN-γ) die Anwesenheit des Initiator-Elements essentiell ist. Eine zusätzliche TATA-Box führt zu einer unspezifischen zelltyp-unabhängigen Expression und zu einem Verlust der selektiven IFN-γ-Empfänglichkeit. Ähnliche Experimente ergaben, daß das Inr-Element in TATA-Box-losen Promotoren sowohl die Richtung als auch die Startstelle der Initiation bestimmt. Nach Einfügen einer TATA-Box geht diese Fähigkeit des Inr jedoch verloren, und die TATA-Box übernimmt statt dessen diese Aufgabe (O´SHEA-GREENFIED u. SMALE 1992).
2.2.2.2 Proximale Regulationselemente
Neben der TATA-Box und/oder dem Initiator, die in erster Linie die Position des Startpunktes festlegen, sind weitere cis-aktive Elemente, die die Effizienz der Initiation erhöhen, gefunden worden (MANIATIS et al. 1987). Diese Elemente sind im allgemeinen nicht weiter als 100 Nukleotide von der Startstelle entfernt und dienen als Bindungsstellen für sequenzspezifische regulatorische Transkriptionsfaktoren (MITCHELL u. TJIAN 1989). Oftmals werden diese Elemente auch als UPEs (Upstream Promotor Elements) bezeichnet (BRENIG u. BREM 1989).
Eines dieser Regulationselemente ist die CAAT-Box. Vielfach liegt sie bei Position –80, doch kann sie ihre Funktion unabhängig vom Abstand zum Startpunkt und unabhängig von ihrer Orientierung ausüben (NUSSINOV 1992). Die ubiquitäre CAAT-Box wird von verschieden- en regulatorischen Proteinen erkannt. Dazu zählen z.B. Faktoren der CTF-Familie (CAAT- binding transcription factor family; ALTMANN et al. 1994) oder der CBF-Familie (NF-Y oder CP-Familie; MAITY u. CROMBRUGGHE 1998).
Ein weiteres cis-aktives proximales Regulationselement ist die sogenannte GC-Box mit der Sequenz GGGCGG. Auch an diese Sequenz können regulatorische Proteine binden. Das be- kannteste ist das Zinkfinger-Protein Sp 1. Interessant ist, daß die Bindung von Sp 1 auch durch Methylierung des Cytosins in der CpG-Position nicht beeinflußt wird (HOLLER et al.
1988). Inzwischen wurde noch eine Reihe weiterer GC-Box-bindender Proteine entdeckt, die die Genexpression regulieren (COOK et al. 1999). Hierzu zählen z.B. Sp 2, Sp 3, Sp 4, die eine hohe Homologie zu Sp 1 aufweisen und zwei weitere Faktoren mit geringerer Homo- logie, BTEB und BTEB 2 (LANIA et al. 1997; NIELSEN et al. 1998). Die GC-Box, die dem Startpunkt am nächsten liegt, befindet sich gewöhnlich im Bereich -40 bis -70. Oftmals sind in einem Promotor mehrere Kopien davon vorhanden, die auch eine unterschiedliche Orien- tierung haben können. Die Anordnung der GC-Boxen ist bei jedem Promotor anders. So liegen im Thymidinkinase-Promotor die GC-Boxen benachbart zu einer CAAT-Box und einer TATA-Box (ARCOT u. DEININGER 1992), während der SV40-Promotor eine tandemartig angeordnete Serie von sechs GC-Boxen stromaufwärts von einer TATA-Box enthält (RIO u.
TJIAN 1984).
Ein weiteres häufig vorkommendes proximales Regulationselement ist das Oktamer bzw. die
Oktamersequenz ATTTGCAT. Die Oktamersequenz wurde ursprünglich im Promotor des Histon H2B-Gens als Bindungsstelle des ubiquitären Oct-1 Proteins charakterisiert (STURM et al. 1988; STURM u. HERR 1988). Man findet diese Oktamersequenz, die von einer ganzen Reihe sogenannter Oktamer-bindenden Proteine erkannt und gebunden wird, aber in zahlrei- chen Promotoren und Enhancern. Auf die Oktamer-bindenden Proteine wird ausführlich in Kapitel 2.5 eingegangen.
In den Promotoren der RNA-Polymerase II sind unterschiedliche Kombinationen dieser Elemente zu finden. Diese Elemente tragen zwar alle zur Promotorfunktion bei, doch gibt es keines, das essentiell ist und in allen Promotoren vorkommen muß, um eine reguläre Expres- sion zu gewährleisten. Lage, Anzahl und Orientierung der proximalen Regulationselemente sind in den verschiedenen Promotoren unterschiedlich. Diese Sequenzelemente beeinflussen die Initiation der Transkription insofern, daß sie durch die gebundenen Proteine auf die allgemeinen Transkriptionsfaktoren der RNA-Polymerase II einwirken und deren Zusammen- lagerung zum Initiationskomplex vorantreiben (LEWIN 1997b).
