Ermittlung der Teilungs- und Entwicklungsraten

4. Ergebnisse

4.1 Ermittlung der Teilungs- und Entwicklungsraten

Während der Zeit von Februar 2011 bis einschließlich Juni 2012 wurden im Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Embryonen in vitro produziert. In 60 Durchgängen wurden insgesamt 4800 Kumulus-Oozyten-Komplexe gewonnen und in der IVP eingesetzt (Tab. 11). Mit einer durchschnittlichen Teilungsrate von 57,4 ± 1,8 % und einer Entwicklungsrate von 27,6 ± 1,7 % an Tag acht entstanden insgesamt 1325 Embryonen, die in Gruppen von bis zu 10 Embryonen bei -80°C für die Western blot – Analysen gelagert wurden.

Tabelle 11: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Teilungs- und Entwicklungsraten der IVP-Versuche zur Gewinnung expandierter Blastozysten für die Western blot - IVP-Versuche

Anzahl [n]

Raten [%]

(MW ± SD)

KOK in der IVC 4800

Teilung 2755 57,4 ± 7,3

Entwicklung Tag 8 1325 27,6 ± 8,1

Durch den Ortswechsel der Arbeitsgruppe an die Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere der Justus-Liebig-Universität Gießen im Jahr 2012, kam es, bedingt durch den Umbau von Laborräumen, zu einer Unterbrechung der Versuche. Im April 2013 begann die routinemäßige Produktion von Embryonen in vitro in den neuen Räumlichkeiten, sodass ab August 2013 die Versuche wieder aufgenommen wurden. In insgesamt 61 Durchgängen wurden 8072 KOK gewonnen, in vitro gereift, befruchtet und kultiviert. Insgesamt teilten sich in der Kontrollgruppe 953 der vermeintlichen Zygoten, was einer durchschnittlichen Teilungsrate von 60,6 ± 8,1 % entsprach. Bis zu Tag sieben entwickelten sich

durchschnittlich 22,1 ± 6,4 % der Embryonen zum Stadium der Morula oder Blastozyste. An Tag acht der IVC stieg die durchschnittliche Entwicklungsrate auf 24,1 ± 8,5 % an. Die Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen der unterschiedlichen Versuchsgruppen sind in Tabelle 12 dargestellt.

Tabelle 12: Anzahl eingesetzter Kumulus-Oozyten-Komplexe, sowie Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen in den einzelnen Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung

Zwischen Embryonen der einzelnen Versuchsgruppen konnten statistisch signifikante Unterschiede in den Teilungsraten beobachtet werden (P ≤ 0,05). So zeigte sich, dass die Supplementation des Medium mit IGF1 (1000 ng/ml) und Apoptoseinduzierern die Teilungsrate signifikant im Vergleich zu Embryonen der Kontroll- und DMSO-Gruppe reduziert.

Beim Vergleich der Entwicklungsraten an Tag sieben und acht der Kultivierung konnten ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen Embryonen einiger Gruppen

nachgewiesen werden (Abb. 15). An Tag sieben erreichten Embryonen der Kontrollgruppe eine signifikant höhere Entwicklungsrate als die der IGF1-Supplementationsgruppen IGF 100 + Apoptoseinduzierer, IGF 1000 und IGF 1000 + Apoptoseinduzierer. Zudem konnten signifikant mehr Morulae und Blastozysten in der DMSO- und der IGF 100 – Gruppe als in der IGF 1000 + Apoptoseinduzierer beobachtet werden. An Tag acht der Kultivierung konnten bei Embryonen der Kontrollgruppe erneut signifikant höhere Entwicklungsraten erzielt werden als bei denen der IGF1-supplementierten Gruppen mit Apoptoseinduzierern. Außerdem wurde eine tendenziell reduzierte Anzahl an Morulae und Blastozysten in der Gruppe IGF 1000 + Apoptoseinduzierer im Vergleich zur Gruppe mit DMSO oder IGF 100-Supplementation gefunden (P ≤ 0,07).

