Ladungskontrolle zur semi-quantitativen Auswertung der Proteinmenge . 59

3. Material und Methoden

3.8 Darstellung des IGF1R-Proteins

3.8.3 Ladungskontrolle zur semi-quantitativen Auswertung der Proteinmenge . 59

Für die Kontrolle des korrekten Ablaufs und zur semi-quantitativen Auswertung des Western blots erfolgte eine Redetektion der Nitrocellulosemembran mit einem Antikörper, der sich gegen β-Aktin richtet. Als Bestandteil des Zytoskeletts gehört β-Aktin zu den sogenannten Housekeeping-Proteinen und kommt in allen Zellen vor (MASSICOTTE et al. 2006).

Die Nitrocellulosemembran wurde zunächst nach der Detektion des IGF1R-Antikörpers in TBS-T gewaschen. Für die Entfernung der gebundenen Antikörper, fand eine Inkubation der Membran in Strippingpuffer mit einem pH von 2,2 für 30 min statt. Nach erneutem Waschen in TBS wurden die freien Bindungsstellen für eine Stunde mit 5%iger Magermilchlösung blockiert, bevor es zur Inkubation des β-Aktin-Antikörpers (sc47778, mouse anti- β-actin, Santa cruz biotechnology, CA, USA) für eine Stunde bei Raumtemperatur kam. Die Behandlung mit dem Sekundärantikörper fand wie zuvor für eine Stunde bei Raumtemperatur statt. Nach drei Waschschritten in TBS-T wurde das Chemilumineszenzsubstrat aufgetragen und die Membran mit Hilfe des Imagingsystems untersucht.

3.8.4 Antikörper zum Nachweis des IGF1R im Rind

Im Zuge einer Masterthese (POPPICHT 2010) wurde der Nachweis des IGF1R via Western blot mittels unterschiedlicher kommerziell erhältlicher Antikörper getestet.

Es konnte festgestellt werden, dass der Anti-IGF1-Rezeptor-Antikörper (Fa. Thermo Fisher Scientific, MA, USA) zur Detektion eines schwachen Signals in einem Pool von 100 Embryonen führte, das allerdings nicht zu einer quantitativen Auswertung geeignet war (Abb. 13, orange Markierung). Aus diesem Grund wurde für die vorliegende Arbeit ein Peptidantikörper von der Firma Seqlab (Göttingen, Germany) im Kaninchen produziert, der speziell auf die Peptidsequenz der α-Untereinheit des bovinen IGF1R abgestimmt ist (anti-popp IGF1R). Der Peptidantikörper setzte sich aus zwei Peptidsequenzen zusammen, die eine Länge von 16 bzw. 19 Aminosäuren vorweisen und keine Kreuzreaktionen zu anderen Sequenzen zeigen (Abb. 13, rote Markierungen).

Zusätzlich zu diesem Antikörper erfolgte die Austestung von drei weiteren kommerziell erhältlichen Antikörpern beim Rind. Der erste Antikörper richtet sich gegen die α-Untereinheit des IGF1R (IGF1Rα, Abb. 13 grüne Markierung), während der zweite (IGF1Rβ, schwarze Markierung) und dritte Antikörper (Anti-IGF1R antibody, blaue Markierung) spezifisch für die β-Untereinheit sind. Die Antikörper wurden zunächst in bovinem Gewebe (Leber und Plazenta) getestet, bevor sie zum Einsatz mit bovinen Embryonen kamen.

Abbildung 13: Peptidsequenz des IGF1R mit gekennzeichneten Positionen der getesteten Antikörper; hellgrau: α-Untereinheit (Aminosäure 1-710), weiß: β-Untereinheit (Aminosäure 711-1367), dunkelgrau: Transmembrandomäne (Aminosäure 906-929)

Getestete Antikörper aus der Masterarbeit (POPPICHT 2010) Anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen, Germany)

IGF1Rα (Santa cruz biotechnology, CA, USA) IGF1Rβ (Santa cruz biotechnology, CA, USA)

Anti-IGF1R antibody (AVIVA systems biology, CA, USA)

62 3.9 Immunfluoreszenzfärbung des IGF1R

Für die Darstellung des IGF1R-Proteins in Embryonen wurde eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt. Dafür kam als primärer Antikörper der spezifisch produzierte Kaninchen-Antikörper der Firma Seqlab zum Einsatz (s. 3.8.4).