2.2.2.3 Distale Regulationselemente
Regulatorische cis-Elemente, die in großer Entfernung von den basalen Promotorelementen wie der TATA-Box und dem Inr-Element gelegen sind, werden als distale Regulations- elemente oder als Enhancer bezeichnet. Diese Sequenzbereiche sind typischerweise aus einer Reihe von kurzen z.T. als Repetitionen auftretenden Sequenzmotiven zusammengesetzt, an die verschiedene Transkriptionsfaktoren binden können (DYNAN 1989b). Man findet diese Elemente teilweise viele tausend Basenpaare vom Promotor entfernt, sowohl „Upstream“ als auch „Downstream“. Dabei ist auch bei den Enhancern die relative Orientierung zum Promo- tor unwesentlich (MÜLLER et al. 1988a; MÜLLER u. SCHAFFNER 1990). Der erste beschriebene Enhancer stammt aus dem Simian Virus 40 (BANERJI et al. 1981; MOREAU et al. 1981). Dieser Enhancer besteht aus zwei 72 Basenpaaren langen Sequenzmotiven (HERR u. GLUZMAN 1985). Mutationsanalysen zeigten, daß sich ein 72 Basenpaar langes Sequenz- motiv wiederum aus zwei Abschnitten zusammensetzt (ZENKE et al. 1986). Dabei wirkt jeder einzelne Sequenzabschnitt für sich allein als ein schwacher Enhancer, in Kombination
sind sie dagegen sehr effektiv. Die einzelnen Abschnitte eines Enhancers sind unabhängig voneinander (ZENKE et al. 1986). Jeder Sequenzabschnitt enthält eigene Bindungsstellen für regulatorische Proteine. Mutationen in der einen Hälfte beeinflussen die Bindung der Proteine in der anderen Hälfte nicht (WILDEMAN et al. 1986). Auch eine Veränderung der Abstände zueinander hat keinen Effekt. Selbst wenn man die Sequenzmotive durch Einfügung einer Zwischensequenz voneinander trennt, wird die Aktivität nicht beeinflußt (WILDEMAN et al.
1986).
Der erste zelluläre Enhancer, der entdeckt wurde, ist der Enhancer des Immunglobulingens IgH (BANERJI et al. 1983; GILLIES et al. 1983). Mit dieser Struktur wurde gezeigt, daß der Enhancer nicht nur eine Besonderheit der Transkriptionsregulation bei Viren ist, sondern auch in der Regulation der eukaryotischen Transkription eine wichtige Rolle spielt.
Gewebespezifische Expression kann sowohl durch einen Promotor als auch durch einen Enhancer vermittelt werden. Der Promotor kann spezifisch reguliert sein, und ein naheliegen- der Enhancer fördert nur die Effizienz der Initiation, oder der Promotor untersteht keiner spezifischen Regulation, wird aber erst eingeschaltet, wenn der ihm zugeordnete Enhancer spezifisch aktiviert wird (LEWIN 1997b).
Die Wirkung eines Enhancers erfolgt in analoger Weise zur Wirkung der proximalen Regulationselemente, indem die an den Enhancer gebundenen Proteine mit den allgemeinen Transkriptionsfaktoren oder der RNA-Polymerase interagieren. Entscheidend ist dabei die räumliche Annäherung von Promotor und Enhancer (PTASHNE 1986). Nach dem sogenann- ten „Scanning- oder entry site-Modell“ der Enhanceraktivität sollen die RNA-Polymerase II oder Transkriptionsfaktoren im Enhancer an die DNA binden und dann entlang der DNA zur nächsten Transkriptionsinitiationsstelle wandern (scannen; MOREAU et al. 1981). Wenn eine zusätzliche Proteinbindungsstelle zwischen Enhancer und Promotor eingeführt und mit einem entsprechendem DNA-bindendem Protein besetzt wird, wird die Transkription verhindert (BRENT u. PTASHNE 1984). Interkalierende Substanzen haben den gleichen Effekt (COUREY et al. 1986). Die beiden zuletzt genannten Untersuchungen sprechen für das
„Scanning-Modell“, da in beiden Fällen ein Hindernis zwischen dem Enhancer und dem Promotor nicht überwunden werden kann. Eine Alternative zu diesem Modell ist das soge- nannte „Looping-Modell“, bei dem sich Enhancer und Promotor räumlich annähern, indem die dazwischen liegende DNA schlaufenförmig herausragt (MANIATIS et al. 1987,
STRACHAN u. READ 1996c). Anhand des Loopings der DNA können die negativen und positiven Regulationsmechanismen von Proteinen über eine große Entfernung am besten erklärt werden (PTASHNE 1986). Untersuchungen, in denen die Transkriptionsaktivität eines Gens induziert wurde, indem das Gen durch eine Proteinbrücke mit einem DNA-Fragment, welches den SV 40 Enhancer enthält, verbunden wurde (MÜLLER-STORM et al. 1989), unterstützen das „Looping“ Modell. Ebenso wurde in vivo gezeigt, daß ein Enhancer auf einem Plasmid einen Promotor auf einem anderen, benachbarten Plasmid aktivieren kann (DUNAWAY u. DRÖGE 1989).
Zusätzlich zu diesen regulatorischen Elementen, die im allgemeinen eine aktivierende Wirkung hinsichtlich der Transkription haben, gibt es auch Elemente, die als Silencer bezeichnet werden. Diese können die Transkriptionsrate von Genen zwar reduzieren, aber vermutlich nicht vollständig hemmen (WENZEL u. AMANN 1991). In Abb. 1 ist ein Poly- merase II-Gen schematisch mit den erwähnten Regulationselementen dargestellt.
cis-Elemente
trans-Faktoren
+1 Transkription
Intron -30
TATA- Box prox.
Re dist.
Re
Enhancer
RTF RTF GTF Abb. 1: Schematische Darstellung eines Polymerase II-Gens
Die Regulationselemente werden entsprechend ihrer Entfernung vom Promotor als proximale oder distale Regulationselemente (prox., dist. RE) bezeichnet. Die an die jeweiligen Regulationselemente bindenden Transkriptionsfaktoren werden als regu- latorische Transkriptionsfaktoren (RTF) oder generelle Transkriptionsfaktoren (GTF) bezeichnet.