Abbildung 15: Darstellung der prozentualen Entwicklungsraten der einzelnen Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung an Tag sieben und Tag acht (MW + SD); a:b P ≤ 0,05

a ab*

ab ab*

b ab

b**

a ac

ab ac

bc bc

71 4.2 Bestimmung der Kernreifungsraten

Nach 24-stündiger Reifung der Kumulus-Oozyten-Komplexe in Maturationsmedium mit unterschiedlichen Zusätzen wurde die Kernreifungsrate bestimmt. Zunächst fand eine mikroskopische Untersuchung des Cumulus oophorus statt. Dabei unterschieden sich die einzelnen Versuchsgruppen optisch in der Kumulusexpansion, wie in Abbildung 16 deutlich zu erkennen ist. KOK der Kontrollgruppe, sowie der Supplementationsgruppen mit IGF in einer Konzentration von 100 ng/ml und 1000 ng/ml wiesen eine deutliche Expansion des Kumulus oophorus auf. Dagegen bewirkte der Zusatz von DMSO eine Reduktion der Kumulus-Expansion (Abb. 16, B). Bei der Maturation mit Apoptoseinduzierern konnte demgegenüber nur eine geringgradige bis keine Expansion identifiziert werden (Abb. 16, C, E, G).

Abbildung 16: Repräsentative Illustration der Kumuluszellexpansion in den unterschiedlichen Versuchsgruppen nach 24-stündiger Maturation; A: Kontrolle, B: DMSO; C: Apoptoseinduzierer; D: IGF 100, E: I+A 100, F: IGF 1000, G: I+A 1000

A B C

G F

E D

Im Anschluss an die Kumulusentfernung wurde aus durchschnittlich acht IVM-Durchgängen die Maturationsrate von Oozyten der Kontroll- und der einzelnen Versuchsgruppen mit einer Hoechst 33342-Färbung bestimmt. Es konnten unterschiedliche Reifungsgrade registriert werden. Die zu erwartenden Stadien sind beispielhaft in Abbildung 17 dargestellt.

Abbildung 17: Repräsentative Darstellung der nukleären Stadien boviner Oozyten während der Reifung mit Hilfe einer Hoechst 33342-Färbung; A: Prophase I, B: Telophase I, C: Metaphase II

Die Auszählung der Metaphase II-Oozyten nach Färbung mit Hoechst 33342 ergab für die Oozyten der Kontrollgruppe eine durchschnittliche Maturationsrate von 83,5 ± 6,9 %. Beim Vergleich der Maturationsraten von Oozyten aus der Kontrollgruppe mit Oozyten aus den unterschiedlichen Supplementationsgruppen kam es zu einer signifikanten Verringerung der nukleären Maturation in den Versuchsgruppen, denen Apoptoseinduzierer hinzugefügt wurden (Tab. 13). IGF1 in einer Konzentration von 1000 ng/ml als Zusatz in der Reifung verursachte ebenfalls eine signifikante Abnahme der Maturationsrate im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Supplementation mit DMSO bewirkte eine tendenzielle Reduzierung der Anzahl reifer Eizellen (P ≤ 0,07). Hingegen konnte kein Einfluss eines IGF1-Zusatzes von 100 ng/ml zum Maturationsmedium beobachtet werden.

