Isolierung der mRNA

Die Isolierung der mRNA aus Embryonen erfolgte mit dem Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Purification Kit (Life technologies, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt). Zunächst wurde die Dynabeads-Suspension auf einem Vortexer (Peqlab, Erlangen) homogenisiert und je 10 µl pro zu untersuchende Probe in ein Reaktionsgefäß überführt. Es folgte ein Waschen der Suspension mit Hilfe eines Magnetic Particle Concentrators (MPC, Life Technologies, Darmstadt). Dafür wurde das Reaktionsgefäß in den MPC gestellt und 10 s gewartet, bis sich die Dynabeads durch die magnetische Wirkung deutlich sichtbar an einer Seite konzentrierten (Abb. 12). Nun konnte der Überstand abgenommen und durch die gleiche Menge Lysis/Binding-Puffer ersetzt werden. Nach einem erneuten Waschschritt war die Vorbereitung der Dynabeads abgeschlossen und es wurde mit der Isolierung der mRNA aus den Proben begonnen.

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Abbildung 12: Darstellung des Magnetic Particel Concentrators mit Dynabead-Lösung (Pfeil)

Zu Beginn wurden zu jeder zu untersuchenden Probe 150 µl Lysis/Binding-Puffer und als interner Standard 1 µl Kaninchen-Globin-mRNA (1 pg/µl) hinzugegeben, 5 s auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt, zentrifugiert und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte die Zugabe von je 10 µl der zuvor präparierten Dynabeads zu jeder Probe und Inkubation für 5 min auf einem Thermoschüttler (Peqlab, Erlangen) bei Raumtemperatur, bei der es zu einer Bindung der Dynabeads an den PolyA-Schwanz der embryonalen mRNA kam. Nach diesem Inkubationsschritt wurden die Reaktionsgefäße in den MPC gestellt, der Überstand abgenommen und die Proben mehrmals gewaschen. Dafür wurden die Proben einmal mit 100 µl des Waschpuffers A versetzt und in den MPC gestellt, um den Überstand abzupipettieren. Anschließend folgte eine dreimalige Resuspension der Proben mit 100 µl des Waschpuffers B mit Verwerfung des Überstandes. Nach dem letzten Waschschritt erfolgte die Trennung der mRNA von den Dynabeads mit 11 µl RNase-freiem Wasser (Ampuwa, Fresenius, Deutschland) für 3 min bei 65°C. Im Anschluss an die Eluierung der mRNA wurden die Reaktionsgefäße in den MPC auf Eis gestellt und der Überstand, der nun die isolierte mRNA enthielt, direkt für die Reverse Transkription verwendet.

52 3.7.2 Reverse Transkription

Für die RT-Reaktion wurden zunächst zwei Mastermixe für fünf unterschiedliche Ansätze mit Hilfe des GeneAmp® RNA PCR Core Kits (Life technologies, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) pipettiert. Die fünf Ansätze setzten sich zusammen aus dem des Globin-Standards, der Proben und der Negativkontrolle der Reagenzien, bei der Wasser statt RNA eingesetzt wurde (Mastermix I), sowie der Negativkontrolle für Globin und der Negativkontrolle der Proben, bei denen keine RNAse-Inhibitoren und keine Reverse Transkriptase hinzugegeben wurden (Mastermix II) und demnach keine Umwandlung der mRNA in cDNA erfolgte. Nachfolgend dargestellt sind die Mastermixe für eine Platte mit vier Embryonen (Tab. 6). Das Pipettieren der Reagenzien fand stets auf Eis statt.

Tabelle 6: Mastermixe für die Reverse Transkription

Zusatz Konzentration Endkonzentration unterschiedlichen Ansätze zusammen mit der präparierten mRNA. Die Ansätze wurden mit Ampuwa auf ein Endvolumen von 20 µl gebracht (Tab. 7).

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Tabelle 7: Pipettierschema der Reversen Transkription mit einem Volumen von 20 µl

Zusatz Globin

Standard Embryo Neg.

