Bedeutung des Insulin-like growth factor - Systems während der Oozytenreifung und
präimplantorischen Embryonalentwicklung des Rindes
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften
- Doctor rerum naturalium - (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von Friederike Poppicht
Lohne
Hannover 2015
Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit tierärztlicher Ambulanz,
Professur für Molekulare Reproduktionsmedizin Justus-Liebig-Universität Gießen
Prof. Dr. Pablo Steinberg
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Pablo Steinberg
2. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. Meinecke-Tillmann
Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2015
Die vorliegende Arbeit wurde durch die H. W. Schaumann Stiftung gefördert.
Für Thomas
in Liebe und Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
2. Literatur ... 4
2.1 Insulin-like growth factor – System ... 4
2.1.1 Liganden des IGF-Systems ... 4
2.1.2 Rezeptoren des IGF-Systems ... 6
2.1.3 Bindungsproteine des IGF-Systems ... 8
2.1.4 Rolle des IGF1 während der Pubertät und Trächtigkeit von Rindern... 9
2.2 In-vitro-Produktion von Embryonen ... 12
2.2.1 Rolle von IGF1 während der Eizellreifung und frühen bovinen Embryonalentwicklung in vitro ... 15
2.2.3 Genomaktivierung in bovinen Embryonen ... 24
2.3 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Embryonen ... 26
2.3.1 Insulin-like growth factor 1 - Rezeptor während der bovinen Embryonalentwicklung ... 26
2.3.2 Insulin-like growth factor – Bindungsproteine ... 27
2.3.3 Glukosetransporter ... 28
2.3.4 Anti-apototische (B-cell CLL/lymphoma 2 like 1) und pro-apoptotische Gene (BCL2-assoziiertes X Protein) der BCL2-Familie ... 30
2.4 Ziele des vorliegenden Projektes ... 32
3. Material und Methoden ... 33
3.1 In-vitro-Produktion ... 33
3.1.1 Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe ... 33
3.1.2 In-vitro-Maturation ... 35
3.1.3 In-vitro-Fertilisation ... 37
3.1.4 In-vitro-Kultivierung ... 39
3.2 Beurteilung der Reifung durch Färbung mit Hoechst 33342 ... 40
3.3 Untersuchung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium ... 41
3.4 Teilungs- und Entwicklungsraten ... 45
II
3.5 Lebend-Tot-Färbung mit Hoechst und Ethidium homodimer ... 46
3.6 Nachweis apoptotischer Zellen durch TUNEL-Färbung ... 48
3.7 MessengerRNA - Analyse mittels RT-qPCR ... 50
3.7.1 Isolierung der mRNA ... 50
3.7.2 Reverse Transkription ... 52
3.7.3 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion ... 53
3.8 Darstellung des IGF1R-Proteins ... 57
3.8.1 Gelelektrophorese ... 57
3.8.2 Western blot ... 58
3.8.3 Ladungskontrolle zur semi-quantitativen Auswertung der Proteinmenge . 59 3.8.4 Antikörper zum Nachweis des IGF1R im Rind ... 60
3.9 Immunfluoreszenzfärbung des IGF1R ... 62
3.9.1 Vorbehandlung der Embryonen und Inkubation mit dem 1. Antikörper .... 63
3.9.2 Inkubation mit dem 2. Antikörper, Zellkernfärbung und Darstellung der Färbung ... 63
3.10 Statistische Auswertungen ... 65
3.11 Allgemeiner Versuchsaufbau ... 66
3.11 Allgemeiner Versuchsaufbau ... 66
3.11.1 Einfluss der Supplementation unterschiedlicher IGF1-Konzentrationen . 66 3.11.1 Einfluss der Supplementation unterschiedlicher IGF-1 Konzentrationen ... 66
3.11.2 Vergleichende Untersuchung der Expression des IGF1R ... 67
4. Ergebnisse ... 68
4.1 Ermittlung der Teilungs- und Entwicklungsraten ... 68
4.2 Bestimmung der Kernreifungsraten ... 71
4.3 Untersuchung der IGF1-Konzentrationen im Medium ... 74
4.4 Resultate der Lebend-Tot-Färbung ... 76
4.5 Resultate der Färbung apoptotischer Zellen ... 79
4.6 Nachweis entwicklungsrelevanter Gentranskripte ... 81
4.6.1 MessengerRNA-Expression ausgewählter Gene nach IVM mit verschiedenen Zusätzen ... 81
4.6.2 Stadienspezifische mRNA-Expression des IGF1R ... 83
III
4.7 Nachweis der Proteinexpression des IGF1R ... 83
4.7.1 Proteinnachweis mittels Western blot ... 84
4.7.2 Proteinnachweis mittels Immunfluoreszenzfärbung... 87
4.8 Vergleich der stadienspezifischen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R ... 89
5. Diskussion ... 90
5.1 Einfluss einer IGF1-Supplementation auf die morphologische Qualität boviner Embryonen ... 91
5.2 Expressionsmuster spezifischer Gentranskripte nach In-vitro-Maturation boviner KOK mit IGF1 ... 94
5.3 Untersuchung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium ... 97
5.4 Vergleichende Expression des IGF1R in Stadien der frühen Embryonalentwicklung ... 99
5.5 Schlussfolgerung ... 102
6. Zusammenfassung ... 105
7. Summary ... 109
8. Anhang ... 112
8.1 Medien der IVP ... 112
8.1 Medien für Proteinbestimmungen ... 118
8.3 Medien für die Färbungen ... 122
8.4 Labormaterial und Geräte... 123
8.5 Einzeldaten der durchgeführten Untersuchungen ... 126
9. Verzeichnisse ... 129
9.1 Abkürzungsverzeichnis... 129
9.2 Abbildungsverzeichnis ... 134
9.3 Verzeichnis der Tabellen ... 137
9.4 Literaturverzeichnis ... 140
Veröffentlichungen ... 168
Erklärung ... 169
Danksagung ... 170
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1. Einleitung
Beim Rind ist die Analyse der frühen embryonalen Entwicklung durch den Einsatz biotechnologische Methoden zu einem bedeutenden Bereich in der Reproduktionsmedizin geworden. Die In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen wird heute routinemäßig zur Gewinnung einer großen Anzahl Nachkommen bestimmter Zuchttiere genutzt und findet daher auch in der Forschung häufig Anwendung, um die daraus resultierenden Probleme und Fragestellung zu untersuchen. So können Einflüsse äußerer Einwirkungen, wie die Gaskonzentration oder die Zusammensetzung des Kultivierungsmediums, auf den Embryo und dessen Genexpression analysiert werden. Diese Studien dienen dem besseren Verständnis entwicklungsrelevanter Prozesse und gestatten es, Aussagen über die Qualität der Embryonen zu treffen, da deren Entwicklung von der korrekten Ausführung des genetischen Programms abhängig ist (WRENZYCKI et al. 1998). Die meisten Untersuchungen auf molekularer Ebene fanden im bovinen Embryo bisher durch Betrachtung der relativen Menge spezifischer Gentranskripte statt. Eine Reihe von Vorgängen konnte bereits analysiert und in den Entwicklungskontext gebracht werden, da diese Methode mit einer geringen Probenmenge und einem großen Durchsatz durchführbar ist. Zur vollständigen Analyse der Qualität und Entwicklung von Embryonen sind jedoch weitere Studien notwendig, die auf die Endprodukte der Gensynthese, also die Proteine und deren Funktionalität, eingehen. Dabei kann die Lokalisation eines Proteins zur Aufklärung von dessen Funktion beitragen. Erstere wird durch die Methode der Immunhistochemie oder Immunfluoreszenzfärbung bestimmt. Die Quantität eines Proteins kann wiederum anhand der Messung der Signalintensität definiert werden. Die Methode des Western blots eignet sich ebenfalls zum Nachweis und zur Quantifizierung eines Proteins, benötigt jedoch ein großes Probenvolumen. Bisher fanden nur wenige Untersuchungen auf Proteinebene am präimplantorischen Embryo des Rindes statt. Aus diesem Grund ist das Interesse groß, das Protein genauer zu untersuchen und zu ermitteln, inwieweit sich dieses von bisherigen Studien der mRNA (messenger ribonucleic acid) unterscheidet. Gerade die Genexpression des Embryos ist im Vergleich zu somatischen Zellen in ihrer Art außergewöhnlich. Das frühe Entwicklungsprogramm
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des Embryos wird zunächst von maternalen Transkripten und Proteinen kontrolliert und widerfährt im Rind erst im 8- bis 16-Zellstadium eine Umstellung, auf die Transkription embryo-spezifischer Gene, die sogenannte maternal-embryonic transition (MET).
Das Insulin-like growth factor (IGF) - System ist eine wichtige Familie von Faktoren, die an der Regulation physiologischer Prozesse beteiligt sind. Sie spielen eine wesentliche Rolle beim Wachstum und der Entwicklung embryonaler, fetaler und plazentarer Gewebe (BAUER et al. 1998, FOWDEN 2003). Zusätzlich konnte bei dem Insulin-like growth factor 1 (IGF1) eine antiapoptotische Wirkung nachgewiesen werden. So führte die Zugabe von IGF1 zum Maturations- oder Kultivierungsmedium boviner Embryonen zu einer Abnahme apoptotischer Zellen (BYRNE et al. 2002, WASIELAK u. BOGACKI 2007). Die IGF1-Signalübertragung erfolgt über die spezifische Bindung an den membranständigen Insulin-like growth factor 1-Rezeptor (IGF1R). Dieser Rezeptor spielt nachweislich eine entscheidende Rolle bei der Embryonalentwicklung und ist in seiner Funktionalität entwicklungsrelevant. Die Expression des IGF1-Rezeptors gilt zudem als ein potentieller Marker für die Qualität in vitro produzierter Embryonen (LIU et al. 1997).