2.3 Transkriptionsfaktoren
Die RNA-Polymerase II kann die Transkription nicht allein initiieren, sondern ist von zusätz- lichen, zuvor schon erwähnten sogenannten Transkriptionsfaktoren abhängig (MITCHELL u.
TJIAN 1989; DRAPKIN et al. 1993). Jedes Protein, das für die Initiation der Transkription benötigt wird, selbst aber kein Bestandteil der RNA-Polymerase ist, entspricht einem Transkriptionsfaktor (LEWIN 1997b). Transkriptionsfaktoren sind transaktive, sequenz- spezifische DNA-bindende Proteine, die über Bindung an die regulatorischen DNA-Elemente von Genen deren Transkription durch RNA-Polymerasen steuern (MANIATIS et al. 1987;
PTASHNE 1988; MITCHELL u. TJIAN 1989; PTASHNE u. GANN 1990). Die räumlich und zeitlich differenziert auftretende Aktivität von Transkriptionsfaktoren ist Grundlage der differentiellen Genexpression und stellt somit die wesentliche Grundlage für die embryonale Musterbildung und die Ontogenese mehrzelliger Organismen dar (BIGGIN u. TJIAN 1989;
KESSEL u. GRUSS 1990; MELTON 1991).
Bei den Transkriptionsfaktoren werden zwei funktionell unterschiedliche Gruppen unter- schieden: Die allgemeinen Transkriptionsfaktoren (general factors) und die spezifischen bzw.
regulatorischen Transkriptionsfaktoren (KRAJEWSKA 1992).
2.3.1 Allgemeine Transkriptionsfaktoren
Allgemeine Transkriptionsfaktoren sind eine unabdingbare Voraussetzung für die exakte Initiation der Transkription (ROEDER 1991). Durch ein geordnetes Aneinanderfügen der allgemeinen Transkriptionsfaktoren an der TATA-Box entsteht nach Hinzutreten der RNA- Polymerase II der sogenannte Präinitiationskomplex (ROEDER 1991; KRAJEWSKA 1992).
Allgemeine Transkriptionsfaktoren sind durch Chromatographie-Verfahren, kombiniert mit In-vitro-Transkriptionssystemen, isoliert und funktionell charakterisiert worden (ROEDER 1991). Entweder erkennen die Transkriptionsfaktoren direkt charakteristische Promotor- sequenzen, wie z.B. die TATA-Box, oder treten mit der RNA-Polymerase selbst oder anderen promotorassoziierten Faktoren in Wechselwirkung. Entsprechend ihrer Spezifität für ver- schiedene Polymerase-Klassen werden die allgemeinen Transkriptionsfaktoren als TFIX, TFIIX oder TFIIIX bezeichnet, wobei I, II, III auf die entsprechende Polymerase und der
nachfolgende Buchstabe auf eine chromatographische Fraktion verweist, aus welcher die Faktoren ursprünglich isoliert wurden.
Die Bildung von Initiationskomplexen ist besonders gut an den Promotorregionen von RNA- Polymerase II transkribierten Genen charakterisiert worden (BURATOWSKI 1994). Die Transkriptionsfaktoren bilden in einer definierten Reihenfolge einen Komplex, zu dem schließlich die RNA-Polymerase hinzutritt.
Der erste Schritt bei der Entstehung des Komplexes besteht in der Erkennung des Templates durch den Faktor TFIID und seiner Bindung an die TATA-Box (ROWLANDS et al. 1994).
Dieser TFIID-DNA-Komplex wird von TFIIB erkannt, das daraufhin die RNA-Polymerase II und TFIIF rekrutiert. Es folgt hierauf die Bindung von TFIIE und TFIIH an den Multi- Protein-Komplex. Der vollständig ausgebildete Initiationskomplex wird durch eine ATP- abhängige Modifizierung zur Transkription aktiviert (CONAWAY u. CONAWAY 1993).
Der Transkriptionsfaktor TFIID an sich stellt bereits einen größeren Komplex dar, der aus einer TATA-Box-bindenden Komponente, dem TBP (TATA-BOX bindendes Protein), und einer Vielzahl damit assoziierter TAFs (TBP assoziierten Faktoren) besteht (DYNLACHT 1991; PUGH u. TJIAN 1992). Das TBP ist ein im Eukaryotenbereich hoch konserviertes Protein (ROEDER 1991), dessen C-terminale core-Domäne ausreicht, um in vitro eine basale Transkriptionsreaktion in Gang zu setzen. Die peripheren Faktoren determinieren dagegen die Promotor- und Polymerasespezifität und modulieren zudem Wechselwirkungen mit verschie- denen Proteinen (HERNANDEZ 1993).
TBP unterscheidet sich von anderen sequenzspezifischen Faktoren dadurch, daß einmal sowohl die Bindung an die DNA als auch die Dissoziation von der DNA langsamer vonstatten gehen, und es sich im Gegensatz zu fast allen anderen Proteinen an die kleine Furche der DNA bindet (CONAWAY u. CONAWAY 1993). Die Analyse der Kristallstruktur von TBP ergab, daß TBP eine Art Sattel auf der Doppelhelix bildet (STRUHL 1994). Dessen Innen- fläche berührt die DNA, während die Außenfläche mit anderen Proteinen Kontakt aufnehmen kann. Durch die Bindung kommt es zu einer Biegung der DNA, so daß die DNA-Abschnitte links und rechts der TATA-Box in einem Winkel von etwa 80° zueinander stehen (KLUG 1993). Aufgrund der veränderten Raumanordnung der DNA können andere Transkriptions- faktoren und die RNA-Polymerase dichter zusammenrücken als an einer gestreckten DNA.