Reagenzien

Neg. RI/RT Embryo

Neg. RI/RT Globin

Mastermix I (µl) 9 9 9 - -

Mastermix II (µl) - - - 7 7

RNA (µl) 1 10,7 - 0,3 1

Add 20 µl H₂O 10 0,3 11 12,7 12

Die Reverse Transkription fand in einem Thermocycler (T1, Biometra, Göttingen, Deutschland) statt und gliederte sich in folgende Schritte:

• 10 min bei 25°C

• 60 min bei 42°C

• 5 min bei 99°C

Anschließend wurden die Proben direkt auf Eis gestellt und für die qPCR verwendet.

3.7.3 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

Die gewonnene cDNA wurde zur Quantifizierung der Expressionsintensitäten unterschiedlicher Gene in einer qPCR eingesetzt. Untersucht wurden sowohl Gentranskripte des IGF-Systems (IGF1R, IGFBP2, IGFBP3), als auch apoptose- (BAX, BCL2) und entwicklungsrelevante (SLC2A1, SLC2A3). Die Primersequenzen der untersuchten Gene sind in Tabelle 8 dargestellt.

Material und Methoden

Gen Primersequenz (5‘-3‘) Position des

Primers

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Die qPCR wurde mit dem kommerziell erhältlichen Kit iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) durchgeführt, dessen Mastermix sich aus Reaktionspuffer, dNTPs, iTaq DNA Polymerase, MgCl2, SYBR Green I und Fluoreszein zusammensetzt. Pro eingesetztem Primerpaar wurde ein Ansatz auf Eis pipettiert, der aus dem Mastermix und dem jeweiligen Primerpaar bestand (Tab. 9).

Tabelle 9: Ansätze für die qPCR

Zusatz Endkonzentration Mastermix in µl

Mastermix 1 x 10

Primer forward 0,2 µM 0,4

Primer reverse 0,2 µM 0,4

Nachdem der Mastermix auf die einzelnen Wells von sogenannten Einzelstreifen (single stripes, Biozym, Hessisch Oldendorf) verteilt wurde, konnte die cDNA hinzugefügt und auf ein Endvolumen von 20 µl mit Ampuwa aufgefüllt werden.

Abhängig von der Expressionsintensität des jeweiligen Gens wurde die eingesetzte Menge an cDNA, als sogenanntes Embryonenäquivalent (EA), angepasst. Die einzelnen Äquivalente sind in Tabelle 10 aufgelistet.

Tabelle 10: Eingesetzte Embryonenäquivalente der zu untersuchenden Gentranskripte

Gen Embryonenäquivalent (einfacher Ansatz)

Embryonenäquivalent (doppelter Ansatz)

IGF1R 0,1 0,2

IGFBP2 0,05 0,1

IGFBP3 0,1 0,2

BAX 0,025 0,05

BCL2 0,025 0,05

SLC2A1 0,1 0,2

SLC2A3 0,025 0,05

Globin 0,05 0,1

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Nachdem alles in die Wells pipettiert worden war, konnten diese mit Deckeln versehen und direkt in einen Thermocycler mit integrierter Real-time Einheit (Bio-Rad C1000 mit CFX96, Bio-Rad Laboratories GmbH, München) verbracht werden. Das qPCR-Programm startete zunächst mit einem 10minütigen Denaturierungsschritt bei 95°C bevor sich 43 Zyklen anschlossen, die sich wie folgt zusammensetzen:

• 15 s bei 95°C

• 30 s bei 60°C

• 30 s bei 72°C

Während dieser Zyklen kam es zu einer Anlagerung sequenzspezifischer Primer an die cDNA und einer Interkalation des SYBR Green Farbstoffes an die resultierende doppelsträngige DNA. Durch die kontinuierliche Messung der Fluoreszenz nach jedem Zyklus konnte die DNA quantifiziert werden. Die Verifizierung der PCR-Produkte erfolgte mit Hilfe einer Schmelzkurve, die der Cycler durch schrittweise Erhöhung der Temperatur um 0,5°C von 55°C auf 95°C erstellte.