Ein Zusammenhang mit der Verfügbarkeit von IGF1 wurde unter anderem auch bei dem PCO-Syndrom (Polyzystisches Ovarsyndrom) der Frau durch Untersuchungen bei der Maus gefunden (CHI et al. 2000). So konnte nach Zugabe einer supraphysiologischen Konzentration an IGF1 zum Kultivierungsmedium während der IVP muriner Embryonen eine Herunterregulation des IGF1R-Proteins gemessen werden, was zu einer gesteigerten Apoptose führte und der Grund für erhöhte embryonale Mortalität sein könnte. Weiterhin reduzieren die Veränderungen, die während der Phase der negativen Energiebilanz bei Hochleistungsrindern kurz vor und nach der Abkalbung auftreten, die Bioverfügbarkeit von zirkulierendem IGF1, was zu einer Verlangsamung des follikulären Wachstums und einer verspäteten Ovulation führt (WATHES et al. 2007). Ferner führen die metabolischen Veränderungen direkt oder indirekt durch Schädigung der follikulären Umgebung zu einer Verschlechterung der Oozytenqualität und der Embryonalentwicklung (WATHES et al. 2007). Für eine Optimierung der Therapien von
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Fruchtbarkeitsstörungen und assistierten Reproduktionstechniken ist ein besseres Verständnis von Schlüsselprozessen der frühen Embryonalentwicklung von großer Bedeutung. Das Rind als Modellorganismus eignet sich besonders gut zur Untersuchung dieser Prozesse, da gerade die bovine Embryonalentwicklung der humanen in vielerlei Hinsicht ähnlich ist (WRENZYCKI et al. 2005).
Ziel dieses Projektes ist es, die Proteinexpression des Insulin-like growth factor 1 – Rezeptors während der Maturation und der frühen embryonalen Entwicklung zu untersuchen. Dafür erfolgt eine Austestung unterschiedlicher Antikörper, die einen sensitiven Nachweis des IGF1R in bovinen Embryonen ermöglichen. Es soll ein Western Blot durchgeführt werden, um spezifische Unterschiede in der Expression des IGF1R zu untersuchen. Des Weiteren wird der Effekt der Supplementation einer physiologischen oder supraphysiologischen Konzentration an IGF1 zum Reifungsmedium bei Ab- bzw. Anwesenheit von Apoptoseinduzierern auf die Anzahl apoptotischer Zellen und die Expression des IGF-Systems untersucht. Dabei soll gezeigt werden, ob die hinzugefügte Konzentration an IGF1 während der Eizellreifung im Medium reduziert oder gesteigert wird. Außerdem soll anhand einer Immunfluoreszenzfärbung die Lokalisation des Rezeptors in allen Stadien der embryonalen Entwicklung bestimmt werden. Die Ergebnisse werden mittels Untersuchungen des mRNA-Expressionsmusters von Genen des IGF-Systems, apoptoserelevanten Transkripten und Transkripten des Glukosestoffwechsels verglichen und könnten zur Aufklärung des Einflusses von IGF1 auf die Eizellreifung und präimplantorische Entwicklung boviner Embryonen beitragen. Es könnten überdies neue Erkenntnisse über mögliche Ursachen der frühen embryonalen Mortalität bei Hochleistungsrindern nach der Abkalbung aufgedeckt werden. Letztlich sollen die Ergebnisse dabei helfen, die Kultivierungssysteme für die IVP zu verbessern und daraus resultierend zu einer Qualitätsverbesserung der Embryonen führen.
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2. Literatur
2.1 Insulin-like growth factor – System
Das Insulin-like growth factor - System gehört zu einer komplexen Familie von Wachstumsfaktoren, die an Wachstum, Entwicklung und Differenzierung von Säugerzellen beteiligt sind. Sie besteht nach heutigem Wissensstand aus zwei Liganden (IGF1 und IGF2), zwei Membranrezeptoren (IGF1R und IGF2R), spezifischen Bindungsproteinen (IGFBP) und IGFBP-assoziierten Proteinen (HWA et al. 1999). Isoliert und sequenziert wurden IGF1 und 2 erstmals 1976 von Rinderknecht und Humbel, die den Namen Insulin-like growth factor aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zu Proinsulin wählten, der daraufhin deutet, dass beide Hormone aus einer Genduplikation vor über 600 Millionen Jahren hervorgegangen sind (FROESCH 1985). Im Vergleich der Aminosäuresequenzen von Rind und Mensch besteht eine 100-prozentige Homologie der Liganden IGF1 und IGF2 (HONEGGER u. HUMBEL 1986).
2.1.1 Liganden des IGF-Systems
Die Liganden IGF1 und IGF2 sind Polypeptide, bestehend aus ca. 70 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von ungefähr 7000 Dalton (RINDERKNECHT u.
HUMBEL 1978). Der Hauptsyntheseort von IGF1 und IGF2 als endokrine Faktoren ist die Leber. Die Synthese wird durch das Wachstumshormon [Growth Hormone (GH)] stimuliert (JONES u. CLEMMONS 1995). Weiterhin konnte eine lokale Produktion von IGF1 und IGF2 als parakrin wirkende Faktoren in einigen Geweben, wie beispielsweise der Plazenta, nachgewiesen werden, wo sie zur Zelldifferenzierung beitragen (LARON et al. 2001). Ähnlich wie Insulin können IGF1 und IGF2 die Glukoseaufnahme in Fett- und Muskelzellen stimulieren (RINDERKNECHT u. HUMBEL 1978). Des Weiteren haben die Wachstumsfaktoren einen regulatorischen Einfluss auf den Metabolismus, die Mitoserate und die Steuerung des plazentaren und fetalen Wachstums (FOWDEN 2003). Die Liganden
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A B
des IGF-Systems spielen beim Wachstum von Organismen eine entscheidende Rolle. Die Hauptfunktion von IGF1 ist die pränatale und postnatale Stimulation der Entwicklung. Eine fehlende IGF-Synthese führt sowohl prä- als auch postnatal zu einer fetalen Wachstumsretardierung (LIU et al. 1997). IGF1-null-mutante Mäuse sterben häufig schon vor der Geburt (95-prozentige perinatale Mortalität). Die wenigen überlebenden Tiere sind unfruchtbar, entwicklungsgestört und weisen zahlreiche Defekte in den Organsystemen auf (LIU et al. 1997).
Der Insulin-like growth factor 1 ist ein einkettiges, basisches Polypeptid, das sich in einen A- und B-Strang gliedert, die durch drei Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Abb. 1A). Die Signalübertragung von IGF1 erfolgt vorwiegend durch die Bindung an den membranständigen Rezeptor Insulin-like growth factor 1 receptor (KAYE 1997). Allerdings kann IGF1 auch durch Bindung an den Insulinrezeptor metabolische Effekte, wie den Glukosetransport, steuern (KAYE 1997).
Abbildung 1: Proteinstruktur des IGF1 (A; SATO et al. 1993) und IGF2 (B; TORRES et al. 1995). Proteinketten sind vom N- (Rot) zum C-Terminus (Blau) unter Verwendung eines Regenbogenfarben-Spektrums coloriert dargestellt
Der Insulin-like-growth factor 2 ist in seiner Struktur und Sequenz dem IGF1 sehr ähnlich. Das einsträngige Polypeptid gliedert sich in vier Domänen, die über drei Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Abb. 1B). Die Signalübertragung von IGF2 erfolgt wie bei IGF1 durch die Bindung an den membranständigen IGF1R.
Jedoch kann IGF2 auch an den Insulin-like growth factor 2 - Rezeptor (IGF2R) binden und bewirkt dort die Proliferation und Differenzierung von Zellen. Außerdem
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kommt es zu einer Art Reinigung der Umgebung von IGF2 durch die Bindung an den IGF2R (HARRIS u. WESTWOOD 2012). Während der frühen Embryonalentwicklung spielt IGF2 eine große Rolle, da es das normale Plazentawachstum und die frühe Zellentwicklung fördert (HARRIS u. WESTWOOD 2012).
2.1.2 Rezeptoren des IGF-Systems
Strukturell ist der membranständige IGF1R ein Heterotetramer, das aus zwei extrazellulären α-Untereinheiten und zwei transmembranen β-Untereinheiten besteht (KATO et al. 1994). Die α-Untereinheiten weisen cysteinreiche Bindungsstellen für die IGF-Liganden auf und sind durch Disulfidbrücken miteinander und zu den β-Untereinheiten verbunden. Die β-Untereinheiten setzen sich aus einer intrazellulären Domäne mit einer Tyrosinkinase, einer Transmembrandomäne und einer kurzen extrazellulären Domäne zusammen (KATO et al. 1994). Damit weist der IGF1R viele strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten zum Insulinrezeptor auf und kann neben IGF1 auch IGF2 und Insulin binden, zeigt jedoch die größte Bindungsaffinität zu IGF1 (KAYE 1997). Durch Autophosphorylierung der Tyrosinkinase des Rezeptors werden intrazellulär zwei Hauptsignalkaskaden aktiviert, der MAPK-Signalweg (Mitogen-aktivierte Proteinkinase) und der PI3K- Signalweg (Phosphoinositid-3-Kinase). Diese Signalkaskaden führen zur Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren und lösen so eine spezielle Zellantwort aus, die letztlich die Proliferation, das Wachstum und das Überleben der Zelle bewirken (LARON 2001). In Abbildung 2 ist das gesamte IGF-System und die Signalübertragung schematisch dargestellt.