A B C

Tabelle 13: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Maturationsraten von Oozyten der unterschiedlichen Versuchsgruppen

KOK in der IVC (n)

Maturationsrate [%]

(MW ± SD)

Kontrolle 242 83,5 ± 6,9 ^a*

DMSO 168 72,1 ± 5,4 ^ab**

Apoptoseind. 182 68,5 ± 8,3 ^b IGF 100 199 75,1 ± 7,1 ^ab IGF 100 + Apop. 190 69,5 ± 7,3 ^b IGF 1000 186 70,2 ± 6,0 ^b IGF 1000 + Apop. 191 70,9 ± 10,9 ^b a:b P ≤ 0,05; *:** P ≤ 0,07

4.3 Untersuchung der IGF1-Konzentrationen im Medium

Die IGF1-Konzentration im Maturationsmedium der unterschiedlichen Versuchsgruppen wurde sowohl vor als auch nach 24-stündiger Inkubation in mindestens drei Wiederholungen gemessen. Für die Untersuchung kamen insgesamt vier verschiedene kommerzielle Kits zum Einsatz, die auf zwei Methoden beruhten, ELISA und IRMA.

Der erste ELISA, der Firma DRG Instruments GmbH erzielte als Messergebnis Werte zwischen 0,7 und 25,0 ng/ml vor der Maturation und 54,8 und 367,4 ng/ml nach der Maturation. Dabei konnte ein Anstieg der IGF1-Konzentration in allen Proben nach 24-stündiger Maturation gezeigt werden. Dieser Test erzielte als einziger Werte für IGF1 in den Kontrollgruppen, denen kein IGF1 hinzugeführt wurde.

Der zweite ELISA (IBL International GmbH) erreichte Messwerte zwischen 837,8 und 1295,3 ng/ml vor Beginn der Maturation für die IGF1-supplementierten Gruppen.

Nach 24-stündiger Maturation wurden Konzentrationen zwischen 761,2 und 1416,0 ng/ml gemessen. Die Werte für die Kontroll-, die DMSO- und die Apoptoseinduzierer-Gruppe lagen hierbei unterhalb der Nachweisgrenze des Tests.

Für einige Gruppen konnte ein Anstieg in der IGF1-Konzentration verzeichnet werden, während andere einen Abfall der Konzentration zeigten. Die erwarteten Messwerte von 100 ng/ml bzw. 1000 ng/ml in den Gruppen, denen diese Konzentration hinzugefügt wurde, konnten anhand des Tests nicht bestätigt werden.

Des Weiteren wurde ein IRMA der Firma DRG Instruments GmbH ausgetestet, der allerdings nicht zu einer Auswertung der Messung führte, da die Werte der Standardkurve nicht linear ausfielen.

Mit Hilfe des zweiten IRMA (Beckman Coulter) konnten allerdings Werte erzielt werden, die zu Beginn der Maturation zwischen 18,8 und 30,0 ng/ml in den Gruppen mit IGF1-Zusatz lagen. Nach der Maturation wurden Konzentrationen zwischen 14,6 und 22,3 ng/ml gemessen. Bis auf eine Ausnahme konnte ein Abfall in der IGF1-Konzentration durch die Maturation über 24 Stunden beobachtet werden. Die Werte für die Kontroll-, DMSO- und Apoptoseinduzierer-Gruppe lagen auch hier unterhalb der Nachweisgrenze.

Eine Übersicht aller Ergebnisse ist in Tabelle 14 dargestellt.

Tabelle 14: Vergleich der Messergebisse der IGF1-Konzentration im Medium mit Hilfe unterschiedlicher Methoden vor und nach 24-stündiger Oozytenmaturation

IGF1-Konzentration [ng/ml]

76 4.4 Resultate der Lebend-Tot-Färbung

Die Zellzahlfärbung mit Ethidium homodimer und Hoechst 33342 von expandierten Blastozysten an Tag sieben der Kultivierung (Abb. 18) ergab für Embryonen der Kontrollgruppe eine mittlere Gesamtzellzahl von 134,9 ± 18,6 Zellen pro Blastozyste.

Dabei lag die Anzahl toter Zellen bei durchschnittlich 7,4 ± 2,4 Zellen pro Blastozyste.

Daraus ergab sich für die Lebend-Tot-Zellratio ein Mittelwert von 19,1 ± 6,8.