Für die Quantifizierung der spezifischen mRNA-Expression wurden zunächst die Schwellenwerte (Threshold Cycle, ct) der einzelnen Embryonen mit den ct des internen Standards Globin zu einem Δct verrechnet [∆ct (Globin) = ct (Globin) Standard (50 fg) - ct (Globin) Embryo]. Des Weiteren erfolgte die Berechnung des

∆ct der einzelnen Gentranskripte (Gene of interest, GOI) zu einem ∆ct [∆ct (GOI) = ct (GOI) – ct (Globin) Embryo]. Zum Schluss wurde die Tageseffizienz (E) des Standards und des GOI mit den ∆cts verrechnet, um eine relative Häufigkeit (fold difference, FD) zu erhalten [FD = E(GOI)^-Δct (GOI)

/ E(Globin)^-Δct (Globin)

] (PFAFFL 2001).

Die Untersuchung jedes Gentranskriptes erfolgte mit mindestens 5 Wiederholungen.

57 3.8 Darstellung des IGF1R-Proteins

Für den semi-quantitativen Nachweis des IGF1R-Proteins in Embryonen fand die Methode des Western blots Anwendung. Bei einem Western blot werden die Proben mit einer Gelelektrophorese aufgetrennt und danach auf eine Membran übertragen.

Schließlich erfolgt die Detektion des zu untersuchenden Proteins durch spezifische Antikörper.

3.8.1 Gelelektrophorese

Zunächst erfolgte eine elektrophoretische Auftrennung der Proben mit einer SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamidgelelektrophorese) nach LAEMMLI (1970) unter denaturierenden Bedingungen. Hierzu wurden Polyacryamidgele in einer Mini-Protean Tetra Cell Apparatur (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) erstellt. Erst kam es zur Produktion eines 8%igen Trenngels mit einer Geldicke von 1 mm, das mit Isopropanol überschichtet wurde, um ein Zurückbleiben von Luftbläschen an der Oberfläche des Gels zu verhindern. Nach der Polymerisation des Gels folgte die Entfernung des Isopropanols und Trocknung der Kammer mit Whatmanpapier (Sigma Aldrich, Steinheim). Das Sammelgel wurde auf das Trenngel gefüllt und ein Teflonkamm zur Formung der Ladungstaschen eingesetzt. Nach dem Auspolymerisieren des Sammelgels kam es zur Positionierung des Gels in der Gelelektrophoresekammer und Befüllung mit SDS-Laufpuffer. Jetzt konnte der Kamm entfernt und das Gel mit den Proben und einem entsprechenden Größenstandard (Marker) beladen werden.

Zum Austesten der unterschiedlichen Antikörper wurden gefrorene Gewebebiopsien boviner Leber, Kotyledone, Karunkel und humaner Plazenta als Kontrollen verwendet und Gruppen von jeweils 10 eingefrorenen Embryonen genutzt. Das Gewebe wurde zum einen am Schlachthof gewonnen und wurde zum anderen von der Frauenklinik Hannover zur Verfügung gestellt.

Um einen Aufschluss der Zellen zu erreichen, wurde eine Lyse durchgeführt. Der dafür angefertigte Puffer bestand aus Boehringer Lysepuffer und den Inhibitoren

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Leupeptin, AEBSF (4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid), Pepstatin und Phosphatase-Inhibitoren (Phosphatase Inhibitor Cocktail 2). Anschließend konnten die Proben mit 4x SDS-Probenpuffer verdünnt und für 5 min auf 95°C erhitzt werden, um eine vollständige Denaturierung der Proteine zu erreichen. Nach einer 10 sekündigen Zentrifugation bei 400 g wurden die Proben auf das Gel aufgetragen.

Die Elektrophorese im SDS-Laufpuffer erfolgte bis zum Einlaufen der Proben in das Trenngel bei 100 V. Danach wurde die Spannung auf 150 V erhöht und bei Erreichen des Gelendes nach etwa einer Stunde gestoppt.

3.8.2 Western blot

Nach der Gelelektrophorese erfolgte die Übertragung der Proteine auf eine Nitrocellulosemembran (Sigma-Aldrich, Steinheim) mit einer Porengröße von 0,45 µm durch einen Western blot. Hierzu fand anfangs eine 10 minütige Äquilibrierung des Gels und der Membran in Blotpuffer statt. Anschließend folgte der Aufbau des Blots. Es wurden zwei Whatmanpapiere luftblasenfrei auf die Kathode aufgebracht, gefolgt von dem Gel, der Nitrocellulosemembran und zwei weiteren Whatmanpapieren. Als zusätzliche Schicht auf jeder Seite kam ein Fiberpad zum Einsatz. Unter Berücksichtigung der Polung wurde der Aufbau fest in die Mini-Transblot-Zelle eingesetzt und die Kühlung auf Raumtempertur durch ein Kühlaggregat im Behälter gewährleistet. Die Blotdauer betrug eine Stunde bei 100 V.