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Abbildung 2: Insulin-like growth factor System mit Darstellung der spezifischen Signalübertragung (mod. nach HWA et al. 1999)
Der IGF2R, auch kationunabhängiger Mannose-6-Phosphat (M6P) Rezeptor genannt, ist ein vielseitiger Proteinrezeptor, der sowohl IGF2 an der Zellmembran binden kann, als auch Mannose-6-Phosphat gebundene Proteine im Transgolgi Netzwerk (HARRIS u. WESTWOOD 2012). In seiner Struktur besteht der einsträngige IGF2R primär aus einer großen extrazellulären Domäne, die strukturell homolog zu der kollagenbindenden Domäne von Fibronectin ist, einer transmembranen Domäne und einem relativ kurzen cytoplasmatischen Schwanz (BROWN et al. 2009). Die Signaltransduktion erfolgt hauptsächlich über die Transaktivierung G-Protein gekoppelter Rezeptoren, da der Rezeptor weder über eine Tyrosinkinase, noch über eine Autophosphorylierungsstelle verfügt (EL-SHEWY u. LUTTRELL 2009). Die weiteren Signalwege können sowohl fördernd auf die Proliferation und das Wachstum der Zellen wirken, als auch die Migration der Zelle auslösen (HARRIS u. WESTWOOD 2012). Insgesamt zeigt der IGF2R eine größere Bindungsaffinität gegenüber IGF2 als IGF1 und kann Insulin nicht binden (HARRIS und WESTWOOD 2012). Daher ist die Signalübertragung von IGF2 über den IGF2R einer der Hauptmediatoren für die Regulation einer normalen Embryonalentwicklung (HARRIS und WESTWOOD 2012).
IGFBP-Fragmente
IGFBP Protease
IGF2-Rezeptor IGF1-Rezeptor
PI3K MAPK
8 2.1.3 Bindungsproteine des IGF-Systems
Die Insulin-like growth factor-Bindungsproteine gehören zur Familie der sezernierenden Proteine, die IGF 1 und 2 mit einer höheren oder ähnlichen Wahrscheinlichkeit wie der IGF1R binden und ein Molekulargewicht zwischen 24 und 45 kDa aufweisen (DUAN u. XU 2005). Die Primärstruktur aller IGFBP ist gleich und gliedert sich in drei Domänen mit jeweils gleicher Größe: eine hoch konservierte N-terminalen Domäne, eine konservierte C-terminale Domäne und eine variierende, zentrale Domäne, auch linker (L-) Domäne genannt (HWA et al. 1999). Die N-terminale Domäne enthält die Hauptbindungsstelle für IGF1 und -2, während die C-terminale Domäne zwar zur Ligandenbindung beiträgt, aber zusätzlich mit anderen Proteinen, wie zum Beispiel der unstabilen Säure-Untereinheit (acid-labile subunit), interagieren kann (CLEMMONS 2001). Die L-Domäne ist variabel und enthält Stellen mit posttranskriptionaler und –translationaler Aktivität, die Polyadenylierung, Spleißen, aber auch Glykosylierung, Phosphorylierung und Proteolyse steuern können (HWA et al. 1999). Zurzeit sind sechs verschiedene Bindungsproteine (IGFBP-1 bis -6) beim Rind, Menschen und weiteren Spezies bekannt (SATO et al.
1993, CLEMMONS 2001, DUAN u. XU 2005). Das Vorkommen eines siebten IGFBP wird weiterhin kontrovers diskutiert (LI et al. 2012). Das IGFBP-7, ebenso bekannt unter IGFBP-related protein 1, mac25/angiomodulin oder tumor-derived adhesion factor, ist ein Protein, welches eine hohe Strukturähnlichkeit zu den IGFBP-1 bis -6 aufweist, jedoch in seiner Funktion vorwiegend Insulin bindet und daher eine bisher noch unbekannte biologische Rolle spielt (AKAOGI et al. 1996, OH et al. 1996, LI et al. 2012). In extrazellulären Flüssigkeiten kommen die Liganden IGF1 und IGF2 zu 99 % gebunden an eines der sechs IGFBP vor (LARON 2001). Der Hauptteil des zirkulierenden IGF1 ist an das IGFBP3 gebunden. Die Bindeproteine helfen beim Transport der Liganden im Plasma und bei der Bindung der freien IGFs an ihre Rezeptoren, um so ihre Verfügbarkeit für das Gewebe zu vermitteln (JONES u.
CLEMMONS 1995). Sie verlängern die Halbwertszeit des zirkulierenden IGF1 oder IGF2 und regulieren ihre biologische Aktivität (JONES u. CLEMMONS 1995).
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2.1.4 Rolle des IGF1 während der Pubertät und Trächtigkeit von Rindern
Im Verlauf der Entwicklung des weiblichen Hausrindes bis zum Beginn der Pubertät konnte ein Anstieg der IGF1-Konzentration registriert werden (ARMSTRONG et al.
1992, GARCIA u. SANTISTEBAN 2002). So steigt der IGF1-Serumgehalt im Vergleich zu jüngeren Tieren kurz vor der Pubertät um mehr als 20 % an (GARCIA u.
SANTISTEBAN 2002). In Studien, bei denen die IGF1-Serumwerte durch eine aktive Immunisierung gegen den Growth Hormone Releasing Factor (GRFi) herabgesetzt wurden, zeigten die Tiere eine verspätet einsetzende Pubertät (SCHOPPEE et al.
1996, KÖLLE et al. 2003). Eine mögliche Ursache ist laut der Autoren die niedrige IGF1-Konzentration, die eine Beeinträchtigung der Östradiol-17β (E₂)-Synthese im Ovar bewirkt, was zu einer Verzögerung des LH-Anstiegs (Luteinisierendes Hormon) führt und auf diese Weise die Heranreifung von Follikeln beeinflusst (SCHOPPEE et al. 1996, KÖLLE et al. 2003). Zudem richtet sich die IGF1-Konzentration im Blut nach der metabolischen Situation des Tieres und lässt sich durch das Futtermanagement verändern (YAMBAYAMBA et al. 1996). Es wurde beobachtet, dass bei Tieren, die ad libitum gefüttert werden, höhere IGF1-Konzentrationen im Blut messbar waren und die Pubertät früher einsetzte als bei Tieren nach restriktiver Fütterung (YELICH et al. 1996).
Nicht nur während der Pubertät, sondern auch bei der Trächtigkeit von Rindern, spielt IGF1 eine entscheidende Rolle. In der späten Phase der Trächtigkeit und der frühen Laktationsphase steigen die Nährstoffbedürfnisse des Rindes drastisch an.
Zum einen benötigt das Rind mehr Nährstoffe, um das fetale Wachstum zu gewährleisten und zum anderen, um die Milchsynthese zu ermöglichen (Abbildung 3).
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Abbildung 3: Darstellung des Energiehaushaltes während der Laktationsphase des Rindes (mod. Nach EMMICK et al. 2000)
In dieser Situation ist das Rind außerstande, den Bedarf über die Nahrungsaufnahme sicherzustellen. Daher wurde dieser Zustand als negative Energiebilanz definiert (MCCLURE 1965). Besonders nach der Abkalbung wirkt sich diese negative Energiebilanz bei Hochleistungsrindern direkt auf die Fertilität aus (WATHES et al. 2007). In dieser Phase findet ein Zusammenspiel vieler einzelner Faktoren statt. Die Veränderungen, die währenddessen auf der GH-IGF-Achse auftreten, reduzieren zum einen durch eine verminderte Produktion von IGF1 in der Leber die Bioverfügbarkeit von zirkulierendem IGF1 (FENWICK et al. 2008). Zum anderen bewirkt eine verringerte Ausschüttung von IGFBPs eine Verkürzung der Halbwertszeit von IGF1, wodurch weniger IGF1 zur Verfügung steht (LEROY et al.
2008). Außerdem bewirkt ein erhöhter Blutfluss durch die Leber, eine gesteigerte Verstoffwechselung von IGF1, womit ebenfalls weniger zirkulierendes IGF1 vorhanden ist. Letztlich führen die Änderungen auf IGF1-Ebene zu einer Verlangsamung des follikulären Wachstums und einer verzögerten Ovulation
Milchproduktion
Futter
Energiespeicher des Körpers
Energie (Kcal pro Tag)
Laktationstrimester
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(WATHES et al. 2007). Ausschlaggebend für die Fruchtbarkeit des Hochleistungsrindes und dementsprechend wichtig für eine normale follikuläre Entwicklung ist die IGF1-Konzentration im Serum (LEROY et al. 2008). Bei Rindern mit einer stark ausgeprägten negativen Energiebilanz (SNEB) wurde ein reduzierter IGF1-Gehalt im Serum beobachtet (FENWICK et al. 2008). Dieser lässt sich durch eine reduzierte Verfügbarkeit von Glukose erklären, wodurch die Produktion von IGF1 eingeschränkt wird. Aber auch die IGF1-Konzentration in der Follikelflüssigkeit ist von entscheidender Bedeutung. Die metabolischen Veränderungen, die während der NEB auftreten, können direkt oder indirekt durch Beeinträchtigung der follikulären Umgebung zu einer Verschlechterung der Oozytenqualität führen (WATHES et al.