Abbildung 18: Repräsentative Abbildung der Lebend-Tot-Färbung mit Höchst 33342 und Ethidium homodimer; Blau: Lebende Zellen; Rot: Tote Zellen

Beim Vergleich expandierter Blastozysten hinsichtlich ihrer Gesamtzellzahl konnte eine statistisch signifikante Reduzierung in Blastozysten aus der Maturation mit IGF1 in einer Konzentration von 1000 ng/ml mit Apoptoseinduzierern im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet werden (Tab. 15). Die Untersuchung der Anzahl toter Zellen in expandierten Blastozysten der einzelnen Supplementationsgruppen ergab keine signifikanten Unterschiede.

Tabelle 15: Gesamtzellzahlen, Anzahl toter Zellen und Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben

Gesamtzellzahl (MW ± SD)

Tote Zellen (MW ± SD)

Kontrolle (n=16) 134,9 ± 18,6 ^a 7,4 ± 2,4 DMSO (n=10) 116,8 ± 19,0 ^ab 10,0 ± 4,4 Apoptoseind. (n=11) 132,8 ± 21,4 ^ab 11,3 ± 4,9 IGF 100 (n=8) 111,1 ± 21,9 ^ab 11,8 ± 5,6 IGF 100 + Apop. (n=8) 112,0 ± 9,4 ^ab 8,1 ± 2,4 IGF 1000 (n=8) 134,4 ± 27,0 ^ab 9,6 ± 7,8 IGF 1000 + Apop. (n=11) 110,7 ± 20,3 ^b 10,6 ± 5,1 a:b P ≤ 0,05

Aus der Berechnung der Lebend-Tot-Ratio ging hervor, dass der höchste Wert in der Kontrollgruppe erzielt wurde (Abb. 19). Demnach wiesen Blastozysten aus der Kontrollgruppe die wenigsten toten Zellen im Verhältnis zur Gesamtzellzahl auf.

Sowohl der Zusatz von IGF1 (100 ng/ml), als auch IGF1 (1000 ng/ml) zusammen mit Apoptoseinduzierern, führte zu einer signifikanten Reduzierung der Lebend-Tot-Ratio. Weiterhin bewirkte die Supplementation mit DMSO und die mit Apoptoseinduzierern allein eine signifikant geringere Lebend-Tot-Ratio.

Abbildung 19: Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen (MW + SD); a:b P ≤ 0,05

b b ab

n=16 n=10 n=11 n=8 n=8 n=8 n=11

4.5 Resultate der Färbung apoptotischer Zellen

Bei der Untersuchung von Apoptose in mindestens sechs expandierten Blastozysten pro Supplementationsgruppe wurden mit Hilfe einer TUNEL-Analyse durchschnittliche Gesamtzellzahlen zwischen 127,0 und 143,4 Zellen pro Blastozyste erzielt. In der Kontrollgruppe waren davon durchschnittlich 2,1 ± 1,1 % der Zellen TUNEL-positiv (Abb. 20, A). Eine Positivkontrolle, bei der Blastozysten mit DNase behandelt wurden, um DNA-Brüche hervorzurufen, lief standardmäßig bei jeder Färbung mit, um die Spezifität des Tests zu garantieren (Abb. 20, B).

Abbildung 20: Repräsentative Darstellung expandierter Blastozysten nach TUNEL- und Zellkernfärbung; A: Blastozyste der Kontrollgruppe; B: Positivkontrolle einer DNase-behandelten Blastozyste; Blau: Lebende Zellen; Grün: TUNEL-positive Zelle

Das Verhältnis des prozentualen Anteils TUNEL-positiver zu –negativer Zellen ist in Abbildung 21 dargestellt. Es zeigte sich, dass in Embryonen der Gruppe, in der Apoptoseinduzierer allein dem Maturationsmedium zugesetzt wurde, statistisch signifikant mehr TUNEL-positive Zellen pro Blastozyste vorkamen als in Embryonen der Kontrollgruppe (Tab. 16). Es konnte kein signifikanter Unterschied im prozentualen Anteil TUNEL-positiver Zellen zwischen Embryonen der anderen Supplementationsgruppen und der Kontrollgruppe gefunden werden. Außerdem war die Anzahl TUNEL-positiver Zellen in Embryonen der Gruppen, denen IGF1 zugesetzt wurde, im Vergleich zu denen der Gruppen, deren Maturationsmedien neben IGF1 auch Apoptoseinduzierer enthielten, ähnlich.