Auf den Blot folgte das Blockieren der Membran in 5 % Magermilch, gelöst in TBS-T (Tris-buffered Saline-Tween) für 45 min bei Raumtemperatur. Zur Immundetektion wurde nun der primäre Antikörper hinzugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert.

Nach dreimaligem Waschen für jeweils 10 min mit TBS-T erfolgte eine einstündige Inkubation mit dem Sekundärantikörper bei Raumtemperatur. Als Sekundärantikörper fand ein Meerretichperoxidase (HRP) gekoppelter Antikörper Anwendung. Nach dreimaligem Waschen für jeweils 10 min mit TBS-T und einmaligem Waschen für 10 min mit TBS wurde das Zweikomponentensubstrat (Thermo Fisher Scientific) für 3 min über die Membran gegeben. Die an den

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Zweitantikörper gekoppelte HRP katalysierte die Umsetzung von Luminol im Substrat in seine oxidierte Form, bei der eine Chemilumineszenz sichtbar wird, die detektiert werden kann.

Die Detektion erfolgte mittels eines Chemilumineszenz-Imagingsystem (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Deutschland).

3.8.3 Ladungskontrolle zur semi-quantitativen Auswertung der Proteinmenge

Für die Kontrolle des korrekten Ablaufs und zur semi-quantitativen Auswertung des Western blots erfolgte eine Redetektion der Nitrocellulosemembran mit einem Antikörper, der sich gegen β-Aktin richtet. Als Bestandteil des Zytoskeletts gehört β-Aktin zu den sogenannten Housekeeping-Proteinen und kommt in allen Zellen vor (MASSICOTTE et al. 2006).

Die Nitrocellulosemembran wurde zunächst nach der Detektion des IGF1R-Antikörpers in TBS-T gewaschen. Für die Entfernung der gebundenen Antikörper, fand eine Inkubation der Membran in Strippingpuffer mit einem pH von 2,2 für 30 min statt. Nach erneutem Waschen in TBS wurden die freien Bindungsstellen für eine Stunde mit 5%iger Magermilchlösung blockiert, bevor es zur Inkubation des β-Aktin-Antikörpers (sc47778, mouse anti- β-actin, Santa cruz biotechnology, CA, USA) für eine Stunde bei Raumtemperatur kam. Die Behandlung mit dem Sekundärantikörper fand wie zuvor für eine Stunde bei Raumtemperatur statt. Nach drei Waschschritten in TBS-T wurde das Chemilumineszenzsubstrat aufgetragen und die Membran mit Hilfe des Imagingsystems untersucht.

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3.8.4 Antikörper zum Nachweis des IGF1R im Rind

Im Zuge einer Masterthese (POPPICHT 2010) wurde der Nachweis des IGF1R via Western blot mittels unterschiedlicher kommerziell erhältlicher Antikörper getestet.

Es konnte festgestellt werden, dass der Anti-IGF1-Rezeptor-Antikörper (Fa. Thermo Fisher Scientific, MA, USA) zur Detektion eines schwachen Signals in einem Pool von 100 Embryonen führte, das allerdings nicht zu einer quantitativen Auswertung geeignet war (Abb. 13, orange Markierung). Aus diesem Grund wurde für die vorliegende Arbeit ein Peptidantikörper von der Firma Seqlab (Göttingen, Germany) im Kaninchen produziert, der speziell auf die Peptidsequenz der α-Untereinheit des bovinen IGF1R abgestimmt ist (anti-popp IGF1R). Der Peptidantikörper setzte sich aus zwei Peptidsequenzen zusammen, die eine Länge von 16 bzw. 19 Aminosäuren vorweisen und keine Kreuzreaktionen zu anderen Sequenzen zeigen (Abb. 13, rote Markierungen).