Auch an TATA-Box-losen Promotoren kommt es zur Bildung des Initiationskomplexes. Als Positionierungselement dient hier der Initiator (s.o.). Durch In-vitro-Rekonstitutionsversuche konnte nachgewiesen werden, daß auch eine von einem TATA-losen Promotor ausgehende Transkription von allen basalen Transkriptionsfaktoren, einschließlich des TFIID, abhängig ist. SMALE und BALTIMORE (1989) zeigten mit Deletionsmutationen im TATA-losen Promotor des TdT-Gens und spezifischen Transkriptionsassays in vivo, daß 17 Nukleotide, die die Transkriptionsstartstelle des Gens umgeben, die gesamte Information für eine exakte TATA-unabhängige Initiation tragen. Mit Ausnahme der Erkennung und der Bindung an die TATA-Box, unterscheiden sich die Initiationsmechanismen an TATA-losen Promotoren im allgemeinen nicht von denen an Promotoren mit einer TATA-Box (WEIS u. REINBERG 1992). Im Gegensatz zu TATA-Box-haltigen Promotoren, an denen der erste Schritt der Komplexbildung im Erkennen und Binden des TFIID an die TATA-Box besteht, scheint bei einem TATA-losen Promotor zuerst die RNA-Polymerase II entweder eigenständig oder über ein sogenanntes Promotor-spezifisches IBP (Inr-bindendes Protein) an das Inr-Element zu binden (WEIS u. REINBERG 1992, HERNANDEZ 1993). Diese schwache DNA-Protein- Interaktion wird dann durch den Zutritt weiterer genereller Transkriptionsfaktoren stabilisiert.
Für TATA-lose Promotoren, die ein Inr-Element besitzen, das der Sequenz nach nicht dem Typ des Initiatorelements des TdT-Gens entspricht, wird ebenfalls die Bindung weiterer Faktoren an dieses Inr-Element diskutiert, die dann mit der RNA-Polymerase II und basalen Transkriptionsfaktoren interagieren. Ein derartiger zusätzlich Faktor ist z.B. der sogenannte
„tethering factor“, der zusammen mit Sp 1 über eine Protein-Protein Interaktion das TBP an den TATA-Box-losen Promotor bindet (PUGH u. TJIAN 1991).
2.3.2 Regulatorische Transkriptionsfaktoren
Transkriptionsfaktoren, die nur bei einer geringen Anzahl von Genen eines Organismus trans- kriptionsregulierend wirken, werden als regulatorische bzw. als spezifische Transkriptions- faktoren bezeichnet. Sie sind in der Lage, die Aktivität des Initiationselementes der Transkrip- tion zu modulieren (LILLIE u. GREEN 1989). In ihrem molekularen Aufbau weisen viele Transkriptionsfaktoren eine modulare Zusammensetzung einzelner sogenannter Struktur- domänen auf, die gleichzeitig funktionelle Domänen repräsentieren. Derartige Funktions-
domänen erfüllen z.B. die Aufgaben der spezifischen DNA-Erkennung und DNA-Bindung (DNA-Bindungsdomänen) oder der Transkriptionsaktivierung (Transaktivierungsdomänen).
Die Transaktivierungsdomänen sind häufig durch einen erhöhten Anteil repetitiver Amino- säuresequenzen charakterisiert. Anhand dieser Aminosäuren werden sie in Glutamin-, Serin/Threonin- bzw. Prolin-reiche sowie azide Transaktivierungsdomänen untergliedert (SEIPEL et al. 1992). So ist z.B. die carboxyterminale Transaktivierungsdomäne von Oct-1 durch einen hohen Gehalt an Serinen und Threoninen gekennzeichnet (TANAKA et al. 1988), wohingegen sich in der transkriptionellen Aktivierungsdomäne von Sp 1 gehäuft Glutamin- reste finden lassen (COUREY u. TJIAN 1988; COUREY et al. 1989). Die transaktivierenden Proteinmodule von VP 16, einem viralen Genprodukt von Herpes Simplex, zeichnen sich durch eine Aneinanderreihung saurer Aminosäuren aus (TANAKA et al. 1988; HERR u.
CLEARY 1995). Im Vergleich dazu ist die Transaktivierungsdomäne von NF 1/CTF 1 reich an Prolinen (MERMOD et al. 1989).
Transkriptionsfaktoren müssen nicht immer aktivierend wirken, sie können auch als Inhibi- toren oder Repressoren auftreten (LEVINE u. MANLEY 1989; COWELL 1994). Ein Repres- sor kann beispielsweise dadurch wirken, daß er mit einem trankriptionellen Aktivator um identische oder nahe benachbarte cis-aktive DNA-Bindestellen konkurriert (Kompetition;
DESCOMBES u. SCHIBLER 1991; FOULKES et al. 1991). In anderen Fällen scheint der Inhibitor mit einem Aktivator direkt zu interagieren und durch die Wechselwirkung entweder die transaktivierende Wirkung aufzuheben („Quenching“; KELEHER et al. 1992) oder dessen Bindung an cis-aktive DNA-Sequenzen zu verhindern („Squelching“; MEYER et al. 1989).