Der eingesetzte Zweitantikörper war an das Fluorochrom Alexa Fluor 488 gekoppelt und richtete sich spezifisch gegen Kaninchen-Antikörper (goat anti-rabbit IgG-CFL 488, sc-362262, Santa cruz biotechnology, CA, USA).

Die Immunfluoreszenzfärbung setzte sich aus vier Schritten zusammen:

1. Vorbehandlung der Embryonen 2. Inkubation des 1. Antikörpers 3. Inkubation des 2. Antikörpers

4. Darstellung und Auswertung der Färbung

Mit Ausnahme der Blockierung und Inkubation des Erstantikörpers (4°C) und dem RNase-Verdau (37°C) fanden alle Schritte bei Raumtemperatur statt. Für die unterschiedlichen Inkubations- und Waschschritte fanden Petrischalen (60 mm, Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) Verwendung. Das Umsetzen der Embryonen fand mit Hilfe eines Strippers® (Gynemed GmbH, Lensahn) mit flexibler Pipettenspitze mit einem Durchmesser von 200 µm statt. Eine Negativkontrolle wurde bei jedem Färbedurchgang mitgeführt, die weder im Erst-, noch im Zweitantikörper inkubierte, um eine Eigenfluoreszenz oder unspezifische Fluoreszenz der Embryonen auszuschließen. Außerdem wurde eine zweite Kontrolle eingesetzt, bei der es nur zur Inkubation mit dem sekundären Antikörper kam, um unspezifische Bindungen nachzuweisen.

3.9.1 Vorbehandlung der Embryonen und Inkubation mit dem 1. Antikörper

Die Embryonen wurden je nach zu untersuchendem Stadium am 2. bis 8. Tagen der Kultivierung entnommen und dreimal in 100 µl PVP (Polyvinylpyrrolidon) in PBS (1 mg/ml) in einer Petrischale gewaschen. Die Untersuchung von 2-Zellern erfolgte an Tag 2, 4-Zeller an Tag 3 und 8-Zeller an Tag 4 der Kultivierung. Embryonen im 16-Zellstadium wurden an Tag fünf und Morulae an Tag sechs analysiert. An Tag sieben und acht kam es zur Entnahme von Blastozysten und expandierten Blastozysten.

Die Färbung begann mit einem Fixierungsschritt der Embryonen in 500 µl 4 % Paraformaldehyd in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur. Es folgte ein erneutes dreimaliges Waschen in PVP/PBS. Zur Permeabilisierung kam es zur Inkubation der Embryonen für eine Stunde in 500 µl 0,1 % Triton-X 100 in PBS.

Nachdem sie erneut dreimal in PVP/PBS gewaschen wurden, folgte ein Blockierungsschritt, in dem unspezifische Bindungsstellen mit 500 µl 3 % BSA in PBS für eine Stunde blockiert wurden. Jetzt konnte mit dem 1. Antikörper inkubiert werden. Dafür kamen 500 µl des spezifisch produzierten anti-popp IGF1R in einer Verdünnung von 1:100 in 3 % BSA/PBS über Nacht bei 4°C in einer Feuchtekammer zum Einsatz, um eine mögliche Verdunstung zu verhindern.