2007). Sogar wenn anschließend eine korrekte Fertilisierung stattgefunden hat, können vorherige schlechte follikuläre Bedingungen während Eizellwachstum und – reifung die Viabilität des resultierenden Embryos beeinflussen und damit zu einer frühen embryonalen Mortalität führen (LEROY et al. 2011). Aus diesem Grund wurden bereits zahlreiche Versuche durchgeführt, die an dieser Stelle in vitro ansetzen, um möglichst genau die Zusammensetzung der Follikelflüssigkeit zu definieren und den Einfluss auf die Eizelle zu untersuchen. Im Nachfolgenden Kapitel (2.2.1) wird hierauf detaillierter eingegangen.
12 2.2 In-vitro-Produktion von Embryonen
Die In-vitro-Produktion von Embryonen ist zu einer bedeutenden Methode der assistierten Reproduktion bei Rindern geworden und gliedert sich in die drei aufeinanderfolgenden Schritte der In-vitro-Reifung oder -Maturation (IVM), der In- vitro-Befruchtung oder -Fertilisation (IVF) und der In-vitro-Kultivierung (IVC;
BAVISTER 1995; Abb. 4). Durch die Weiterentwicklungen in der Biotechnologie werden mittlerweile jährlich eine große Anzahl kommerzieller Embryonen erzeugt. Im Jahr 2013 wurden weltweit 546.628 transfertaugliche bovine Embryonen in vitro produziert, von denen knapp 410.000 transferiert wurden (PERRY 2014). Die ersten erfolgreichen In-vitro-Fertilisationen fanden beim Kaninchen in den späten 50er Jahren statt (CHANG 1959). Ein Jahrzehnt später konnten Erfolge bei der Maus verzeichnet werden (WHITTINGHAM 1968), worauf folgend die ersten humanen Eizellen in vitro gereift und erfolgreich fertilisiert wurden (EDWARDS et al. 1969).
Beim Rind beschrieben Iritani und Niwa (1977) die erste Fertilisation einer Eizelle in vitro. Das erste Kalb aus einem in vitro produzierten Embryo kam im Januar 1981 zur Welt (BRACKETT et al. 1982). Seitdem erfolgte eine stetige Weiterentwicklung der IVP, die heute hauptsächlich zur assistierten Reproduktion beim Menschen, Pferd und beim Rind Anwendung findet.
Abbildung. 4: Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion boviner Embryonen (mod. nach LONERGAN 2007)
Unreife Eizelle Reife Eizelle Zygote 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 16-Zeller Morula Blastozyste Eizellwachstum
im Follikel
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Für Forschungszwecke hat sich die Entnahme von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) aus Ovarien geschlachteter Tiere bewährt. Durch Isolierung, Aspiration oder
„Slicen“ von Follikeln können unterschiedliche Mengen an KOK gewonnen werden (GALLI et al. 2003). Im Anschluss an die Gewinnung erfolgt die Bewertung und Selektion der KOK nach morphologischen Kriterien. Dabei kommt es nur zur Verwendung von den KOK, die sich als IVP-tauglich einordnen lassen. Maßgebend dafür sind ein homogenes Ooplasma und die Anzahl der die Eizelle umgebenden Kumuluszellen(KASTROP et al. 1990). Die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Entwicklung zur Blastozyste in vitro steigt mit der Anzahl an Kumuluszellschichten signifikant an (KHURANA u. NIEMANN 2000). Anschließend findet die Reifung der KOK in einem spezifischen Medium statt. Während der Maturation der Eizelle wird die Meiose fortgeführt. Unter natürlichen Bedingungen erfolgt dies unter Einfluss eines LH-Peaks (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Nach 20-24 Stunden Inkubation ist die Mehrzahl der Oozyten vollständig gereift und bereit, fertilisiert zu werden. Unter optimalen Bedingungen erreichen mehr als 90 % der Eizellen das Metaphase-II–
Stadium (GALLI et al. 2003).
Für die darauf folgende Befruchtung der gereiften Oozyten wird hauptsächlich tiefgefrorenes Sperma verwendet. Dies wird zum Beispiel mit Hilfe einer Dichtegradientenzentrifugation aufbereitet, bei der sich die lebenden, motilen Spermien in der Fraktion mit der höheren Dichte konzentrieren und die toten Spermien daher leicht mit dem Überstand abpipettiert werden können. Des Weiteren sind zur Spermienbehandlung Substanzen wie Heparin, Hypotaurin und Epinephrin wichtig, um unter anderem die Kapazitation der bovinen Spermien einzuleiten und sie so für die Befruchtung vorzubereiten. Die eigentliche Fertilisation erfolgt während einer 19-stündigen Ko-Inkubation von KOK und Spermien, wodurch Befruchtungsraten von 70-90 % erzielt werden können (WRENZYCKI et al. 2007). Im Anschluss findet die Kultivierung der befruchteten Eizellen unter kontrollierten physikalischen Bedingungen statt. Die Zygote beginnt sich anfänglich in jeweils gleich große Zellen zu teilen. Im weiteren Verlauf dieser sogenannten Furchungsteilung kommt es zur Kompaktierung der Zellen zu einer Morula, die im Rind aus etwa 32 Zellen besteht (VAN SOOM et al. 1997). Anschließend wird von
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den Zellen Flüssigkeit sezerniert, die zur Bildung eines Blastozoels führt. Während der Blastulierung kommt es dann erstmals zu einer Differenzierung von Zellen in den Trophoblasten, der sich später zum Chorion- und Amnionepithel entwickelt und der inneren Zellmasse, dem sogenannten Embryoblasten, aus dem in der folgenden Entwicklung der Embryo bzw. Fetus entsteht (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Die In- vitro-Kultivierung von Rinderembryonen erfolgt in den meisten Fällen bis zum siebten Tag, zum Stadium der expandierten Blastozyste. Bis zu diesem Zeitpunkt können Entwicklungsraten von 20-40 % erzielt werden (RIZOS et al. 2002).
Bei der IVP haben primär die Kultivierungsmedien, einen entscheidenden Einfluss auf die Entwicklung der Embryonen. Bei der Reifung boviner KOK kommt es vorwiegend zur Verwendung komplexer Medien, wie das kommerziell erhältliche Tissue Culture Medium 199 (TCM199), das für die Kultivierung somatischer Zellen entwickelt wurde (SUTTON et al. 2003). Üblicherweise werden dem Maturationsmedium Hormone, wie humanes Choriongonadotropin (hCG) zugesetzt, das die natürlichen Hormone FSH (follikelstimulierendes Hormon) und LH ersetzt und zum Prozess der Reifung beiträgt (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Zusätzlich findet eine Supplementation des Mediums mit Proteinen statt. Die häufigsten Proteinzusätze sind dabei fetales Kälberserum (FCS) oder bovines Serumalbumin (BSA) unterschiedlicher Reinheit (FARIN et al. 2001).
Neben der Qualität der Eizelle hat das Kultivierungsmedium den größten Einfluss auf die Qualität der sich entwickelnden Embryonen. Bis heute gibt es zahlreiche Studien, die den Einfluss unterschiedlicher Kultivierungsmedien und Zusätze auf die Entwicklung boviner Embryonen untersucht haben (WRENZYCKI et al. 1999, NATALE et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2001, RIZOS et al. 2002, LONERGAN et al.
2003). Kultivierungsmedien können ganz unterschiedlich zusammengesetzt sein.
Einfach balancierte Salzlösungen mit Kohlenhydraten bis hin zu komplexen Medien mit vielen verschiedenen Inhaltsstoffen wurden bereits getestet (SAGIRKAYA et al.
2006). Eines der am häufigsten genutzten Medien für die In-vitro-Kultivierung boviner Embryonen ist SOF-Medium (synthetic oviduct fluid). Die Basis dafür bildete eine Untersuchung der ovinen Eileiterflüssigkeit auf biochemischer Ebene (TERVIT et al.
1972). In den letzten Jahrzehnten fand eine stetige Optimierung der
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Zusammensetzung durch empirische Modifikationen wie z.B. durch die Zugabe von Aminosäuren (FEUGANG et al. 2009) oder Wachstumshormonen (SIRISATHIEN u.
BRACKETT 2003) statt.
2.2.1 Rolle von IGF1 während der Eizellreifung und frühen bovinen Embryonalentwicklung in vitro
Der Insulin-like growth factor 1 hat einen entscheidenden Einfluss auf das follikuläre Wachstum und damit auf die Eizellreifung. Mit Zunahme des Follikeldurchmessers ließ sich ein Anstieg der IGF1-Konzentration im Follikel von Rindern erkennen, der wiederum mit der Plasmakonzentration korrelierte (SPICER u. ECHTERNKAMP 1995). Im Ovar verstärkt IGF1 die Wirkung von Gonadotropinen, die das Follikelwachstum stimulieren (GIUDICE 1992). In einer Studie, in der IGF1 kontinuierlich intraovariell durch eine osmotische Minipumpe verabreicht wurde, konnte gezeigt werden, dass die E2-Synthese in kleinen Follikeln (2-5 mm) anstieg und die Follikelgröße dabei stetig zunahm (SPICER et al. 2000). IGF1 fördert daneben die Proliferation der Granulosazellen im Follikel und die Eizellreifung (KHAMSI et al. 2001). In einer anderen Studie, in der weibliche Rinder nach intraovarieller IGF1-Injektion (500 ng/ml) besamt wurden, konnten keine Unterschiede in der Entwicklungsrate oder der Gesamtanzahl an embryonalen Zellen entdeckt werden, allerdings zeigte sich ein Anstieg der Proliferation des Embryoblasten (VELAZQUEZ et al. 2012). Bei der Untersuchung des Einflusses einer intrafollikulären Injektion von IGF1 (200 µg/ml) in den subdominanten Follikel von Rindern während des physiologischen Östrus konnte beobachtet werden, dass es zu einer Stimulation des subdominanten Follikels, bei gleichzeitiger Inhibierung des dominanten Follikels, kam (SHAHIDUZZAMAN et al. 2010). Eine Stimulation kennzeichnete sich hierbei durch ein voranschreitendes Wachstum mit Vergrößerung des Gesamtdurchmessers und eine ansteigende Durchblutung der Follikelwand, gemessen mit einer Doppler-Sonografie. Die Autoren bestätigten dadurch die
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stimulierende Funktion von IGF1 während des Follikelwachstums (SHAHIDUZZAMAN et al. 2010).