Ein drittes Modell führt die reprimierenden Eigenschaften eines Transkriptionsfaktors auf die Interaktion mit Elementen der basalen Transkriptionsmaschinerie zurück, wodurch deren Ak- tivität eingeschränkt wird (direkte Repression; BANIAHMAD et al. 1990). Schließlich kann die Aktivität eines Transkriptionsfaktors von Wechselwirkungen mit anderen Transkriptions- faktoren abhängig sein. Ein DNA-bindendes Protein mit einer niedrigen transkriptionellen Aktivität kann beispielsweise durch Interaktionen mit einem nicht DNA-bindenden Protein, das jedoch eine starke Aktivierungsdomäne enthält, in einen potenten Aktivator umgewandelt werden (STERN et al. 1989).
Die Bindung an die DNA mit Hilfe der DNA-Bindungsdomäne ist Voraussetzung für die Aktivierung der Transkription. Die DNA-bindende Domäne bringt demnach die
Transaktivierungsdomäne in die Nähe des Startpunktes (LEWIN 1997b). Vergleiche der Aminosäuresequenzen von spezifischen Transkriptionsfaktoren ermöglichten die Identifi- zierung von Proteindomänen, die zur Bindung an die DNA führen (PTASHNE 1988). Dies führte zu der heute üblichen Klassifizierung spezifischer Transkriptionsfaktoren entsprechend ihrer DNA-Bindungsmodule (PABO u. SAUER 1992), deren wichtigste Vertreter im folgenden beschrieben werden.
2.4 Strukturmotive (DNA-Bindungsdomänen) 2.4.1 Zink-Finger-Motiv
Die „Zink-Finger-Struktur“ wurde zuerst im Transkriptionsfaktor TFIIIA von Xenopus entdeckt (BROWN et al. 1985; MILLER et al. 1985). TFIIIA ist zusammen mit der RNA- Polymerase III zur Transkription der 5S-rRNA-Gene verantwortlich. Inzwischen hat man das Zink-Finger-Motiv auch in verschiedenen anderen eukaryotischen Transkriptionsfaktoren, die für die Genexpression verschiedener RNA-Polymerasen II- und RNA-Polymerasen III-Gene verantwortlich sind, nachgewiesen. Ein bekanntes Mitglied dieser Zink-Finger-Proteine ist z.B. der Transkriptionsfaktor Sp 1 (COOK et al. 1999). In der DNA-Bindungsdomäne von Sp 1 konnten drei Zink-Finger-Motive nachgewiesen werden (KADONAGA et al. 1988).
Proteine dieser Familie bestehen in der Regel aus neun sich wiederholenden, konservierten Einheiten von ca. 30 Aminosäuren, die durch folgende Konsensussequenz charakterisiert sind (KRAJEWSKA 1992):
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His.
Jede Einheit enthält also zwei Cystein- und zwei Histidinpaare. Die Bezeichnung „Zink- Finger“ ist eine topologische Definition. Namensgebend ist die Schlaufe aus Aminosäuren, die durch die Bindung des Zinkions hervorgerufen wird.
Die Zinkatome werden innerhalb einer von den Cys- und His-Resten gebildeten tetraedri- schen Struktur festgehalten (s. Abb. 2; Cys2/His2-Motiv). Die Proteine der Zink-Finger- Familie können bis zu 37 Zinkfinger enthalten, die in einer Reihe tandemartig hintereinander angeordnet sind. Das Verbindungsstück zwischen den einzelnen „Fingern“ besteht aus einer
konservierten Sequenz aus sieben Aminosäuren (Thr-Gly-Glu-Lys-Pro-Tyr-X; KRAJEWSKA 1992). Analysen der Kristallstruktur ergaben, daß es in den Zink-Fingern zu einer Ausbildung eines antiparallelen β-Faltblatts und einer dazwischen liegenden α-Helix kommt. Die zwei Cysteinreste, die sich im β-Faltblatt und die zwei Histidinreste, die sich in der α-Helix befin- den (BERG 1988; LEE et al. 1989), verbinden sich mit dem Zinkatom und bilden eine kompakte, globuläre Domäne (PARRAGA et al. 1988). Jede Einzelhelix, d.h. jeder Finger geht zwei sequenzspezifische Kontakte mit der DNA ein. Das Zinkion ist für die Ausbildung der Tertiärstruktur und damit für die Bindung an die DNA essentiell (LEE et al. 1991). Die Rolle des Zinkions scheint zwar nur struktureller Natur zu sein, indem es über Disulfid- brücken zwei Teile eines Proteins miteinander verbindet (KLUG u. RHODES 1987), doch die Untersuchungen von MILLER et al. (1985) - in denen die Fähigkeit verschiedener Metall- ionen getestet wurde, das teilweise dissoziierte Protein zu verbinden - zeigen, daß die Aus- bildung der typischen Zink-Finger nur in Anwesenheit von Zink erfolgt und nicht durch andere Metallionen substituiert werden kann.
Eine ähnliche Struktur findet sich bei den Steroidrezeptoren (PABO u. SAUER 1992). Diese Form des Zinkfingers bezeichnet man als Cys2/Cys2-Finger, da hier das Zinkatom durch vier Cysteinreste gebunden wird. Proteine mit Cys2/Cys2-Motiv besitzen häufig nur sehr wenige Finger. Der Glucocorticoid- und der Östrogenrezeptor z.B. besitzen jeweils zwei Finger, die jeweils zwei α-Helices bilden (HARD et al. 1990; SCHWABE et al. 1990).
Auch der Hefe-Transkriptionsfaktor Gal 4 bildet Zink-Finger-Domänen aus. Sowohl der Transkriptionsfaktor Gal 4 als auch die Glucocorticoid- und Östrogenrezeptoren werden aufgrund einer unterschiedlichen Konsensussequenz und einer unterschiedlichen Struktur anderen Subklassen der Zink-Finger-Proteine zugeordnet. Im Fall des Glucocorticoid- rezeptors wird von sogenannten „Zink-Twist-Proteinen“ gesprochen. Da im Transkriptions- faktor Gal 4 zwei Zinkatome von sechs Cystein-Resten gebunden werden, werden diese als
„Zink-Cluster“ bezeichnet (VALLEE et al. 1991).