3.9.2 Inkubation mit dem 2. Antikörper, Zellkernfärbung und Darstellung der Färbung

Nach Ende der Inkubation mit dem 1. Antikörper wurden die Embryonen dreimal in 3 % BSA/PBS gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Im Anschluss erfolgte die Verdünnung des sekundären Antikörpers 1:200 in 3 % BSA und Inkubation in 500 µl für 2 Stunden im Dunkeln. Nach dem Waschen in BSA/PBS kam es zum RNase-Verdau für eine Stunde im Dunkeln bei 37°C in 50 µl einer 50 µg/ml RNase A-Lösung. Die Zellkernfärbung fand mittels 100 µl Propidiumiodid in einer Konzentration von 25 µg/ml für 5 min im Dunkeln statt. Nach Entfernen des PI

durch dreimaliges Waschen in PVP/PBS wurden die Embryonen auf einen Objektträger gebracht und mit 4-5 µl Vectashield überschichtet. Die Darstellung der Immunfluoreszenzfärbung erfolgte direkt im Anschluss an die Färbung bei 10-facher Vergrößerung mit einem Blau-Filter bzw. Grün-Filter (Olympus, Hamburg) an einem Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus, Hamburg, Deutschland). Die Auswertung fand mit der Aufnahme- und Auswertesoftware CellSens Dimension (Olympus, Hamburg, Deutschland) statt. Zunächst wurde für jeden Embryo ein Bild zur Darstellung der Zellkerne und ein Bild zur Darstellung der Immunfluoreszenz mit Hilfe einer am Mikroskop integrierten Kamera aufgenommen. Zusätzlich konnte für jeden Embryo eine Aufnahme der Immunfluoreszenz in Graustufen erstellt werden, um an dieser die Verteilung der Graustufenintensitäten zu messen (TOLIVIA et al. 2006).

Dazu wurde die Fläche umfahren, die von den Blastomeren eingenommen wurde und die Intensität aller Graustufen dieser Fläche erfasst. Von diesem Wert konnte die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz abgezogen werden, die sich durch Umfahren einer kreisrunden Fläche am Rand ergab, die in etwa der Größe des Embryos entsprach. Der so korrigierte Wert wurde daraufhin für den Vergleich der Fluoreszenzintensitäten in unterschiedlichen Entwicklungsstadien verwendet. Eine beispielhafte Auswertung eines Graustufenbildes ist in Abbildung 14 dargestellt.

Abbildung 14: Repräsentative Darstellung einer beispielhaften Auswertung der relativen Signalstärke der IGF1R-Fluoreszenz einer expandierten Blastozyste

3.10 Statistische Auswertungen

Für die statistischen Auswertungen wurde die Software SigmaStat 3.5 genutzt (Fa.

Systat Software GmbH). Dabei wurde zunächst auf die Normalverteilung der Werte mit Hilfe eines Kolmogorov-Smirnov-Tests geprüft. Anschließend fand für alle Untersuchungen eine einseitige Varianzanalyse (One-way ANOVA) mit anschließendem Tukey-Test statt. Unterschiede von P ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Unterschiede mit P ≤ 0,07 galten als Tendenz.

66 3.11 Allgemeiner Versuchsaufbau

3.11.1 Einfluss der Supplementation unterschiedlicher IGF-1 Konzentrationen

In der nachfolgenden Grafik sind die Abläufe der Versuche zur Supplementation von IGF1 während der Oozytenreifung schematisch dargestellt.

3.11.2 Vergleichende Untersuchung der Expression des IGF1R

Das nachfolgende Schema stellt die Einzelheiten zum Versuchsaufbau für die vergleichende Untersuchung der Expression des Insulin-like growth factor 1 – Rezeptors auf mRNA- und Proteinebene dar.

4. Ergebnisse

4.1 Ermittlung der Teilungs- und Entwicklungsraten

Während der Zeit von Februar 2011 bis einschließlich Juni 2012 wurden im Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Embryonen in vitro produziert. In 60 Durchgängen wurden insgesamt 4800 Kumulus-Oozyten-Komplexe gewonnen und in der IVP eingesetzt (Tab. 11). Mit einer durchschnittlichen Teilungsrate von 57,4 ± 1,8 % und einer Entwicklungsrate von 27,6 ± 1,7 % an Tag acht entstanden insgesamt 1325 Embryonen, die in Gruppen von bis zu 10 Embryonen bei -80°C für die Western blot – Analysen gelagert wurden.