Die Expression von IGF1 auf mRNA-Ebene in der bovinen Eizelle wird bis heute kontrovers diskutiert. Zum einen konnte gezeigt werden, dass IGF1 in der Oozyte exprimiert wird und daher eine wichtige Rolle während des Follikelwachstums spielt (WATSON et al. 1992). Zum anderen führten Untersuchungen an Rindereizellen nicht zu einem Nachweis von IGF1, weshalb auf eine parakrine Wirkungsweise von IGF1 in Oozyten geschlossen wurde (YASEEN et al. 2001).
Während der frühen Embryonalentwicklung führten Studien zur mRNA-Expression von IGF1 in Embryonen ebenfalls zu gegensätzlichen Ergebnissen. In einigen Studien konnte IGF1 in allen Stadien der präimplantatorischen Entwicklung nachgewiesen werden (WATSON et al. 1992, MOORE et al. 2007). Andere Arbeitsgruppen konnten dieses Ergebnis allerdings nicht bestätigen (LONERGAN et al. 2000, YASEEN et al. 2001, WANG et al. 2009). Hier weisen die Autoren auf eine parakrine Wirkungsweise von IGF1 über den IGF1R hin, der kontinuiertlich im Embryo exprimiert wird (YASEEN et al. 2001). Grundsätzlich stimuliert IGF1 im Embryo die DNA-Synthese und steigert dadurch die Mitoserate (FOWDEN 2003).
Darüber hinaus vermittelt IGF1 die Nährstoffaufnahme und reguliert den Glukosestoffwechsel in Embryonen (KAYE 1997). Weiterhin trägt IGF1 zur Blastozystenbildung bei und fördert die Zellproliferation in der Inneren Zellmasse (KAYE 1997). Zusätzlich wirkt IGF1 antiapoptotisch und kann die Anzahl an apoptotischen Zellen im Embryo verringern (JOUSAN u. HANSEN 2007).
Zur Untersuchung des Einflusses von IGF1 auf die Oozytenreifung und frühe Embryonalentwicklung wurden in der Vergangenheit zahlreiche Versuche durchgeführt, die sich mit der Supplementation von IGF1 zur Maturation boviner Eizellen (Tabelle 1) oder Kultivierung boviner Embryonen beschäftigten (Tabelle 2).
Bei einem Zusatz von 100 ng/ml IGF1 zum Maturationsmedium (TCM199) wurde untersucht, ob dieser die Fortführung der zweiten Reifeteilung boviner Oozyten beeinflusst. Es konnte jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen den Oozyten der Supplementationsgruppe und denen der Kontrollgruppe gefunden werden (RIEGER et al. 1998, MEIYU et al. 2014). Ferner erfolgte die Analyse der Wirkung
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von IGF1 im Medium auf die Gesamtzellzahl und das Vorkommen von Apoptose während der Maturation. Dabei zeigte sich, dass IGF1 die Anzahl apoptotischer Kumuluszellen (KÖLLE et al. 2003) bzw. die Apoptose in den Eizellen reduziert (WASIELAK u. BOGACKI 2007), aber keinen Einfluss auf die Gesamtzellzahl der resultierenden Embryonen ausübt. Des Weiteren wurde untersucht, ob IGF1 die Anzahl an Embryonen, die sich nach einer In-vitro-Fertilisation weiter entwickeln, verändert und damit die sogenannte Entwicklungsrate beeinflusst. Allerdings konnten auch hier keine signifikanten Veränderungen der Anzahl an Morulae und Blastozysten erzielt werden (RIEGER et al. 1998, MAKAREVICH u. MARKKULA 2002). Insgesamt wirkt IGF1 positiv auf Eizellen während der Maturation und fördert ihren Stoffwechsel (RIEGER et al. 1998).
Tabelle 1: Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum Maturationsmedium und dessen Einfluss auf unterschiedliche Parameter der Embryonalentwicklung
Parameter
Autor Zellzahl Apoptose Maturations- rate
Teilungs- rate
Entwicklungs- rate
KÖLLE et al.
(2003) 100 ng/ml
- ↓(Kumuluszellen) - - -
MAKAREVICH u.
MARKKULA (2002) 100 ng/ml
n.s. n.s. (Eizellen) - n.s. n.s.
MEIYU et al.
(2014) 100 ng/ml
- n.s. (Eizellen) n.s. n.s. -
RIEGER et al.
(1998) 100 ng/ml
n.s. - n.s. n.s. n.s.
WASIELAK u.
BOGACKI (2007) 100 ng/ml
- ↓ (Eizellen) - - -
n.s. = nicht signifikant; ↓ = signifikant reduziert; - = nicht untersucht
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Bei der Untersuchung des Einflusses von IGF1 während der Kultivierung boviner Embryonen wurden unterschiedliche Konzentrationen an IGF1 (50, 100, 200, 1000 ng/ml) dem Kultivierungsmedium zugesetzt, die alle zu einer Steigerung der Entwicklungsrate von Embryonen führten (Tabelle 2). Lediglich eine Studie konnte auch eine Steigerung der Teilungsrate nach Supplementation von 50 ng/ml IGF1 zum Kultivierungsmedium beobachten (SIRISATHIEN u. BRACKETT 2003).
Außerdem wurde gezeigt, dass die Zugabe von IGF1 zu einer beschleunigten Entwicklung führt (PALMA et al. 1997). Beim Zusatz von 50 und 100 ng/ml IGF1 erfolgte eine Erhöhung der Gesamtzellzahl boviner Blastozysten. Gleichzeitig kam es zu einer Reduzierung der Anzahl apoptotischer Zellen. In einer Studie, in der dem Kultivierungsmedium 1000 ng/ml IGF1 zugesetzt wurde, konnte allerdings eine erhöhte Anzahl apoptotischer Zellen bei gesteigerter Gesamtzellzahl gefunden werden (VELAZQUEZ et al. 2011). Weiterhin zeigte die Supplementation von 100 ng/ml IGF1 im Kultivierungsmedium, dass es zu einer Verminderung der Anzahl an IGF1R-Transkripten um 20 % kommt (BLOCK et al. 2008).
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Tabelle 2: Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum Kultivierungsmedium und dessen Einfluss auf unterschiedliche Parameter der Embryonalentwicklung
Parameter
Autor Medium Zellzahl Apoptotische
Zellen
Teilungs- rate
Entwicklungs- rate
BLOCK et al. (2008) 100 ng/ml
SOFaa - - - ↑
BONILLA et al.
(2011) 100 ng/ml
KSOM - - n.s. ↑
BYRNE et al. (2002)
100 ng/ml SOFaa-BSA ↑ ↓ - ↑
MAKAREVICH u.
MARKKULA (2002) 100 ng/ml
SOFaaci ↑ ↓ n.s. ↑
MATSUI et al. (1997)
200 ng/ml SOFaa n.s. - - ↑
NEIRA et al. (2010)
50 ng/ml SOFaa ↑ - - ↑
PALMA et al. (1997) 100 ng/ml
TCM199 - - n.s. ↑
PRELLE et al. (2001) 100 ng/ml
SOF+
Polyvinylalkohol (PVA)
n.s. - - ↑
SIRISATHIEN u.
BRACKETT (2003) 50 ng/ml
SOFaa+Citrat ↑ ↓ ↑ ↑
SIRISATHIEN et al.
(2003) 50 ng/ml
SOFaa+Citrat ↑ - - ↑
VELAZQUEZ et al.
(2011) 100 ng/ml
SOFaa n.s. n.s. n.s. ↑
VELAZQUEZ et al.