A B

Abbildung 21: Darstellung des prozentualen Anteils TUNEL-positiver und -negativer Zellen in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen

Tabelle 16: Prozentuale Verteilung TUNEL-negativer und -positiver Zellen expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben

TUNEL-negative [%]

(MW ± SD)

TUNEL-positive [%]

(MW ± SD)

Kontrolle (n=14)

97,9 ± 1,1 2,1 ± 1,1 ^a DMSO (n=8)

96,8 ± 1,0 3,2 ± 1,0 ^ab Apoptoseind. (n=9)

95,5 ± 2,1 4,5 ± 2,1 ^b IGF 100 (n=10)

96,3 ± 1,6 3,7 ± 1,8 ^ab IGF 100 + Apop. (n=6)

95,7 ± 2,1 4,3 ± 2,1 ^ab IGF 1000 (n=9)

96,0 ± 1,7 4,0 ± 1,7 ^ab IGF 1000 + Apop. (n=7)

96,5 ± 1,9 3,6 ± 1,9 ^ab a:b P ≤ 0,05

n=14 n=8 n=9 n=10 n=6 n=9 n=7

b b

b b b b

4.6 Nachweis entwicklungsrelevanter Gentranskripte

4.6.1 MessengerRNA-Expression ausgewählter Gene nach IVM mit verschiedenen Zusätzen

Für die Untersuchung der Expression ausgewählter Gentranskripte wurde eine RT-qPCR mit mindestens zwei Wiederholungen durchgeführt. Dabei konnten für das anti-apoptotische Gen BCL2L1 statistisch signifikante Unterschiede in der Expression zwischen Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen nachgewiesen werden. Bei Betrachtung der relativen Transkriptmenge von BCL2L1 wird deutlich, dass das anti-apoptotische Gen in Embryonen aus der Maturation mit IGF1 (1000 ng/ml) und Apoptoseinduzierern im Vergleich zu Embryonen aus allen anderen Supplementationsgruppen signifikant häufiger vorkommt (Abb. 22).

Abbildung 22: Relative Transkriptmenge von BCL2L1 in expandierten Blastozysten der verschiedenen Supplementationsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05

Für Transkripte des IGF-Systems (IGF1R, IGFBP2, IGFBP4), des Glukosestoffwechsels (SLC2A1, SLC2A3) und für das pro-apoptotische Transkript BAX wurden keine signifikanten Einflüsse der verschiedenen Zusätze während der IVM in expandierten Blastozysten detektiert (Abb. 23 und 24).

n=4 n=3 n=4 n=2 n=5 n=3 n=2

Abbildung 23: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGF1R, IGFBP3 und BAX in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM)

Abbildung 24: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGFBP2, SLC2A1 und SLC2A3 in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM)

4.6.2 Stadienspezifische mRNA-Expression des IGF1R

Bei der Untersuchung der mRNA-Expression des IGF1R mit mindestens zwei Wiederholungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der frühen Embryonalentwicklung konnte eine stadienspezifische Expression detektiert werden (Abb. 25). Zu Beginn der Furchungsteilungen, während des 2-Zellstadiums, wurde die größte relative Anzahl an IGF1R-Transkripten gemessen (62,9 ± 24,3). Daraufhin folgte ein Abfall der Transkriptmenge mit einem Minimum im 8-Zellstadium (4,1 ± 2,1). Vom 16-Zeller bis zur expandierten Blastozyste konnte ein kontinuierlicher Anstieg der relativen Menge an IGF1R-Transkripten erkannt werden. Dabei wurden signifikante Unterschiede zwischen der mRNA-Expression des IGF1R im 2-Zellstadium und der im 8-Zellstadium entdekt. Des Weiteren wurden signifikant niedrigere Transkriptmengen des IGF1R im 16-Zeller und dem Stadium der Morula im Vergleich zum 2-Zellstadium gezeigt.