Tabelle 11: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Teilungs- und Entwicklungsraten der IVP-Versuche zur Gewinnung expandierter Blastozysten für die Western blot - IVP-Versuche

Anzahl [n]

Raten [%]

(MW ± SD)

KOK in der IVC 4800

Teilung 2755 57,4 ± 7,3

Entwicklung Tag 8 1325 27,6 ± 8,1

Durch den Ortswechsel der Arbeitsgruppe an die Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere der Justus-Liebig-Universität Gießen im Jahr 2012, kam es, bedingt durch den Umbau von Laborräumen, zu einer Unterbrechung der Versuche. Im April 2013 begann die routinemäßige Produktion von Embryonen in vitro in den neuen Räumlichkeiten, sodass ab August 2013 die Versuche wieder aufgenommen wurden. In insgesamt 61 Durchgängen wurden 8072 KOK gewonnen, in vitro gereift, befruchtet und kultiviert. Insgesamt teilten sich in der Kontrollgruppe 953 der vermeintlichen Zygoten, was einer durchschnittlichen Teilungsrate von 60,6 ± 8,1 % entsprach. Bis zu Tag sieben entwickelten sich

durchschnittlich 22,1 ± 6,4 % der Embryonen zum Stadium der Morula oder Blastozyste. An Tag acht der IVC stieg die durchschnittliche Entwicklungsrate auf 24,1 ± 8,5 % an. Die Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen der unterschiedlichen Versuchsgruppen sind in Tabelle 12 dargestellt.

Tabelle 12: Anzahl eingesetzter Kumulus-Oozyten-Komplexe, sowie Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen in den einzelnen Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung

Zwischen Embryonen der einzelnen Versuchsgruppen konnten statistisch signifikante Unterschiede in den Teilungsraten beobachtet werden (P ≤ 0,05). So zeigte sich, dass die Supplementation des Medium mit IGF1 (1000 ng/ml) und Apoptoseinduzierern die Teilungsrate signifikant im Vergleich zu Embryonen der Kontroll- und DMSO-Gruppe reduziert.

Beim Vergleich der Entwicklungsraten an Tag sieben und acht der Kultivierung konnten ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen Embryonen einiger Gruppen

nachgewiesen werden (Abb. 15). An Tag sieben erreichten Embryonen der Kontrollgruppe eine signifikant höhere Entwicklungsrate als die der IGF1-Supplementationsgruppen IGF 100 + Apoptoseinduzierer, IGF 1000 und IGF 1000 + Apoptoseinduzierer. Zudem konnten signifikant mehr Morulae und Blastozysten in der DMSO- und der IGF 100 – Gruppe als in der IGF 1000 + Apoptoseinduzierer beobachtet werden. An Tag acht der Kultivierung konnten bei Embryonen der Kontrollgruppe erneut signifikant höhere Entwicklungsraten erzielt werden als bei denen der IGF1-supplementierten Gruppen mit Apoptoseinduzierern. Außerdem wurde eine tendenziell reduzierte Anzahl an Morulae und Blastozysten in der Gruppe IGF 1000 + Apoptoseinduzierer im Vergleich zur Gruppe mit DMSO oder IGF 100-Supplementation gefunden (P ≤ 0,07).

Abbildung 15: Darstellung der prozentualen Entwicklungsraten der einzelnen Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung an Tag sieben und Tag acht (MW + SD); a:b P ≤ 0,05