(2011) 1000 ng/ml
SOFaa ↑ ↑ n.s. ↑
n.s. = nicht signifikant; ↑ = signifikant gesteigert; ↓ = signifikant reduziert; - = nicht untersucht SOFaa = synthetic oviduct fluid with amino acids
KSOM = potassium simplex optimization medium
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2.2.2 Apoptose während der frühen bovinen Embryonalentwicklung
Der programmierte Zelltod beschreibt die Steuerung des eigenen Todes einer Zelle über genetisch festgelegte Programme. Im Gegensatz dazu kann die Zelle eines Organismus auch durch ungeregelte Mechanismen, der sogenannten Nekrose sterben. Hierbei kommt es zu einem Zerfall der Zelle durch eine unkontrollierte Volumenzunahme und Ruptur der Zellmembranen. Die zellulären Bestandteile werden freigesetzt und können benachbarte Zellen schädigen und Entzündungsreaktionen auslösen (MAJNO u. JORIS 1995). Dagegen dient der programmierte Zelltod der gezielten Entfernung von einzelnen, abnormalen oder nicht benötigten Zellen, ohne dabei angrenzende Zellen zu beschädigen. Bis heute sind acht verschiedene Formen des Zelltods bekannt, die durch das Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD) nach morphologischen Kriterien unterschieden werden (KROEMER et al. 2005). Die bekannteste Form des programmierten Zelltods ist die Apoptose. Dieser Begriff wurde erstmals 1972 eingeführt und lässt sich vom griechischen Wort apoptosis (= Absterben) ableiten (KERR et al. 1972). Apoptose beschreibt den häufig spontan oder als Antwort auf einen physiologischen Stimulus auftretenden programmierten Zelltod einzelner Zellen. Die Definition dieses Vorgangs fand aufgrund morphologischer Veränderungen der Zelle statt und gliedert sich in eine Abfolge mehrerer Schritte (Abb. 6). Zunächst kommt es zum Schrumpfen des Zellvolumens mit Abrundung der Zelle (‚Pyknose‘). Anschließend erfolgt eine Kondensierung des Chromatins und Fragmentierung des Zellkerns (‚Karyorrhexis‘), wobei die DNA durch Endonukleasen in definierte Stücke abgebaut wird. Letztlich zerfällt die Zelle in ‚apoptotische Körperchen‘, die von benachbarten Zellen oder Makrophagen phagozytiert werden (KROEMER et al. 2005).
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Abbildung 6: Schematische Darstellung des programmierten Zelltods (mod. nach WEEDON et al. 1979)
Diese Prozesse sind sehr komplex und bedingen eine große Anzahl genetischer Komponenten und Proteine. Als Hauptmediatoren der Apoptose wurden spezifische, hoch konservierte Proteasen, sogenannte Caspasen, entdeckt, deren Aktivierung für die korrekte Durchführung der Apoptose notwendig ist (EARNSHAW et al. 1999).
Des Weiteren kam es zur Identifikation von anti- (B-cell lymphoma 2-Familie) und pro-apoptotischen (Bcl2-assoziiertes X Protein) Proteinen, deren Verhältnis zueinander zur Auslösung von Apoptose in Zellen führen kann (WYLLIE 1995).
Phagozytose von benachbarten Zellen
oder Makrophagen
Pyknose
Karyorrhexis
Zerfall in apoptotische
Körperchen tierische
Zelle
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In der frühen Embryonalentwicklung tritt Apoptose als physiologischer Prozess auf, um eine normale Entwicklung zu garantieren und geschädigte oder fehlerhafte Zellen zu entfernen (MATWEE et al. 2000). Allerdings wird auch der Arrest in der Entwicklung boviner Embryonen mit Vorgängen der Apoptose verbunden (ANTUNES et al. 2010). Im Stadium der Blastozyste findet zudem eine Regulierung der Zellzahl mittels Apoptose statt (FABIAN et al. 2007).
Die wichtigste Methode zur Darstellung von Apoptose ist die mikroskopische Analyse von Zellkernen mit Hilfe spezifischer Färbungen, wie die TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling) – Analyse. Diese In-situ-Färbung von DNA-Brüchen in Zellkernen basiert auf der Bindung markierter dUTP (deoxyuridin) gekoppelt an terminale TdT (deoxynucleotidyl transferase) an freie 3`-OH Enden der DNA, welche aufgrund von Fluoreszenz sichtbar gemacht werden (GAVRIELI et al. 1992).
Allerdings ist diese Untersuchung kritisch zu beurteilen, da eine Unterscheidung zwischen nekrotischen und apoptotischen Zelluntergängen nur bedingt möglich ist.
Bei TUNEL-positiven Nuclei, die keine apoptotische Morphologie aufweisen, kann eine Ursache für den Zelltod auch Nekrose sein (GJORRET et al. 2003). Des Weiteren kann durch die Untersuchung der Genexpression der aktiven Caspasen eine Aussage über den Grad an Apoptose getroffen werden. Sowohl auf mRNA- Ebene, als auch auf Proteinebene lässt sich insbesondere die Caspase 3 als Apoptosemarker gut darstellen. Jedoch kommt es hier zu widersprüchlichen Ergebnissen, die auf eine Aktivität von Caspase 3 ohne Apoptose hinweisen (GJORRET et al. 2007).
In Eizellen und frühen embryonalen Stadien bis zum 8-Zellstadium wurde bisher keine Apoptose beobachtet. Gründe dafür könnten das Fehlen bestimmter Transkripte, wie beispielsweise das für das BCL2-assoziierte X Protein (BAX) sein, die für die Induktion der Apoptose notwendig sind und erst nach Aktivierung des embryonalen Genoms exprimiert werden (MATWEE et al. 2000). Ein erster Nachweis von Apoptose während der Embryonalentwicklung des Rindes erfolgte in vitro zwischen dem 8- bis 16-Zellstadium, während in vivo erstmals bei Stadien mit mindestens 21 Zellen Apoptose zu verzeichnen war (GJORRET et al. 2003). In bovinen Blastozysten kommt es zu einem Anstieg der Menge apoptotischer Zellen,
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die sich hauptsächlich in der Inneren Zellmasse lokalisieren (BYRNE et al. 1999).
Blastozysten aus einer In-vitro-Kultivierung weisen dabei eine größere Anzahl apoptotischer Zellen im Vergleich zu in vivo generierten Embryonen auf (MATWEE et al. 2000, GJORRET et al. 2003). Bei der Gegenüberstellung der Anzahl apoptotischer Zellen in parthenogenetischen und in vitro fertilisierten Embryonen wurden in den parthenogenetischen Embryonen mehr apoptotische Zellen bei einer insgesamt niedrigeren Zellzahl registriert (NEUBER et al. 2002). Auch die Zeit der Entwicklung spielt eine wichtige Rolle. Es konnte nachgewiesen werden, dass in sich schnell teilenden Embryonen weniger apoptotische Zellen als in sich langsam teilenden vorkommen (BYRNE et al. 1999, GUTIERREZ-ADAN et al. 2004). Das Kultivierungsmedium hat ebenfalls einen entscheidenden Einfluss auf das Vorkommen von Apoptose in Embryonen. So zeigt sich beispielsweise ein größeres Vorkommen von Zelltod in bovinen Blastozysten, die aus der Kultivierung mit Serum stammen (BYRNE et al. 1999). Ebenso zeigen Kumuluszellen während der Eizellreifung in vitro Anzeichen von Apoptose. Im Durchschnitt weist ein kompakter Cumulus oophorus weniger als 15 % apoptotische Zellen auf (WARZYCH et al.
2013). Allerdings konnte eine negative Korrelation zwischen der Entwicklungskompetenz der Eizelle und der Anzahl apoptotischer Zellen in ihrem Cumulus oophorus entdeckt werden (YUAN et al. 2005). Kumuluszellen, die entwicklungskompetente Eizellen umschlossen, wiesen dabei ein höheres Level an Apoptose auf und zeigten ein verändertes Genexpressionsmuster (JANOWSKI et al.
2012). Allerdings ist der Grad der Apoptose weder verbunden mit der Morphologie, noch mit dem Maturationsstadium der Eizelle (WARZYCH et al. 2013). Die Maturationsbedingungen bewirken auch hier Unterschiede in der Ausprägung von Apoptose, so reduziert eine Maturation mit Serum beispielweise die Apoptoserate in Kumuluszellen im Vergleich zur Reifung ohne Serum (IKEDA et al. 2003).
Insgesamt kann die Untersuchung von Apoptose Auskunft über physiologische Prozesse während der Embryonalentwicklung geben, die zu einer verbesserten Qualität und Überlebensrate führen könnten (FABIAN et al. 2007).
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2.2.3 Genomaktivierung in bovinen Embryonen
Das frühe embryonale Entwicklungsprogramm wird durch maternale Transkripte und Proteine kontrolliert, die bereits während der Oogenese produziert und bevorratet wurden (TELFORD et al. 1990). Erst im 8- bis 16-Zellstadium findet beim Rind die maternal-embryonic transition (MET) statt (Abb. 5). Dieser entscheidende Prozess gliedert sich in den Abbau maternaler Transkripte durch Degradierung und Translation, die Erzeugung neuer, embryo-spezifischer Transkripte und den Austausch durch embryonale Transkripte (TELFORD et al. 1990).
Abbildung 5: Schematische Darstellung der maternal-embryonic transition während der präimplantatorischen Entwicklung boviner Embryonen (mod. nach GRAF et al.
2014)
Nach heutigem Wissensstand wird die MET in eine kleine Aktivierung und eine große oder Hauptaktivierung unterteilt (MEMILI u. FIRST 1999). Während der kleinen Aktivierung zwischen dem 2- und 4-Zellstadium kommt es zur Expression von Genen, die an der Transkription, der Translation und dem Transport von RNA beteiligt sind (VIGNEAULT et al. 2009). Später zur Hauptaktivierung zwischen dem 8- und 16-Zellstadium werden Gene exprimiert, die für die Fortführung der embryonalen Transkription und Translation, für die Protein-Ubiquitinierung, sowie für die Einleitung epigenetischer Prozesse verantwortlich sind (GRAF et al. 2014).