Abb. 2: Schematische Darstellung eines Zink-Fingers
Das Zinkion wird innerhalb einer von zwei Cystein- und zwei Histidin-Resten gebildeten tetraedrischen Struktur festgehalten, wodurch die anderen dazwischen liegenden Aminosäuren eine Schlaufe bilden, die von der Zinkbindungsstelle absteht und in diesem Fall als Cys2/His2-Finger bezeichnet wird. Ein Finger umfaßt gewöhnlich ca. 23 Aminosäuren.
(nach STRACHAN u. READ 1996b)
2.4.2 Leucin-Zipper (bZip-Motiv)
Ein weiteres Motiv, das in einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren identifiziert wurde, ist der Leucin-Zipper (Zipper = Reißverschluß). Erste Hinweise auf dieses Strukturmotiv ergaben sich aus Sequenzanalogien der Onkogene Fos (CURRAN u. FRANZA 1988), Myc (BENEZRA et al. 1990) und Jun (RAUSCHER et al. 1988a). Jedoch ist die Struktur erst nach der Klonierung des CAAT-Box bindenden Proteins C/EBP weiter aufgeklärt worden (LANDSCHULZ et al. 1988). Ein weiteres bekanntes Beispiel aus dieser Gruppe ist der Transkriptionsfaktor GCN 4 der Hefe (O´SHEA et al. 1991). Das charakteristische Merkmal der Leucin-Zipper-Sequenzen ist das sogenannte Heptad-Repeat: Innerhalb einer Sequenz von ca. 30-40 Aminosäuren folgen vier oder fünf Leucinreste exakt im Abstand von sieben
Aminosäuren (LANDSCHULZ et al. 1988). Diese regelmäßige Anordnung erlaubt die Bildung einer amphipathischen α-Helix, bei der sich die hydrophoben Gruppen, einschließ- lich Leucin, alle auf einer Seite der Helix befinden (s. Abb. 3). Diese Leucinreste auf einem Protein können aus der α-Helix herausragen und sich mit den Leucinresten des parallel aus- gerichteten Reißverschlusses eines zweiten Proteins verzahnen, wobei eine spiralisierte Spirale (coiled coil) entsteht (O´SHEA et al. 1989). Die Proteine der Leucin-Zipper-Familie besitzen die Fähigkeit zu Dimerisierung. Dies beinhaltet sowohl die Homodimerisierung zweier identischer Untereinheiten als auch die Heterodimerisierung zweier unterschiedlicher, aber kompatibler Untereinheiten. Diese Fähigkeit der Dimerisierung ist ein entscheidender Punkt für die DNA-Bindung (KRAJEWSKA 1992). Bei der Dimerisierung entsteht letztlich eine Y-förmige Struktur, in der die beiden Leucin-Reißverschlüsse zusammen den Stamm formen, und die beiden basischen Regionen sich symmetrisch abspreizen, um die DNA- bindenden Arme zu bilden. Diese Struktur bezeichnet man als bZip-Motiv (Lewin 1997c), d.h. die Leucin-Zipper-Region vermittelt die Fähigkeit zur Dimerisierung, während der basische Bereich für die Interaktion mit der DNA verantwortlich ist (LANDSCHULZ 1988).
Während sich GCN 4 und C/EBP als Homodimere an die DNA anlagern (HU et al. 1990), weisen die Proteine Jun und Fos die Besonderheit auf, als Heterodimere wesentlich besser an die DNA binden zu können (BENBROOK u. JONES 1990; FOULKES et al. 1991). So besteht der aktive Transkriptionsfaktor AP-1 aus einem Fos-Protein und einem Jun-Protein (CURRAN u. FRANZA 1988; RAUSCHER et al. 1988a, b). Das entsprechende Jun-Jun- Homodimer bindet zwar mit der gleichen Sequenzspezifität wie AP-1 an die DNA, die Affinität des Heterodimers für die AP-1 Zielsequenz ist aber etwa zehnmal so hoch wie die des Jun-Jun-Homodimers. Das Onkogen Fos kann gar keine Homodimere bilden, sondern sich nur in Form von Heterodimeren an die DNA binden (LEWIN 1997c).
Diese Beispiele zeigen, daß durch die Möglichkeit zur Bildung heterodimerer Proteine eine wesentlich größere Variabilität und Flexibilität bei der Transkriptionskontrolle erzielt werden kann (STRUHL 1989).
Abb. 3: Schematische Darstellung eines Monomers des Leucin-Zippers
In der amphipathischen α-Helix befinden sich die regelmäßig angeordneten hydrophoben Leucinreste auf der einen Seite der Helix, die positiv geladenen Gruppen auf der anderen Seite. Die Leucinreste der einen Seite können mit Leucinresten eines anderen Monomers in Wechselwirkungen treten und so das bZip- Motiv bilden.
(nach STRACHAN u. READ 1996b)
2.4.3 Helix-loop-Helix-Motiv (HLH)
Das Helix-loop-Helix-Motiv ist mit dem Leucin-Zipper-Motiv verwandt. Proteine dieser Gruppe besitzen ebenfalls die Eigenschaft dimerisieren zu können.
