Untersuchung der IGF1-Konzentrationen im Medium

4. Ergebnisse

4.3 Untersuchung der IGF1-Konzentrationen im Medium

Die IGF1-Konzentration im Maturationsmedium der unterschiedlichen Versuchsgruppen wurde sowohl vor als auch nach 24-stündiger Inkubation in mindestens drei Wiederholungen gemessen. Für die Untersuchung kamen insgesamt vier verschiedene kommerzielle Kits zum Einsatz, die auf zwei Methoden beruhten, ELISA und IRMA.

Der erste ELISA, der Firma DRG Instruments GmbH erzielte als Messergebnis Werte zwischen 0,7 und 25,0 ng/ml vor der Maturation und 54,8 und 367,4 ng/ml nach der Maturation. Dabei konnte ein Anstieg der IGF1-Konzentration in allen Proben nach 24-stündiger Maturation gezeigt werden. Dieser Test erzielte als einziger Werte für IGF1 in den Kontrollgruppen, denen kein IGF1 hinzugeführt wurde.

Der zweite ELISA (IBL International GmbH) erreichte Messwerte zwischen 837,8 und 1295,3 ng/ml vor Beginn der Maturation für die IGF1-supplementierten Gruppen.

Nach 24-stündiger Maturation wurden Konzentrationen zwischen 761,2 und 1416,0 ng/ml gemessen. Die Werte für die Kontroll-, die DMSO- und die Apoptoseinduzierer-Gruppe lagen hierbei unterhalb der Nachweisgrenze des Tests.

Für einige Gruppen konnte ein Anstieg in der IGF1-Konzentration verzeichnet werden, während andere einen Abfall der Konzentration zeigten. Die erwarteten Messwerte von 100 ng/ml bzw. 1000 ng/ml in den Gruppen, denen diese Konzentration hinzugefügt wurde, konnten anhand des Tests nicht bestätigt werden.

Des Weiteren wurde ein IRMA der Firma DRG Instruments GmbH ausgetestet, der allerdings nicht zu einer Auswertung der Messung führte, da die Werte der Standardkurve nicht linear ausfielen.

Mit Hilfe des zweiten IRMA (Beckman Coulter) konnten allerdings Werte erzielt werden, die zu Beginn der Maturation zwischen 18,8 und 30,0 ng/ml in den Gruppen mit IGF1-Zusatz lagen. Nach der Maturation wurden Konzentrationen zwischen 14,6 und 22,3 ng/ml gemessen. Bis auf eine Ausnahme konnte ein Abfall in der IGF1-Konzentration durch die Maturation über 24 Stunden beobachtet werden. Die Werte für die Kontroll-, DMSO- und Apoptoseinduzierer-Gruppe lagen auch hier unterhalb der Nachweisgrenze.

Eine Übersicht aller Ergebnisse ist in Tabelle 14 dargestellt.

Tabelle 14: Vergleich der Messergebisse der IGF1-Konzentration im Medium mit Hilfe unterschiedlicher Methoden vor und nach 24-stündiger Oozytenmaturation

IGF1-Konzentration [ng/ml]

76 4.4 Resultate der Lebend-Tot-Färbung

Die Zellzahlfärbung mit Ethidium homodimer und Hoechst 33342 von expandierten Blastozysten an Tag sieben der Kultivierung (Abb. 18) ergab für Embryonen der Kontrollgruppe eine mittlere Gesamtzellzahl von 134,9 ± 18,6 Zellen pro Blastozyste.

Dabei lag die Anzahl toter Zellen bei durchschnittlich 7,4 ± 2,4 Zellen pro Blastozyste.

Daraus ergab sich für die Lebend-Tot-Zellratio ein Mittelwert von 19,1 ± 6,8.

Abbildung 18: Repräsentative Abbildung der Lebend-Tot-Färbung mit Höchst 33342 und Ethidium homodimer; Blau: Lebende Zellen; Rot: Tote Zellen

Beim Vergleich expandierter Blastozysten hinsichtlich ihrer Gesamtzellzahl konnte eine statistisch signifikante Reduzierung in Blastozysten aus der Maturation mit IGF1 in einer Konzentration von 1000 ng/ml mit Apoptoseinduzierern im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet werden (Tab. 15). Die Untersuchung der Anzahl toter Zellen in expandierten Blastozysten der einzelnen Supplementationsgruppen ergab keine signifikanten Unterschiede.