a ab*

ab ab*

b ab

b**

a ac

ab ac

bc bc

71 4.2 Bestimmung der Kernreifungsraten

Nach 24-stündiger Reifung der Kumulus-Oozyten-Komplexe in Maturationsmedium mit unterschiedlichen Zusätzen wurde die Kernreifungsrate bestimmt. Zunächst fand eine mikroskopische Untersuchung des Cumulus oophorus statt. Dabei unterschieden sich die einzelnen Versuchsgruppen optisch in der Kumulusexpansion, wie in Abbildung 16 deutlich zu erkennen ist. KOK der Kontrollgruppe, sowie der Supplementationsgruppen mit IGF in einer Konzentration von 100 ng/ml und 1000 ng/ml wiesen eine deutliche Expansion des Kumulus oophorus auf. Dagegen bewirkte der Zusatz von DMSO eine Reduktion der Kumulus-Expansion (Abb. 16, B). Bei der Maturation mit Apoptoseinduzierern konnte demgegenüber nur eine geringgradige bis keine Expansion identifiziert werden (Abb. 16, C, E, G).

Abbildung 16: Repräsentative Illustration der Kumuluszellexpansion in den unterschiedlichen Versuchsgruppen nach 24-stündiger Maturation; A: Kontrolle, B: DMSO; C: Apoptoseinduzierer; D: IGF 100, E: I+A 100, F: IGF 1000, G: I+A 1000

A B C

G F

E D

Im Anschluss an die Kumulusentfernung wurde aus durchschnittlich acht IVM-Durchgängen die Maturationsrate von Oozyten der Kontroll- und der einzelnen Versuchsgruppen mit einer Hoechst 33342-Färbung bestimmt. Es konnten unterschiedliche Reifungsgrade registriert werden. Die zu erwartenden Stadien sind beispielhaft in Abbildung 17 dargestellt.

Abbildung 17: Repräsentative Darstellung der nukleären Stadien boviner Oozyten während der Reifung mit Hilfe einer Hoechst 33342-Färbung; A: Prophase I, B: Telophase I, C: Metaphase II

Die Auszählung der Metaphase II-Oozyten nach Färbung mit Hoechst 33342 ergab für die Oozyten der Kontrollgruppe eine durchschnittliche Maturationsrate von 83,5 ± 6,9 %. Beim Vergleich der Maturationsraten von Oozyten aus der Kontrollgruppe mit Oozyten aus den unterschiedlichen Supplementationsgruppen kam es zu einer signifikanten Verringerung der nukleären Maturation in den Versuchsgruppen, denen Apoptoseinduzierer hinzugefügt wurden (Tab. 13). IGF1 in einer Konzentration von 1000 ng/ml als Zusatz in der Reifung verursachte ebenfalls eine signifikante Abnahme der Maturationsrate im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Supplementation mit DMSO bewirkte eine tendenzielle Reduzierung der Anzahl reifer Eizellen (P ≤ 0,07). Hingegen konnte kein Einfluss eines IGF1-Zusatzes von 100 ng/ml zum Maturationsmedium beobachtet werden.

A B C

Tabelle 13: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Maturationsraten von Oozyten der unterschiedlichen Versuchsgruppen

KOK in der IVC (n)

Maturationsrate [%]

(MW ± SD)

Kontrolle 242 83,5 ± 6,9 ^a*

DMSO 168 72,1 ± 5,4 ^ab**

Apoptoseind. 182 68,5 ± 8,3 ^b IGF 100 199 75,1 ± 7,1 ^ab IGF 100 + Apop. 190 69,5 ± 7,3 ^b IGF 1000 186 70,2 ± 6,0 ^b IGF 1000 + Apop. 191 70,9 ± 10,9 ^b a:b P ≤ 0,05; *:** P ≤ 0,07

4.3 Untersuchung der IGF1-Konzentrationen im Medium

Die IGF1-Konzentration im Maturationsmedium der unterschiedlichen Versuchsgruppen wurde sowohl vor als auch nach 24-stündiger Inkubation in mindestens drei Wiederholungen gemessen. Für die Untersuchung kamen insgesamt vier verschiedene kommerzielle Kits zum Einsatz, die auf zwei Methoden beruhten, ELISA und IRMA.