Zusätzlich zu diesem Antikörper erfolgte die Austestung von drei weiteren kommerziell erhältlichen Antikörpern beim Rind. Der erste Antikörper richtet sich gegen die α-Untereinheit des IGF1R (IGF1Rα, Abb. 13 grüne Markierung), während der zweite (IGF1Rβ, schwarze Markierung) und dritte Antikörper (Anti-IGF1R antibody, blaue Markierung) spezifisch für die β-Untereinheit sind. Die Antikörper wurden zunächst in bovinem Gewebe (Leber und Plazenta) getestet, bevor sie zum Einsatz mit bovinen Embryonen kamen.

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Abbildung 13: Peptidsequenz des IGF1R mit gekennzeichneten Positionen der getesteten Antikörper; hellgrau: α-Untereinheit (Aminosäure 1-710), weiß: β-Untereinheit (Aminosäure 711-1367), dunkelgrau: Transmembrandomäne (Aminosäure 906-929)

Getestete Antikörper aus der Masterarbeit (POPPICHT 2010) Anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen, Germany)

IGF1Rα (Santa cruz biotechnology, CA, USA) IGF1Rβ (Santa cruz biotechnology, CA, USA)

Anti-IGF1R antibody (AVIVA systems biology, CA, USA)

62 3.9 Immunfluoreszenzfärbung des IGF1R

Für die Darstellung des IGF1R-Proteins in Embryonen wurde eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt. Dafür kam als primärer Antikörper der spezifisch produzierte Kaninchen-Antikörper der Firma Seqlab zum Einsatz (s. 3.8.4).

Der eingesetzte Zweitantikörper war an das Fluorochrom Alexa Fluor 488 gekoppelt und richtete sich spezifisch gegen Kaninchen-Antikörper (goat anti-rabbit IgG-CFL 488, sc-362262, Santa cruz biotechnology, CA, USA).

Die Immunfluoreszenzfärbung setzte sich aus vier Schritten zusammen:

1. Vorbehandlung der Embryonen 2. Inkubation des 1. Antikörpers 3. Inkubation des 2. Antikörpers

4. Darstellung und Auswertung der Färbung

Mit Ausnahme der Blockierung und Inkubation des Erstantikörpers (4°C) und dem RNase-Verdau (37°C) fanden alle Schritte bei Raumtemperatur statt. Für die unterschiedlichen Inkubations- und Waschschritte fanden Petrischalen (60 mm, Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) Verwendung. Das Umsetzen der Embryonen fand mit Hilfe eines Strippers® (Gynemed GmbH, Lensahn) mit flexibler Pipettenspitze mit einem Durchmesser von 200 µm statt. Eine Negativkontrolle wurde bei jedem Färbedurchgang mitgeführt, die weder im Erst-, noch im Zweitantikörper inkubierte, um eine Eigenfluoreszenz oder unspezifische Fluoreszenz der Embryonen auszuschließen. Außerdem wurde eine zweite Kontrolle eingesetzt, bei der es nur zur Inkubation mit dem sekundären Antikörper kam, um unspezifische Bindungen nachzuweisen.

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3.9.1 Vorbehandlung der Embryonen und Inkubation mit dem 1. Antikörper

Die Embryonen wurden je nach zu untersuchendem Stadium am 2. bis 8. Tagen der Kultivierung entnommen und dreimal in 100 µl PVP (Polyvinylpyrrolidon) in PBS (1 mg/ml) in einer Petrischale gewaschen. Die Untersuchung von 2-Zellern erfolgte an Tag 2, 4-Zeller an Tag 3 und 8-Zeller an Tag 4 der Kultivierung. Embryonen im 16-Zellstadium wurden an Tag fünf und Morulae an Tag sechs analysiert. An Tag sieben und acht kam es zur Entnahme von Blastozysten und expandierten Blastozysten.

Die Färbung begann mit einem Fixierungsschritt der Embryonen in 500 µl 4 % Paraformaldehyd in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur. Es folgte ein erneutes dreimaliges Waschen in PVP/PBS. Zur Permeabilisierung kam es zur Inkubation der Embryonen für eine Stunde in 500 µl 0,1 % Triton-X 100 in PBS.