Abbildung 25: Darstellung der relativen Transkriptmenge des IGF1R im Verlauf der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05

b b

n=3 n=2 n=3 n=3 n=5 n=5 n=3

1 2 3 4

44 kDa 125 kDa

4.7 Nachweis der Proteinexpression des IGF1R 4.7.1 Proteinnachweis mittels Western blot

In insgesamt 24 Western blot-Analysen mit vier verschiedenen Antikörpern wurden zum Nachweis des IGF1-Rezeptorproteins 440 Embryonen im Stadium der geschlüpften Blastozyste eingesetzt.

Der spezifische Peptidantikörper anti-popp IGF1R wurde zunächst an Proteinextrakten von bovinem Gewebe getestet. Hierfür wurden Proben aus boviner Leber, Karunkel und Kotyledone verwendet, die nachweislich den IGF1R enthielten (BAUER et al. 1998, FOWDEN 2003). Nach der Lyse der Gewebeproben wurden die Proteinkonzentrationen mittels BCA-Assay bestimmt, sodass eine Menge von 20 µg eingesetzt werden konnte. Als zum wiederholten Mal ein Signal mit korrekter Molekülmasse aufgezeigt wurde, folgte die Durchführung eines Western blots mit bovinen Embryonen (Abb. 26).

Abbildung 26: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des Peptidantikörpers anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin, 1: 50 Embryonen, 2-4:

Positivkontrollen (bovine Leber, Karunkel, Kotyledone)

In insgesamt acht Wiederholungen konnte kein Signal des IGF1R in einer Gruppe von 50 bovinen Blastozysten beobachtet werden. Auch durch das Heraufsetzen der Anzahl an Embryonen auf 100 pro Versuch konnte der IGF1-Rezeptor nicht nachgewiesen werden.

44 kDa 100 kDa

1 2 3 4

Aus diesem Grund wurden drei weitere kommerziell erhältliche Antikörper zum Nachweis des IGF1R im Western blot getestet.

Zunächst erfolgte die Austestung des IGF-1Rα-Antikörpers (santa cruz biotechnology, CA, USA) in bovinen Gewebeproben aus Leber und Plazenta, sowie in humaner Plazenta. Im Western blot wurde durch diesen Antikörper ein schwaches Signal in 20 µg Proteinextrakten detektiert (Abb. 27). Allerdings konnte dieses Signal durch Variationen in den Protein- und/oder Antikörperkonzentrationen nicht verstärkt werden. Eine semi-quantitativen Auswertung des IGF1R-Proteins in insgesamt drei Durchgängen erfolgte deshalb nicht.

Abbildung 27: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rα (santa cruz biotechnology, CA, USA);

Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin; 1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta

Daraufhin kam ein weiterer Antikörper der Firma santa cruz biotechnology zum Einsatz (IGF-1Rβ Antikörper). Dieser Antikörper wurde ebenfalls eingangs in 20 µg Proteinextrakten aus boviner Leber und Plazenta, sowie in humaner Plazenta untersucht. Nach insgesamt drei Wiederholungen des Western blots konnte nur in der humanen Plazenta ein Signal aufgezeigt werden (Abb. 28). Der Antikörper konnte in bovinen Gewebeproben das Protein des IGF1R nicht nachweisen und wurde daher nicht für den Nachweis in bovinen Embryonen eingesetzt.