Die DNA-Bindungsdomäne enthält einen ca. 60 Aminosäure langen Bereich, der aus zwei amphipathischen α-Helices besteht, die über ein variables Verbindungsstück (loop), beste- hend aus 9-20 Aminosäuren, miteinander verknüpft sind (s. Abb. 4; KRAJEWSKA 1992).
Die meisten HLH-Proteine enthalten benachbart zum HLH-Motiv einen basischen Abschnitt.
Ähnlich wie bei den Proteinen der Leucin-Zipper-Familie vermittelt auch hier die basische Region die DNA-Bindung, während die Helix-loop-Helix-Region für die Dimerisierung verantwortlich ist.
Das HLH-Motiv findet man z.B. in den Proteinen E 12 und E 47, die an ein Element in einem
Immunglobulin-Gen-Enhancer binden, in den Transkriptionsfaktoren MyoD, die an der Steuerung der Myogenese beteiligt sind, und in den Myc-Proteinen, die an der Wachstums- regulation mitwirken (MURRE et al. 1989a). E 12 und E 47 gehören zu den ubiquitär expri- mierten Proteinen, während MyoD gewebespezifisch in Muskelzellen exprimiert wird. Die Aktivität der HLH-Proteine kann durch die Dimerisierung moduliert werden (PABO u.
SAUER 1992). Es wird vermutet, daß ubiquitär exprimierte HLH-Proteine mit gewebe- spezifisch exprimierten Proteinen dimerisieren, so daß letztere mit hoher Affinität an die Zielsequenz binden (MURRE et al. 1989b). Die Dimerisierung kann aber auch zu einer In- aktivierung der Heterodimere führen. So führt die Entstehung von MyoD/E 12-Heterodimeren zu einer DNA-Bindung und Auslösung der Muskelzelldifferenzierung. Vor dem Einsetzen der Muskelzelldifferenzierung bindet ein anderes Mitglied der HLH-Familie, das Id-Protein, an MyoD und/oder E 12, so daß Heterodimere entstehen, die zur DNA-Bindung unfähig sind (BENEZRA et al. 1990). Das gleiche Prinzip des antagonistisch wirkenden Id-Proteins ist bei der Inaktivierung von Immunglobulin-Enhancer-bindenden Proteinen während der Entwick- lung der B-Lymphozyten vorhanden (WILSON et al. 1991).
Abb. 4: Schematische Darstellung des HLH-Motivs
Das HLH-Motiv besteht aus zwei amphipathischen α-Helices, die durch ein dazwischen-liegendes Verbindungsstück (Loop) aus einer variablen Anzahl von Aminosäuren verbunden werden.
(nach STRACHAN u. READ 1996b)
2.4.4 Helix-Turn-Helix-Motiv (HTH)
Das Helix-Turn-Helix-Motiv (HTH) war die erste DNA-Erkennungsstruktur, die anhand von Strukturanalysen bei prokaryotischen DNA-bindenden Proteinen identifiziert wurde (PABO u. SAUER 1992). Die ersten Kristallstrukturen, die charakterisiert wurden, waren die des λ-Cro-Proteins (ANDERSON et al. 1981; OHLENDORF et al. 1982), des Cap-Proteins von E.coli (McKAY u. STEITZ 1981) und der Bindungsdomäne des λ-Repressors (PABO u.
LEWIS 1982). Vergleiche dieser drei Proteine im Bereich des konservierten Erkennungs- motivs zeigten die Ausbildung einer α-Helix, eines „Turns“ und einer zweiten Helix. Beide Helices stehen in einem Winkel von ca. 120° (s. Abb. 5; STEITZ et al. 1982; OHLENDORF et al. 1983). Die beiden Helices liegen also im Gegensatz zu den Helices im HLH-Motiv nicht in derselben Ebene. Diese räumliche Anordnung der Helices ist für sich alleine nicht sehr stabil, sondern wird meistens noch durch eine dritte Helix des restlichen Proteins stabilisiert
(KLUG 1995). Die C-terminal gelegene Helix fungiert als spezifische „Erkennungs- bzw.
Bindungshelix“, da die Aminosäuren dieser Helix spezifische Basen in der großen Furche der DNA direkt kontaktieren (STRUHL 1989). Dabei ist offenbar nur eine relativ kleine Anzahl von Aminosäuren in der „Erkennungshelix“ für die Herstellung spezifischer Kontakte mit der DNA zuständig (KRAJEWSKA 1992). Die andere Helix, die über der großen Furche liegt, interagiert unspezifisch mit der DNA und stabilisiert den Komplex (STRUHL 1989). Diese Helix scheint auch eine wichtige Rolle bei den Dimerisierungsprozessen zu spielen, da prokaryotische HTH-Proteine als Dimere an die DNA binden.
PABO und SAUER (1992) betonen, daß das HTH-Motiv im Unterschied zu anderen DNA- Bindungsmotiven keine eigenständige, stabile Domäne bildet. Es stellt lediglich eine Unter- einheit bzw. einen Teil einer größeren strukturellen Domäne dar und kann sich im Kontext verschiedener anderer Strukturen befinden. Jedoch sollte nicht von der sogenannten
„Erkennungshelix“ im HTH-Motiv gesprochen werden, da noch andere Bereiche in Domänen außerhalb des HTH-Motivs zur DNA-Erkennung und DNA-Bindung beitragen (PABO u.
SAUER 1992).
Abb. 5: Schematische Darstellung des HTH-Motivs
Das HTH-Motiv besteht aus zwei kurzen α-Helices, die durch eine kurze Amino- säuresequenz voneinander getrennt werden. Dies führt zu einer Drehung, so daß die beiden α-Helices unterschiedlich ausgerichtet sind.