Nachdem sie erneut dreimal in PVP/PBS gewaschen wurden, folgte ein Blockierungsschritt, in dem unspezifische Bindungsstellen mit 500 µl 3 % BSA in PBS für eine Stunde blockiert wurden. Jetzt konnte mit dem 1. Antikörper inkubiert werden. Dafür kamen 500 µl des spezifisch produzierten anti-popp IGF1R in einer Verdünnung von 1:100 in 3 % BSA/PBS über Nacht bei 4°C in einer Feuchtekammer zum Einsatz, um eine mögliche Verdunstung zu verhindern.

3.9.2 Inkubation mit dem 2. Antikörper, Zellkernfärbung und Darstellung der Färbung

Nach Ende der Inkubation mit dem 1. Antikörper wurden die Embryonen dreimal in 3 % BSA/PBS gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Im Anschluss erfolgte die Verdünnung des sekundären Antikörpers 1:200 in 3 % BSA und Inkubation in 500 µl für 2 Stunden im Dunkeln. Nach dem Waschen in BSA/PBS kam es zum RNase-Verdau für eine Stunde im Dunkeln bei 37°C in 50 µl einer 50 µg/ml RNase A-Lösung. Die Zellkernfärbung fand mittels 100 µl Propidiumiodid in einer Konzentration von 25 µg/ml für 5 min im Dunkeln statt. Nach Entfernen des PI

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durch dreimaliges Waschen in PVP/PBS wurden die Embryonen auf einen Objektträger gebracht und mit 4-5 µl Vectashield überschichtet. Die Darstellung der Immunfluoreszenzfärbung erfolgte direkt im Anschluss an die Färbung bei 10-facher Vergrößerung mit einem Blau-Filter bzw. Grün-Filter (Olympus, Hamburg) an einem Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus, Hamburg, Deutschland). Die Auswertung fand mit der Aufnahme- und Auswertesoftware CellSens Dimension (Olympus, Hamburg, Deutschland) statt. Zunächst wurde für jeden Embryo ein Bild zur Darstellung der Zellkerne und ein Bild zur Darstellung der Immunfluoreszenz mit Hilfe einer am Mikroskop integrierten Kamera aufgenommen. Zusätzlich konnte für jeden Embryo eine Aufnahme der Immunfluoreszenz in Graustufen erstellt werden, um an dieser die Verteilung der Graustufenintensitäten zu messen (TOLIVIA et al. 2006).

Dazu wurde die Fläche umfahren, die von den Blastomeren eingenommen wurde und die Intensität aller Graustufen dieser Fläche erfasst. Von diesem Wert konnte die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz abgezogen werden, die sich durch Umfahren einer kreisrunden Fläche am Rand ergab, die in etwa der Größe des Embryos entsprach. Der so korrigierte Wert wurde daraufhin für den Vergleich der Fluoreszenzintensitäten in unterschiedlichen Entwicklungsstadien verwendet. Eine beispielhafte Auswertung eines Graustufenbildes ist in Abbildung 14 dargestellt.

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Abbildung 14: Repräsentative Darstellung einer beispielhaften Auswertung der relativen Signalstärke der IGF1R-Fluoreszenz einer expandierten Blastozyste

3.10 Statistische Auswertungen

Für die statistischen Auswertungen wurde die Software SigmaStat 3.5 genutzt (Fa.

Systat Software GmbH). Dabei wurde zunächst auf die Normalverteilung der Werte mit Hilfe eines Kolmogorov-Smirnov-Tests geprüft. Anschließend fand für alle Untersuchungen eine einseitige Varianzanalyse (One-way ANOVA) mit anschließendem Tukey-Test statt. Unterschiede von P ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Unterschiede mit P ≤ 0,07 galten als Tendenz.

66 3.11 Allgemeiner Versuchsaufbau

3.11.1 Einfluss der Supplementation unterschiedlicher IGF-1 Konzentrationen

In der nachfolgenden Grafik sind die Abläufe der Versuche zur Supplementation von IGF1 während der Oozytenreifung schematisch dargestellt.

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3.11.2 Vergleichende Untersuchung der Expression des IGF1R

Das nachfolgende Schema stellt die Einzelheiten zum Versuchsaufbau für die vergleichende Untersuchung der Expression des Insulin-like growth factor 1 – Rezeptors auf mRNA- und Proteinebene dar.