Tabelle 15: Gesamtzellzahlen, Anzahl toter Zellen und Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben

Gesamtzellzahl (MW ± SD)

Tote Zellen (MW ± SD)

Kontrolle (n=16) 134,9 ± 18,6 ^a 7,4 ± 2,4 DMSO (n=10) 116,8 ± 19,0 ^ab 10,0 ± 4,4 Apoptoseind. (n=11) 132,8 ± 21,4 ^ab 11,3 ± 4,9 IGF 100 (n=8) 111,1 ± 21,9 ^ab 11,8 ± 5,6 IGF 100 + Apop. (n=8) 112,0 ± 9,4 ^ab 8,1 ± 2,4 IGF 1000 (n=8) 134,4 ± 27,0 ^ab 9,6 ± 7,8 IGF 1000 + Apop. (n=11) 110,7 ± 20,3 ^b 10,6 ± 5,1 a:b P ≤ 0,05

Aus der Berechnung der Lebend-Tot-Ratio ging hervor, dass der höchste Wert in der Kontrollgruppe erzielt wurde (Abb. 19). Demnach wiesen Blastozysten aus der Kontrollgruppe die wenigsten toten Zellen im Verhältnis zur Gesamtzellzahl auf.

Sowohl der Zusatz von IGF1 (100 ng/ml), als auch IGF1 (1000 ng/ml) zusammen mit Apoptoseinduzierern, führte zu einer signifikanten Reduzierung der Lebend-Tot-Ratio. Weiterhin bewirkte die Supplementation mit DMSO und die mit Apoptoseinduzierern allein eine signifikant geringere Lebend-Tot-Ratio.

Abbildung 19: Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen (MW + SD); a:b P ≤ 0,05

b b ab

n=16 n=10 n=11 n=8 n=8 n=8 n=11

4.5 Resultate der Färbung apoptotischer Zellen

Bei der Untersuchung von Apoptose in mindestens sechs expandierten Blastozysten pro Supplementationsgruppe wurden mit Hilfe einer TUNEL-Analyse durchschnittliche Gesamtzellzahlen zwischen 127,0 und 143,4 Zellen pro Blastozyste erzielt. In der Kontrollgruppe waren davon durchschnittlich 2,1 ± 1,1 % der Zellen TUNEL-positiv (Abb. 20, A). Eine Positivkontrolle, bei der Blastozysten mit DNase behandelt wurden, um DNA-Brüche hervorzurufen, lief standardmäßig bei jeder Färbung mit, um die Spezifität des Tests zu garantieren (Abb. 20, B).

Abbildung 20: Repräsentative Darstellung expandierter Blastozysten nach TUNEL- und Zellkernfärbung; A: Blastozyste der Kontrollgruppe; B: Positivkontrolle einer DNase-behandelten Blastozyste; Blau: Lebende Zellen; Grün: TUNEL-positive Zelle

Das Verhältnis des prozentualen Anteils TUNEL-positiver zu –negativer Zellen ist in Abbildung 21 dargestellt. Es zeigte sich, dass in Embryonen der Gruppe, in der Apoptoseinduzierer allein dem Maturationsmedium zugesetzt wurde, statistisch signifikant mehr TUNEL-positive Zellen pro Blastozyste vorkamen als in Embryonen der Kontrollgruppe (Tab. 16). Es konnte kein signifikanter Unterschied im prozentualen Anteil TUNEL-positiver Zellen zwischen Embryonen der anderen Supplementationsgruppen und der Kontrollgruppe gefunden werden. Außerdem war die Anzahl TUNEL-positiver Zellen in Embryonen der Gruppen, denen IGF1 zugesetzt wurde, im Vergleich zu denen der Gruppen, deren Maturationsmedien neben IGF1 auch Apoptoseinduzierer enthielten, ähnlich.