Der erste ELISA, der Firma DRG Instruments GmbH erzielte als Messergebnis Werte zwischen 0,7 und 25,0 ng/ml vor der Maturation und 54,8 und 367,4 ng/ml nach der Maturation. Dabei konnte ein Anstieg der IGF1-Konzentration in allen Proben nach 24-stündiger Maturation gezeigt werden. Dieser Test erzielte als einziger Werte für IGF1 in den Kontrollgruppen, denen kein IGF1 hinzugeführt wurde.

Der zweite ELISA (IBL International GmbH) erreichte Messwerte zwischen 837,8 und 1295,3 ng/ml vor Beginn der Maturation für die IGF1-supplementierten Gruppen.

Nach 24-stündiger Maturation wurden Konzentrationen zwischen 761,2 und 1416,0 ng/ml gemessen. Die Werte für die Kontroll-, die DMSO- und die Apoptoseinduzierer-Gruppe lagen hierbei unterhalb der Nachweisgrenze des Tests.

Für einige Gruppen konnte ein Anstieg in der IGF1-Konzentration verzeichnet werden, während andere einen Abfall der Konzentration zeigten. Die erwarteten Messwerte von 100 ng/ml bzw. 1000 ng/ml in den Gruppen, denen diese Konzentration hinzugefügt wurde, konnten anhand des Tests nicht bestätigt werden.

Des Weiteren wurde ein IRMA der Firma DRG Instruments GmbH ausgetestet, der allerdings nicht zu einer Auswertung der Messung führte, da die Werte der Standardkurve nicht linear ausfielen.

Mit Hilfe des zweiten IRMA (Beckman Coulter) konnten allerdings Werte erzielt werden, die zu Beginn der Maturation zwischen 18,8 und 30,0 ng/ml in den Gruppen mit IGF1-Zusatz lagen. Nach der Maturation wurden Konzentrationen zwischen 14,6 und 22,3 ng/ml gemessen. Bis auf eine Ausnahme konnte ein Abfall in der IGF1-Konzentration durch die Maturation über 24 Stunden beobachtet werden. Die Werte für die Kontroll-, DMSO- und Apoptoseinduzierer-Gruppe lagen auch hier unterhalb der Nachweisgrenze.

Eine Übersicht aller Ergebnisse ist in Tabelle 14 dargestellt.

Tabelle 14: Vergleich der Messergebisse der IGF1-Konzentration im Medium mit Hilfe unterschiedlicher Methoden vor und nach 24-stündiger Oozytenmaturation

IGF1-Konzentration [ng/ml]

76 4.4 Resultate der Lebend-Tot-Färbung

Die Zellzahlfärbung mit Ethidium homodimer und Hoechst 33342 von expandierten Blastozysten an Tag sieben der Kultivierung (Abb. 18) ergab für Embryonen der Kontrollgruppe eine mittlere Gesamtzellzahl von 134,9 ± 18,6 Zellen pro Blastozyste.

Dabei lag die Anzahl toter Zellen bei durchschnittlich 7,4 ± 2,4 Zellen pro Blastozyste.

Daraus ergab sich für die Lebend-Tot-Zellratio ein Mittelwert von 19,1 ± 6,8.

Abbildung 18: Repräsentative Abbildung der Lebend-Tot-Färbung mit Höchst 33342 und Ethidium homodimer; Blau: Lebende Zellen; Rot: Tote Zellen

Beim Vergleich expandierter Blastozysten hinsichtlich ihrer Gesamtzellzahl konnte eine statistisch signifikante Reduzierung in Blastozysten aus der Maturation mit IGF1 in einer Konzentration von 1000 ng/ml mit Apoptoseinduzierern im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet werden (Tab. 15). Die Untersuchung der Anzahl toter Zellen in expandierten Blastozysten der einzelnen Supplementationsgruppen ergab keine signifikanten Unterschiede.