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4. Ergebnisse

4.1 Ermittlung der Teilungs- und Entwicklungsraten

Während der Zeit von Februar 2011 bis einschließlich Juni 2012 wurden im Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Embryonen in vitro produziert. In 60 Durchgängen wurden insgesamt 4800 Kumulus-Oozyten-Komplexe gewonnen und in der IVP eingesetzt (Tab. 11). Mit einer durchschnittlichen Teilungsrate von 57,4 ± 1,8 % und einer Entwicklungsrate von 27,6 ± 1,7 % an Tag acht entstanden insgesamt 1325 Embryonen, die in Gruppen von bis zu 10 Embryonen bei -80°C für die Western blot – Analysen gelagert wurden.

Tabelle 11: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Teilungs- und Entwicklungsraten der IVP-Versuche zur Gewinnung expandierter Blastozysten für die Western blot - IVP-Versuche

Anzahl [n]

Raten [%]

(MW ± SD)

KOK in der IVC 4800

Teilung 2755 57,4 ± 7,3

Entwicklung Tag 8 1325 27,6 ± 8,1

Durch den Ortswechsel der Arbeitsgruppe an die Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere der Justus-Liebig-Universität Gießen im Jahr 2012, kam es, bedingt durch den Umbau von Laborräumen, zu einer Unterbrechung der Versuche. Im April 2013 begann die routinemäßige Produktion von Embryonen in vitro in den neuen Räumlichkeiten, sodass ab August 2013 die Versuche wieder aufgenommen wurden. In insgesamt 61 Durchgängen wurden 8072 KOK gewonnen, in vitro gereift, befruchtet und kultiviert. Insgesamt teilten sich in der Kontrollgruppe 953 der vermeintlichen Zygoten, was einer durchschnittlichen Teilungsrate von 60,6 ± 8,1 % entsprach. Bis zu Tag sieben entwickelten sich

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durchschnittlich 22,1 ± 6,4 % der Embryonen zum Stadium der Morula oder Blastozyste. An Tag acht der IVC stieg die durchschnittliche Entwicklungsrate auf 24,1 ± 8,5 % an. Die Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen der unterschiedlichen Versuchsgruppen sind in Tabelle 12 dargestellt.

Tabelle 12: Anzahl eingesetzter Kumulus-Oozyten-Komplexe, sowie Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen in den einzelnen Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung

Zwischen Embryonen der einzelnen Versuchsgruppen konnten statistisch signifikante Unterschiede in den Teilungsraten beobachtet werden (P ≤ 0,05). So zeigte sich, dass die Supplementation des Medium mit IGF1 (1000 ng/ml) und Apoptoseinduzierern die Teilungsrate signifikant im Vergleich zu Embryonen der Kontroll- und DMSO-Gruppe reduziert.

Beim Vergleich der Entwicklungsraten an Tag sieben und acht der Kultivierung konnten ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen Embryonen einiger Gruppen

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nachgewiesen werden (Abb. 15). An Tag sieben erreichten Embryonen der Kontrollgruppe eine signifikant höhere Entwicklungsrate als die der IGF1-Supplementationsgruppen IGF 100 + Apoptoseinduzierer, IGF 1000 und IGF 1000 + Apoptoseinduzierer. Zudem konnten signifikant mehr Morulae und Blastozysten in der DMSO- und der IGF 100 – Gruppe als in der IGF 1000 + Apoptoseinduzierer beobachtet werden. An Tag acht der Kultivierung konnten bei Embryonen der Kontrollgruppe erneut signifikant höhere Entwicklungsraten erzielt werden als bei denen der IGF1-supplementierten Gruppen mit Apoptoseinduzierern. Außerdem wurde eine tendenziell reduzierte Anzahl an Morulae und Blastozysten in der Gruppe IGF 1000 + Apoptoseinduzierer im Vergleich zur Gruppe mit DMSO oder IGF 100-Supplementation gefunden (P ≤ 0,07).

Abbildung 15: Darstellung der prozentualen Entwicklungsraten der einzelnen Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung an Tag sieben und Tag acht (MW + SD); a:b P ≤ 0,05

a ab*

ab ab*

b ab

b**

a ac

ab ac

ab ac

Im Dokument Bedeutung des Insulin-like growth factor-Systems während der Oozytenreifung und präimplantorischen Embryonalentwicklung des Rindes (Seite 58-0)