GV MII-Eizelle 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 16-Zeller Blastozyste kleine Aktivierung
maternal embryonal
Hauptaktivierung Befruchtung
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Im Stadium der Blastozyste werden Gene exprimiert, die zur Regulation der frühen Zelldifferenzierung und des intrazellulären Transports beitragen (GRAF et al. 2014).
Diese Vorgänge erfordern eine gut koordinierte Abfolge von nukleären und zytoplasmatischen Prozessen, die gewährleisten, dass eine normale Reprogrammierung der elterlichen Genome erfolgt (LATHAM 1999). Ohne die Aktivierung der embryonalen Transkription ist die Embryonalentwicklung gestört. So zeigte eine Untersuchung, dass Embryonen, deren Transkription mit Hilfe von α-Amanitin inhibiert wurde, sich nur bis zum 8-Zellstadium teilen und nicht weiter entwickeln können, da ab diesem Entwicklungsstadium embryonale Transkripte notwendig sind (BARNES u. FIRST 1991).
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2.3 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Embryonen
Die frühe embryonale Entwicklung ist abhängig von der korrekten Durchführung des genetischen Programms. Dazu zählt sowohl die Transkription der DNA in RNA, als auch die spätere Translation der mRNA in Proteine und die epigenetischen Modifikationen. Ein suboptimales Umfeld des Embryos kann die Transkription der Gene beeinflussen und damit zu einer Veränderung des Proteingehaltes führen. Ein Unterschied zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen wurde im Transkriptionsmuster entwicklungsrelevanter Gene bereits beobachtet (WRENZYCKI et al. 1998).
Weiterhin konnte ein Einfluss unterschiedlicher Kultivierungsbedingungen, wie der Zusatz von synthetischen Makromolekülen oder Serum (WRENZYCKI et al. 1999, WRENZYCKI et al. 2001, RIZOS et al. 2002, RIZOS et al. 2003), sowie unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen auf die Genexpression gezeigt werden (HARVEY et al. 2004). Aus diesem Grund ist es möglich, Aussagen über die Qualität von Embryonen zu treffen, da Unterschiede in der Expression einiger Transkripte als Qualitätsmerkmal definiert wurden. Nachfolgend wird auf die Transkription ausgewählter Gene, die an der Signalübertragung von IGF1 (IGF1R, IGFBP2, IGFBP4), am Glukosestoffwechsel (SLC2A1, SLC2A3) und am Vorgang der Apoptose (BAX, BCL2L1) beteiligt sind, näher eingegangen.
2.3.1 Insulin-like growth factor 1 - Rezeptor während der bovinen Embryonalentwicklung
Wie bereits unter 2.1.2 beschrieben, findet die Signalübertragung von IGF1 größtenteils durch die Bindung an den membranständigen IGF1R statt. Auf mRNA- Ebene konnte der IGF1R zuvor in allen präimplantatorischen Stadien der Embryonalentwicklung in vitro und in vivo produzierter Embryonen detektiert werden und wurde daher als Qualitätsmarker definiert (YASEEN et al. 2001). Während
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dieser frühen Entwicklungsschritte konnte beim Rind eine stadienspezifische Expression des IGF1R beobachtet werden. Dabei zeigte sich, dass die relative Anzahl an Transkripten zunächst vom 2- bis zum 8-Zellstadium signifikant abnimmt und anschließend bis zum Stadium der Blastozyste wieder ansteigt (LONERGAN et al. 2000, YASEEN et al. 2001). Diese Ergebnisse stellen einen Zusammenhang der Genexpression mit den Vorgängen her, die zwischen dem 8- und 16-Zellstadium bei der MET stattfinden. Aus der spezifischen Expression wird ersichtlich, dass die Anzahl maternaler Transkripte aus der Eizelle in frühen Teilungsstadien bis zum 8-Zeller abnimmt, es dann zur Aktivierung des embryonalen Genoms kommt und damit die Transkription wieder ansteigt (YASEEN et al. 2001). Überdies konnte ein Unterschied der IGF1R-Expression zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen nachgewiesen werden. In vivo generierte Blastozysten zeigten eine höhere Anzahl an IGF1R-Transkripten im Gegensatz zu in vitro generierten (BERTOLINI et al. 2002). Im Vergleich zwischen In-vitro-Embryonen zu somatischen Kerntransfer-Embryonen konnte kein Unterschied der Expression gefunden werden (MOORE et al. 2007, SAWAI et al. 2007).
Zusätzlich wurde entdeckt, dass die relative Anzahl an IGF1R-Transkripten in Blastozysten aus IGF1-Kultivierung (100 ng/ml) signifikant geringer war als in denen der Kontrollgruppe (PRELLE et al. 2001, BLOCK et al. 2008). Demnach würden bereits im frühen Embryo die Komponenten des IGF-Systems von exogenem IGF1 gesteuert (PRELLE et al. 2001). Eine mögliche Erklärung der Herunterregulation des Rezeptors ist, dass die embryonale Zellantwort als Reaktion auf das verfügbare IGF1 abgeschwächt wird (BLOCK et al. 2008).
2.3.2 Insulin-like growth factor – Bindungsproteine
Die Bindungsproteine des IGF-Systems regulieren, wie zuvor unter 2.1.3 beschrieben, die Aktivität von IGF1 in unterschiedlicher Art und Weise. So verlängern sie beispielsweise die Halbwertszeit von IGF1, helfen beim Transport zu den Wirkungsorten und stimulieren oder inhibieren Effekte von IGF1 auf zellulärer Ebene
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(JONES u. CLEMMONS 1995). Während der frühen Embryonalentwicklung des Rindes konnten die kodierenden mRNAs der Bindungsproteine 2 und 3 in allen Stadien bis zur Blastozyste aufgezeigt werden (WINGER et al. 1997). Exogenes IGF1 (100 ng/ml), das der In-vitro-Kultivierung zugesetzt wurde, führte in Rinderembryonen zu einer signifikanten Steigerung der IGFBP3-Expression (BLOCK et al. 2008, VELAZQUEZ et al. 2011). Die embryonale Antwort wird mit einer Reduzierung des verfügbaren IGF1 durch Steigerung der Anzahl an IGFBP3 beschrieben, was letztlich dazu führt, dass mehr IGF1 in seiner gebundenen und damit inaktiven Form vorliegt (BLOCK et al. 2008). Darüber hinaus kommt es zu einer 1,6-fachen Hochregulation der IGFBP2-Transkripte in Blastozysten, generiert mit IGF1-Supplementation in vitro (PRELLE et al. 2001). Weiterhin wurde festgestellt, dass der Zusatz des Lösungsvermittlers DMSO (Dimethylsulfoxid; 14 mM) während der Kultivierung boviner Embryonen zu einer signifikant gesteigerten Expression des IGFBP2 führt (STINSHOFF 2009). Allerdings ist bekannt, dass weder eine Überschuss noch ein Mangel an IGFBP2 einen Effekt auf eine normale embryonale Entwicklung ausüben (PRELLE et al. 2001).
2.3.3 Glukosetransporter
Die Familie der Glukosetransporter (GLUT), die heute als Solute Carrier (SLC) bezeichnet werden, ist eine Familie natriumunabhängiger Membranproteine, die den Transport von Glukose entlang eines Konzentrationsgradienten vermitteln. Dabei regulieren die Transporter energieunabhängig den Austausch von Glukose zwischen inner- und extrazellulärer Matrix (OLSON u. PESSIN 1996). Beim Rind sind insgesamt 13 unterschiedliche Isoformen der Glukosetransporter bekannt (JOOST et al. 2002). Die Isoformen setzen sich zusammen aus 12 Transmembrandomänen, den intrazellulär liegenden N- und C-Terminus, einer intrazellulären Schleife und einer extrazellulären Domäne (MUECKLER et al. 1985). Zwischen den verschiedenen Isoformen gibt es Unterschiede hinsichtlich ihrer Kinetik und ihrer Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen auf hormoneller oder metabolischer
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Ebene (PANTALEON u. KAYE 1998). Die Glukosetransporter Typ 1 (SLC2A1) und Typ 3 (SLC2A3) werden in der frühen bovinen Embryonalentwicklung in allen Stadien exprimiert und wurden daher als Haupttransporter für Glukose im Embryo definiert (AUGUSTIN et al. 2001). Dabei ist die Hauptaufgabe von SLC2A3 der Transport von Glukose aus der Umgebung in den Embryo, während SLC2A1 den Transport an lateralen Membranen des Trophoblasten vermittelt und damit für den interzellulären Transport verantwortlich ist (AUGUSTIN et al. 2001). Vom 2-Zeller bis zur Blastozyste konnte ein kontinuierlicher Anstieg der SLC2A1- und SLC2A3- Transkriptmenge beobachtet werden (LEQUARRE et al. 1997). Dieser ist dadurch zu erklären, dass der Energiebedarf des Embryos mit vermehrten Furchungsteilungen zunimmt. Die höchsten Anstiege sind dabei mit der Aktivierung des embryonalen Genoms zwischen dem 8- bis 16-Zellstadium und der Kompaktierung des Embryos im Stadium der Morula verbunden (LEQUARRE et al. 1997). Letzteres wurde als das Stadium definiert, in welchem der Embryo von Pyruvat und Laktat auf Glukose als Energiequelle wechselt (RIEGER et al. 1992). Zudem steigt der Energiebedarf des bovinen Embryos in Form von ATP während der Blastulierung an, um damit den erhöhten Bedarf für die höhere Proteinsynthese zu kompensieren (THOMPSON et al. 1996).