Tabelle 15: Gesamtzellzahlen, Anzahl toter Zellen und Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben

Gesamtzellzahl (MW ± SD)

Tote Zellen (MW ± SD)

Kontrolle (n=16) 134,9 ± 18,6 ^a 7,4 ± 2,4 DMSO (n=10) 116,8 ± 19,0 ^ab 10,0 ± 4,4 Apoptoseind. (n=11) 132,8 ± 21,4 ^ab 11,3 ± 4,9 IGF 100 (n=8) 111,1 ± 21,9 ^ab 11,8 ± 5,6 IGF 100 + Apop. (n=8) 112,0 ± 9,4 ^ab 8,1 ± 2,4 IGF 1000 (n=8) 134,4 ± 27,0 ^ab 9,6 ± 7,8 IGF 1000 + Apop. (n=11) 110,7 ± 20,3 ^b 10,6 ± 5,1 a:b P ≤ 0,05

Aus der Berechnung der Lebend-Tot-Ratio ging hervor, dass der höchste Wert in der Kontrollgruppe erzielt wurde (Abb. 19). Demnach wiesen Blastozysten aus der Kontrollgruppe die wenigsten toten Zellen im Verhältnis zur Gesamtzellzahl auf.

Sowohl der Zusatz von IGF1 (100 ng/ml), als auch IGF1 (1000 ng/ml) zusammen mit Apoptoseinduzierern, führte zu einer signifikanten Reduzierung der Lebend-Tot-Ratio. Weiterhin bewirkte die Supplementation mit DMSO und die mit Apoptoseinduzierern allein eine signifikant geringere Lebend-Tot-Ratio.

Abbildung 19: Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen (MW + SD); a:b P ≤ 0,05

b b ab

n=16 n=10 n=11 n=8 n=8 n=8 n=11

4.5 Resultate der Färbung apoptotischer Zellen

Bei der Untersuchung von Apoptose in mindestens sechs expandierten Blastozysten pro Supplementationsgruppe wurden mit Hilfe einer TUNEL-Analyse durchschnittliche Gesamtzellzahlen zwischen 127,0 und 143,4 Zellen pro Blastozyste erzielt. In der Kontrollgruppe waren davon durchschnittlich 2,1 ± 1,1 % der Zellen TUNEL-positiv (Abb. 20, A). Eine Positivkontrolle, bei der Blastozysten mit DNase behandelt wurden, um DNA-Brüche hervorzurufen, lief standardmäßig bei jeder Färbung mit, um die Spezifität des Tests zu garantieren (Abb. 20, B).

Abbildung 20: Repräsentative Darstellung expandierter Blastozysten nach TUNEL- und Zellkernfärbung; A: Blastozyste der Kontrollgruppe; B: Positivkontrolle einer DNase-behandelten Blastozyste; Blau: Lebende Zellen; Grün: TUNEL-positive Zelle

Das Verhältnis des prozentualen Anteils TUNEL-positiver zu –negativer Zellen ist in Abbildung 21 dargestellt. Es zeigte sich, dass in Embryonen der Gruppe, in der Apoptoseinduzierer allein dem Maturationsmedium zugesetzt wurde, statistisch signifikant mehr TUNEL-positive Zellen pro Blastozyste vorkamen als in Embryonen der Kontrollgruppe (Tab. 16). Es konnte kein signifikanter Unterschied im prozentualen Anteil TUNEL-positiver Zellen zwischen Embryonen der anderen Supplementationsgruppen und der Kontrollgruppe gefunden werden. Außerdem war die Anzahl TUNEL-positiver Zellen in Embryonen der Gruppen, denen IGF1 zugesetzt wurde, im Vergleich zu denen der Gruppen, deren Maturationsmedien neben IGF1 auch Apoptoseinduzierer enthielten, ähnlich.