1 2 3 4

44 kDa 200 kDa

Abbildung 28: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rβ (santa cruz biotechnology, CA, USA);

Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin; 1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta

Als dritter Antikörper kam der Anti-IGF1 Antikörper der Firma AVIVA systems biotechnology (CA, USA) zum Einsatz, der ebenfalls in Proteinextrakten aus Gewebeproben ausgetestet wurde. Nach dreimaligem Wiederholen des Western blots mit Anpassung der Protein- und/oder Antikörperkonzentrationen konnte kein Signal in den Positivkontrollen detektiert werden. Der Antikörper führte nicht zu einem Nachweis des IGF1R in Gewebeproben und wurde daher nicht zum Nachweis in bovinen Embryonen herangezogen.

Zusammenfassend konnte mit Hilfe des speziell produzierten Peptidantikörpers anti-popp IGF1R der Firma Seqlab eine qualitative Aussage über das Vorhandensein des IGF1R in bovinen Embryonen getroffen werden. Allerdings konnte weder dieser Antikörper, noch einer der kommerziell erhältlichen zur Quantifizierung des IGF1-Rezeptorproteins eingesetzt werden.

A B C

E D

G F

4.7.2 Proteinnachweis mittels Immunfluoreszenzfärbung

Zur Bestimmung der Lokalisation des IGF1R und für die semi-quantitative Auswertung der Graustufenintensitäten in insgesamt 61 bovinen Embryonen unterschiedler Stadien wurde der spezifische Peptidantikörper anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen) verwendet. Lokalisiert wurde der IGF1R hauptsächlich in der Plasmamembran der einzelnen Blastomeren, sowie im Zytoplasma (Abb. 29).

Abbildung 29: Repräsentative Darstellung der Proteinexpression des IGF1R im 2- (A), 4- (B), 8- (C), 16-Zellstadium (D), Stadium der Morula (E), der Blastozyste (F) und der expandierten Blastozyste (G); Rot: Zellkernfärbung mit Propidiumiodid, Grün:

spezifische Antikörperfärbung mit Hilfe des anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen)

Bei der Messung der Graustufenintensitäten konnte eine stadienspezifische Expression des IGF1R beobachtet werden (Abb. 30). Dabei wurde die größte Graustufenintensität im 2-Zellstadium gemessen (1007,8 ± 123,8), woraufhin es zu einem signifikanten Abfall der Signalstärke bis zum 16-Zellstadium kam (417,6 ± 54,3). Das stärkste Fluoreszenzsignal konnte im Stadium der Blastozyste detektiert werden (1319,6 ± 116,3). Es wurde eine signifikant größere Proteinexpression des IGF1R im 2- und 4-Zeller im Vergleich zum 16-Zeller nachgewiesen. Weiterhin kam es zur Detektion eines signifikant höheren IGF1R-Fluoreszenzsignals in Blastozysten und expandierten Blastozysten im Unterschied zum 16-Zellstadium.

Abbildung 30: Darstellung der mittleren Graustufenintensitäten im Verlauf der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b:c P ≤ 0,05

ac ac

bc b

a a

n=8 n=9 n=8 n=8 n=9 n=9 n=10

89 F

4.8 Vergleich der stadienspezifischen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R

Beim Vergleich der mRNA-Expression des IGF1R mit dessen Proteinexpression konnten Übereinstimmungen in der stadienspezifischen Verteilung der Signalstärken herausgefunden werden (Abb. 31). Die jeweils stärkste Expression konnte zu Beginn der Entwicklung im 2- und 4-Zellstadium detektiert werden. Während die relative Anzahl an IGF1R-Transkripten die geringste Intensität im 8-Zellstadium aufwies, zeigte die Proteinexpression ein Minimum im 16-Zellstadium. Bei beiden Untersuchungen konnte daraufhin ein Anstieg der Expression bis zum Stadium der Blastozyste gezeigt werden.