(nach STRACHAN u. READ 1996b)
2.4.4.1 Homeodomäne (Homeobox)
In eukaryotischen Organismen wurde das Helix-Turn-Helix-Motiv zunächst in verschiedenen Proteinen, die bei Drosophila melanogaster in der frühen Embryonalentwicklung eine Schlüsselrolle einnehmen, entdeckt (STRUHL 1989). Gemeinsames Merkmal dieser Proteine ist ein Bereich von 60 Aminosäuren, die Homeodomäne, die das DNA-bindende Motiv dar- stellt. Die Homeodomäne ähnelt zwar dem vorher beschriebenen HTH-Motiv, ist aber im Unterschied zur isolierten HTH-Einheit länger und stellt eine stabile Struktur dar, die die DNA separat binden kann (SAUER et al. 1988; AFFOLTER et al. 1990). Die Struktur der Homeobox wurde zuerst durch 2D NMR-Studien der Drosophila Antennapedia (Antp) Homeodomäne charakterisiert (QIAN et al. 1989; BILLETER et al. 1990). Die Analyse der Kristallstruktur der Drosophila engrailed-Homeodomäne zeigt, daß die Homeodomäne drei Helices und einen verlängerten N-terminalen Arm enthält (KISSINGER et al. 1990). Helices
1 und 2, die durch eine Loop-Region voneinander getrennt sind, liegen antiparallel zuein- ander, während die 3. Helix senkrecht dazu angeordnet ist. Die Helices 2 und 3 bilden das HTH-Motiv (TREISMAN et al. 1992). Entsprechend zu diesem Motiv lagert sich Helix 3 der Homeodomäne in die große Furche der DNA an und übernimmt damit wie in dem isolierten HTH-Motiv die Mehrzahl der Protein-DNA-Kontakte. Zusätzlich bindet der N-terminale Arm der Homeodomäne spezifische Basen der kleinen Furche, so daß sowohl der N-terminale Arm als auch die Helix 3 separate spezifische Kontakte zur DNA bilden (s. Abb. 6; LAUGHON 1991). Auch der Loop zwischen Helix 1 und Helix 2 interagiert mit der DNA auf der Rückseite der großen Furche.
Abb. 6: Darstellung der Bindung der Homeodomäne an die DANN
Die Helix 3 der Homeodomäne bindet in der großen Furche der DNA, die Helices 1 und 2 liegen quer über der Doppelhelix. Der N-terminale Arm geht in der kleinen Furche Kontakte mit der DNA ein.
(nach LEWIN 1997c)
Diese Homeobox existiert nicht nur in Prokaryoten und in Drosophila, sondern ist auch in vielen regulatorischen Proteinen von Pilzen, Pflanzen und Vertebraten zu finden (GEHRING 1994). Solche Proteine werden als Homeobox-Transkriptionsfaktoren bezeichnet. Die Funk- tionen dieser Transkriptionsfaktoren wurden insbesondere während der frühembryonalen Entwicklung von Drosophila melanogaster untersucht. Homeobox-Transkriptionsfaktoren sind am Aufbau der Anterior/posterior-Achse, an der Segmentierung des Embryos und der Spezifikation der Segmentidentität beteiligt (KORNBERG u. TABATA 1993). Die für den letzten Prozeß erforderlichen Homeobox-Gene bilden einen Genkomplex, dessen Anordnung längs des Chromosoms mit der Expression längs der Anterior/posterior-Achse korreliert (GEHRING 1994). In Vertebraten existieren ebenfalls solche Genkomplexe, deren konstitu- ierende Gene als Hox-Gene bezeichnet werden (AKAM 1989). Auch bei Vertebraten besteht eine lineare Beziehung zwischen der Anordnung der Hox-Gene und deren anterior/posterioren Expression (GRAHAM et al. 1989). Diese Korrelation wird z.B. im zentralen und peripheren Nervensystem (WILKINSON et al. 1989) und während der Entwicklung der Gliedmaßen (DOLLE et al. 1989) beobachtet. Neben ihrer großen Bedeutung während der embryonalen Entwicklung werden diesen Genen zunehmend Funktionen in der Entwicklung humaner Tumoren zugeordnet (DESCHAMPS und MEIJLINK 1992).
Außer diesen klassischen Homeobox-Genen existieren weitere Genfamilien, deren Mitglieder zusätzlich zu der Homeodomäne noch ein zweites konserviertes Sequenzmotiv enthalten. Ein solches Motiv ist z.B. die paired-Box, die zuerst in drei Segmentierungsgenen von Drosophila melanogaster identifiziert wurde (BOPP et al. 1986), aber auch in Vertebratengenen (z.B. die Pax-Gene) nachgewiesen werden kann.
Ein weiteres häufig in Assoziation mit der Homeodomäne zu findendes Motiv ist die LIM- Domäne, eine Cystein- und Histidin-reiche Region, die zuerst in den Homeobox enthaltenden Proteinen Lim-11, Isl-1 und Mec-3 identifiziert wurde (FREYD et al. 1990; KARLSSON et al. 1990). Die LIM-Domäne kann für sich alleine nicht an die DNA binden, doch können LIM-Domänen enthaltende Proteine möglicherweise einen indirekten, regulatorischen Effekt ausüben, wobei diese Domäne Protein-Protein Interaktionen vermittelt (SANCHEZ-GARCIA et al. 1993).
Eine weitere, sehr wichtige Subklasse von Homeobox enthaltenden Proteinen, die ein zweites Motiv neben der Homeodomäne enthalten, bildet die Familie der POU-Proteine.