A B

Abbildung 21: Darstellung des prozentualen Anteils TUNEL-positiver und -negativer Zellen in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen

Tabelle 16: Prozentuale Verteilung TUNEL-negativer und -positiver Zellen expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben

TUNEL-negative [%]

(MW ± SD)

TUNEL-positive [%]

(MW ± SD)

Kontrolle (n=14)

97,9 ± 1,1 2,1 ± 1,1 ^a DMSO (n=8)

96,8 ± 1,0 3,2 ± 1,0 ^ab Apoptoseind. (n=9)

95,5 ± 2,1 4,5 ± 2,1 ^b IGF 100 (n=10)

96,3 ± 1,6 3,7 ± 1,8 ^ab IGF 100 + Apop. (n=6)

95,7 ± 2,1 4,3 ± 2,1 ^ab IGF 1000 (n=9)

96,0 ± 1,7 4,0 ± 1,7 ^ab IGF 1000 + Apop. (n=7)

96,5 ± 1,9 3,6 ± 1,9 ^ab a:b P ≤ 0,05

n=14 n=8 n=9 n=10 n=6 n=9 n=7

b b

b b b b

4.6 Nachweis entwicklungsrelevanter Gentranskripte

4.6.1 MessengerRNA-Expression ausgewählter Gene nach IVM mit verschiedenen Zusätzen

Für die Untersuchung der Expression ausgewählter Gentranskripte wurde eine RT-qPCR mit mindestens zwei Wiederholungen durchgeführt. Dabei konnten für das anti-apoptotische Gen BCL2L1 statistisch signifikante Unterschiede in der Expression zwischen Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen nachgewiesen werden. Bei Betrachtung der relativen Transkriptmenge von BCL2L1 wird deutlich, dass das anti-apoptotische Gen in Embryonen aus der Maturation mit IGF1 (1000 ng/ml) und Apoptoseinduzierern im Vergleich zu Embryonen aus allen anderen Supplementationsgruppen signifikant häufiger vorkommt (Abb. 22).

Abbildung 22: Relative Transkriptmenge von BCL2L1 in expandierten Blastozysten der verschiedenen Supplementationsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05

Für Transkripte des IGF-Systems (IGF1R, IGFBP2, IGFBP4), des Glukosestoffwechsels (SLC2A1, SLC2A3) und für das pro-apoptotische Transkript BAX wurden keine signifikanten Einflüsse der verschiedenen Zusätze während der IVM in expandierten Blastozysten detektiert (Abb. 23 und 24).

n=4 n=3 n=4 n=2 n=5 n=3 n=2

Abbildung 23: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGF1R, IGFBP3 und BAX in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM)

Abbildung 24: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGFBP2, SLC2A1 und SLC2A3 in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM)

4.6.2 Stadienspezifische mRNA-Expression des IGF1R

Bei der Untersuchung der mRNA-Expression des IGF1R mit mindestens zwei Wiederholungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der frühen Embryonalentwicklung konnte eine stadienspezifische Expression detektiert werden (Abb. 25). Zu Beginn der Furchungsteilungen, während des 2-Zellstadiums, wurde die größte relative Anzahl an IGF1R-Transkripten gemessen (62,9 ± 24,3). Daraufhin folgte ein Abfall der Transkriptmenge mit einem Minimum im 8-Zellstadium (4,1 ± 2,1). Vom 16-Zeller bis zur expandierten Blastozyste konnte ein kontinuierlicher Anstieg der relativen Menge an IGF1R-Transkripten erkannt werden. Dabei wurden signifikante Unterschiede zwischen der mRNA-Expression des IGF1R im 2-Zellstadium und der im 8-Zellstadium entdekt. Des Weiteren wurden signifikant niedrigere Transkriptmengen des IGF1R im 16-Zeller und dem Stadium der Morula im Vergleich zum 2-Zellstadium gezeigt.

Abbildung 25: Darstellung der relativen Transkriptmenge des IGF1R im Verlauf der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05

b b

n=3 n=2 n=3 n=3 n=5 n=5 n=3

1 2 3 4

44 kDa 125 kDa

4.7 Nachweis der Proteinexpression des IGF1R 4.7.1 Proteinnachweis mittels Western blot

In insgesamt 24 Western blot-Analysen mit vier verschiedenen Antikörpern wurden

Im Dokument Bedeutung des Insulin-like growth factor-Systems während der Oozytenreifung und präimplantorischen Embryonalentwicklung des Rindes (Seite 67-0)