Abbildung 31: Vergleich der relativen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R während der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM), die Proteinexpression wurde für Darstellungszwecke um ein Zehnfaches verringert

5. Diskussion

In den letzten Jahren konnte in der Reproduktionsmedizin eine deutliche Weiterentwicklung biotechnologischer Methoden beobachtet werden, die zu einer gesteigerten Produktion qualitativ hochwertiger Embryonen, vor allem bei der Spezies Rind, geführt hat. Dennoch unterscheiden sich in vitro produzierte Embryonen von ihren in vivo generierten Gegenstücken in vielerlei Hinsicht. So wurden Unterschiede in der Morphologie und im Genexpressionsmuster, sowie in der Einfrierbarkeit und der resultierenden Trächtigkeitsrate nachgewiesen (GREVE et al.

1987, WRENZYCKI et al. 1998). Es fanden bereits zahlreiche Versuche statt, die Qualität der in vitro produzierten Embryonen zu verbessern. Zum einen wurde versucht, die Auswahl der KOK nach morphologischen Kriterien zu standardisieren, da die Entwicklungskompetenz der Oozyte nachweislich die weitere Entwicklung des Embryos bestimmt (LONERGAN et al. 2003). Zum anderen wurde durch die Optimierung des Kultivierungsmediums mit unterschiedlichen Zusätzen versucht, die Qualität der resultierenden Embryonen zu erhöhen (WRENZYCKI et al. 1999, NATALE et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2001, RIZOS et al. 2002, LONERGAN et al.

2003).

Auch in der Grundlagenforschung findet die IVP boviner Embryonen häufig Anwendung. Dabei werden oft bestimmte Mechanismen nachgestellt, um spezifische Funktionen und Wirkungsweisen von Einflussfaktoren zu untersuchen. So wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der IVP die Funktion des Wachstumsfaktors IGF1 während der Eizellreifung und frühen Embryonalentwicklung untersucht. Im Detail wurde die Aufgabe von IGF1 in Bezug auf das Auftreten von Apoptose in bovinen Embryonen dargestellt. Weiterhin erfolgte die Untersuchung des Einflusses einer supraphysiologischen Konzentration IGF1. Außerdem wurde untersucht, ob es zu einer Verbesserung der Qualität boviner Embryonen durch den Zusatz einer physiologischen Konzentration IGF1 während der Eizellreifung kommt. Die Qualität der Oozyten und der sich entwickelnden Embryonen wurde mit morphologischen Methoden, wie der Bestimmung der Maturations-, Teilungs- und Entwicklungsrate, aber auch der Auszählung der Gesamtzellzahl und der Anzahl apoptotischer Zellen ermittelt. Des Weiteren erfolgten Untersuchungen auf molekularer Ebene, wie die

Analyse des Expressionsmusters entwicklungsrelevanter Gentranskripte und das des IGF1R-Proteins. Überdies fand eine vergleichende Analyse des Expressionsmusters des Insulin-like growth factor 1-Rezeptors auf mRNA- und Proteinebene während der frühen bovinen Embryonalentwicklung statt.

5.1 Einfluss einer IGF1-Supplementation auf die morphologische Qualität boviner Embryonen

Die in dieser Arbeit erzielten Maturationsraten in Oozyten der Kontrollgruppe von 83,5 ± 2,3 % lagen im Durchschnitt der für die In-vitro-Maturation zu erwarteten Werte von 80 bis 90 % (GALLI et al. 2003). Der Zusatz von IGF1 in einer Konzentration von 100 ng/ml führte nicht zu einer Beeinflussung der Maturationsrate und entspricht bisherigen Untersuchungen, die zu dem gleichen Ergebnis führten (RIEGER et al. 1998, MEIYU et al. 2014). Da reduzierte IGF1-Werte im Blut allerdings nachweislich zu einer Verzögerung der Ovulation in vivo führen (WATHES

Im Dokument Bedeutung des Insulin-like growth factor-Systems während der Oozytenreifung und präimplantorischen Embryonalentwicklung des Rindes (Seite 76-0)