Beim Vergleich in vivo und in vitro produzierter Embryonen des Rindes konnte ein Unterschied in der Expression von Blastozysten an Tag sieben nachgewiesen werden (WRENZYCKI et al. 2001, BERTOLINI et al. 2002, KNIJN et al. 2002). IVP- Embryonen weisen eine deutlich geringere Transkriptmenge im Vergleich zu In-vivo- Embryonen auf, die nach Meinung der Autoren auf eine reduzierte Viabilität der In- vitro-Blastozysten hindeutet (BERTOLINI et al. 2002). Eine höhere Anzahl der SLC2A1-mRNA konnte aber nach Anreicherung des Kultivierungsmediums mit Serum gezeigt werden (WRENZYCKI et al. 1999, WRENZYCKI et al. 2001).
Ebenfalls positiv auf die Expression der Glukosetransporter wirkte sich die Supplementation des Kultivierungsmediums mit IGF1 (100 ng/ml) aus und zeigte eine Tendenz, sie zu steigern (VELAZQUEZ et al. 2011). Auch das Geschlecht scheint einen Einfluss auf die Transkription von SLC2A1 auszuüben. So kam es zu einem Anstieg des Vorkommens männlicher Embryonen, wenn Eizellen aus Follikeln
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mit einer höheren Glukosekonzentrationen (>1,1 mM) stammen (ABELE et al. 2014).
Außerdem wurde herausgefunden, dass männliche Embryonen eine deutlich höhere SLC2A1-Transkriptmenge aufweisen als weibliche (LOPES et al. 2007). Dies ist wahrscheinlich auf die schnellere Entwicklung männlicher Embryonen unter In-vitro- Bedingungen zurückzuführen (AVERY et al. 1991). Zusätzlich konnte ein Einfluss der Sauerstoffkonzentration auf die Expression der Glukosetransporter registriert werden (HARVEY et al. 2004). Es wurde gezeigt, dass die Menge von SLC2A1-mRNA bei einer Kultivierung der Embryonen mit 2 % O2 signifikant geringer ist als bei einer Kultivierung mit 20 % O2. Allerdings ist die Expression der Glukosetransporter nicht nur abhängig von äußeren Bedingungen oder dem Geschlecht, sondern auch von der Qualität der Embryonen. So konnte eine höhere Glukoseaufnahmerate und eine größere SLC2A1-Transkriptmenge in Embryonen von morphologisch guter Qualität aufgezeigt werden (RENARD et al. 1980, WRENZYCKI et al. 2001, HARVEY et al.
2004, LOPES et al. 2007).
2.3.4 Anti-apototische (B-cell CLL/lymphoma 2 like 1) und pro-apoptotische Gene (BCL2-assoziiertes X Protein) der BCL2-Familie
Mitglieder der BCL2-Familie spielen eine entscheidende Rolle in der Regulierung von Apoptose. Hierzu zählen sowohl anti-apoptotische Gene, wie z.B. das B-cell CLL/lymphoma 2 like 1 (BCL2L1), deren Synthese das Auftreten der Apoptose verhindert, als auch pro-apoptotische Gene, wie das BCL2-assoziierte X Protein (BAX), deren Transkription die Apoptose in Zellen fördert.
In Eizellen und embryonalen Entwicklungsstadien konnten BAX-Transkripte bereits nachgewiesen werden, was auf eine besondere Bedeutung der BCL2-Familie während der bovinen Embryonalentwicklung schließen lässt (MELKA et al. 2010). Im Vergleich zu in vivo generierten Embryonen kam es zur Detektion größerer Transkriptmengen für BAX in In-vitro-Embryonen. Diese deuten auf ein häufigeres Vorkommen der Apoptose in IVP-Embryonen hin (RIZOS et al. 2002). Bei der IVP wird die Expression anti- und pro-apoptotischer Gene zusätzlich durch verschiedene
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Kultivierungsbedingungen beeinflusst (RIZOS et al. 2002, WARZYCH et al. 2007).
So kam es zu einem gesteigerten Vorkommen von BAX-Transkripten nach Kultivierung der Embryonen in SOF-Medium im Vergleich zu solchen aus einer Kultivierung in TCM (RIZOS et al. 2002). Bei der Untersuchung unterschiedlicher Supplementationen (FBS, PVA oder fatty acid free BSA) während der Kultivierung boviner Embryonen wurde jedoch kein Unterschied in der Expression von BCL2L1- oder BAX-Transkripten gefunden (WARZYCH et al. 2007). Weiterhin konnte bei einer gezielten Induktion von Apoptose mit Staurosporin keine Veränderung der BCL2L1- oder BAX-Transkripte beobachtet werden (VANDAELE et al. 2008). Insgesamt kam es zum Nachweis einer Korrelation zwischen der Qualität und der BAX-Expression, die sich besonders im 4-Zellstadium äußerte (MELKA et al. 2010). Zu diesem Entwicklungszeitpunkt wurden signifikant höhere BAX-Transkriptmengen in Embryonen mit einer schlechteren Morphologie detektiert. Des Weiteren zeigte sich, dass die IGF1-Supplementation keinen Einfluss auf das Vorkommen des anti- apoptotischen Gens BCL2L1 ausübt, aber die Expression des pro-apoptotischen Gens BAX steigert. Dabei bewirkt IGF1 jedoch keine Veränderung des Vorkommens von Apoptose, welches mit einer TUNEL-Analyse untersucht wurde (BLOCK et al.
2011).
32 2.4 Ziele des vorliegenden Projektes
Da die Rolle von IGF1 während der Eizellreifung und frühen Embryonalentwicklung des Rindes kontrovers diskutiert wird (WATSON et al. 1992, YASEEN et al. 2001), soll die vorliegende Arbeit zur Aufklärung des Einflusses von IGF1 beitragen. Dazu soll das Proteinexpressionsmuster und die -lokalisation des IGF1R anhand verschiedener Methoden (Western blot, Immunfluoreszenzfärbung) in bovinen präimplantatorischen Embryonalstadien untersucht und mit dem stadienspezifischen mRNA-Expressionsmuster verglichen werden.
Weiterhin soll der Effekt des Zusatzes einer physiologischen (100 ng/ml) oder supraphysiologischen IGF1-Konzentration (1000 ng/ml) zum In-vitro- Reifungsmedium bei Ab- bzw. Anwesenheit von Apoptoseinduzierern (Actinomycin D und Campothecin) untersucht werden. Dabei wird eine Analyse des Einflusses auf die Gesamtzellzahl, die Lebend-Tot-Ratio und die Anzahl apoptotischer Zellen erfolgen. Außerdem wird mittels ELISA (Enzym-linked Immunosorbent Assay) und IRMA (Immunoradiometrischen Assay) untersucht, inwieweit die hinzugegebene Konzentration IGF1 während der Eizellreifung beeinflusst wird. Die Ergebnisse sollen mit Hilfe von Untersuchungen der mRNA-Expression von spezifischen Gentranskripten des IGF-Systems (IGF1R, IGFBP2, IGFBP4), apoptoserelevanten Transkripten (BAX, BCL2L1) und Transkripten des Glukosestoffwechsels (SLC2A1, SLC2A3) verglichen werden. Damit könnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, ein besseres Verständnis des IGF-Systems und dessen Wirkung auf die Eizellreifung und die frühe Embryonalentwicklung zu erhalten.
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3. Material und Methoden
Die verwendeten Chemikalien stammten, sofern nicht anders angegeben, von der Firma Sigma Aldrich (Steinheim, Deutschland). Eine Zusammenfassung der verwendeten Geräte und Medien ist im Anhang zu finden.
3.1 In-vitro-Produktion
Die In-vitro-Produktion setzt sich aus den drei aufeinanderfolgenden Schritten der In- vitro-Maturation, der In-vitro-Fertilisation und der In-vitro-Kultivierung zusammen.
3.1.1 Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe
Die Kumulus-Oozyten-Komplexe für die IVP boviner Embryonen wurden aus Ovarien frisch geschlachteter Tiere eines nahe gelegenen Schlachthofes gewonnen. Zum einen handelte es sich hierbei um die VION GmbH (Bad Bramstedt, Deutschland) und zum anderen um den Fleischmarkt Olpe (Olpe, Deutschland). Bei der Auswahl der Ovarien wurde darauf geachtet, dass die Tiere weder krank noch trächtig und die Ovarien frei von Zysten waren. Der Transport der abgetrennten Ovarien zum Labor erfolgte in 37°C warmer PBS Complete in einem Thermobehälter (Duwer, KGW Isotherm, Karlsruhe) in einer Zeit von ein bis zwei Stunden. Dort wurden sie dreimal mit je 350 ml einer auf 37°C erwärmten 0,9%igen Natrium-Chlorid-Lösung gewaschen. Mit Hilfe der Slicing-Methode (ECKERT u. NIEMANN 1995) konnten die Kumulus-Oozyten-Komplexe anschließend aus den Follikeln der Ovarien isoliert werden. Die Ovarien wurden dafür in einer Glas-Petrischale (150 mm), in der sich 100 ml 37 °C warmes PBS Complete befand, durch eine Arterienklemme am Mesovarium fixiert und mit einem Schneideblock bestehend aus zehn dicht nebeneinander liegenden Rasierklingen angeschnitten, um die oberflächlichen und tiefer liegenden Follikel zu öffnen und die KOK freizusetzen. Danach wurde die gewonnene Flüssigkeit durch ein Teesieb in ein 500 ml Becherglas überführt, um