A B

Abbildung 21: Darstellung des prozentualen Anteils TUNEL-positiver und -negativer Zellen in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen

Tabelle 16: Prozentuale Verteilung TUNEL-negativer und -positiver Zellen expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben

TUNEL-negative [%]

(MW ± SD)

TUNEL-positive [%]

(MW ± SD)

Kontrolle (n=14)

97,9 ± 1,1 2,1 ± 1,1 ^a DMSO (n=8)

96,8 ± 1,0 3,2 ± 1,0 ^ab Apoptoseind. (n=9)

95,5 ± 2,1 4,5 ± 2,1 ^b IGF 100 (n=10)

96,3 ± 1,6 3,7 ± 1,8 ^ab IGF 100 + Apop. (n=6)

95,7 ± 2,1 4,3 ± 2,1 ^ab IGF 1000 (n=9)

96,0 ± 1,7 4,0 ± 1,7 ^ab IGF 1000 + Apop. (n=7)

96,5 ± 1,9 3,6 ± 1,9 ^ab a:b P ≤ 0,05

n=14 n=8 n=9 n=10 n=6 n=9 n=7

b b

b b b b

4.6 Nachweis entwicklungsrelevanter Gentranskripte

4.6.1 MessengerRNA-Expression ausgewählter Gene nach IVM mit verschiedenen Zusätzen

Für die Untersuchung der Expression ausgewählter Gentranskripte wurde eine RT-qPCR mit mindestens zwei Wiederholungen durchgeführt. Dabei konnten für das anti-apoptotische Gen BCL2L1 statistisch signifikante Unterschiede in der Expression zwischen Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen nachgewiesen werden. Bei Betrachtung der relativen Transkriptmenge von BCL2L1 wird deutlich, dass das anti-apoptotische Gen in Embryonen aus der Maturation mit IGF1 (1000 ng/ml) und Apoptoseinduzierern im Vergleich zu Embryonen aus allen anderen Supplementationsgruppen signifikant häufiger vorkommt (Abb. 22).

Abbildung 22: Relative Transkriptmenge von BCL2L1 in expandierten Blastozysten der verschiedenen Supplementationsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05

Für Transkripte des IGF-Systems (IGF1R, IGFBP2, IGFBP4), des Glukosestoffwechsels (SLC2A1, SLC2A3) und für das pro-apoptotische Transkript BAX wurden keine signifikanten Einflüsse der verschiedenen Zusätze während der IVM in expandierten Blastozysten detektiert (Abb. 23 und 24).

n=4 n=3 n=4 n=2 n=5 n=3 n=2

Abbildung 23: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGF1R, IGFBP3 und BAX in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM)

Abbildung 24: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGFBP2, SLC2A1 und SLC2A3 in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM)

4.6.2 Stadienspezifische mRNA-Expression des IGF1R

Bei der Untersuchung der mRNA-Expression des IGF1R mit mindestens zwei Wiederholungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der frühen Embryonalentwicklung konnte eine stadienspezifische Expression detektiert werden (Abb. 25). Zu Beginn der Furchungsteilungen, während des 2-Zellstadiums, wurde die größte relative Anzahl an IGF1R-Transkripten gemessen (62,9 ± 24,3). Daraufhin folgte ein Abfall der Transkriptmenge mit einem Minimum im 8-Zellstadium (4,1 ± 2,1). Vom 16-Zeller bis zur expandierten Blastozyste konnte ein kontinuierlicher Anstieg der relativen Menge an IGF1R-Transkripten erkannt werden. Dabei wurden signifikante Unterschiede zwischen der mRNA-Expression des IGF1R im 2-Zellstadium und der im 8-Zellstadium entdekt. Des Weiteren wurden signifikant niedrigere Transkriptmengen des IGF1R im 16-Zeller und dem Stadium der Morula im Vergleich zum 2-Zellstadium gezeigt.

Abbildung 25: Darstellung der relativen Transkriptmenge des IGF1R im Verlauf der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05

b b

n=3 n=2 n=3 n=3 n=5 n=5 n=3

1 2 3 4

44 kDa 125 kDa

4.7 Nachweis der Proteinexpression des IGF1R 4.7.1 Proteinnachweis mittels Western blot

In insgesamt 24 Western blot-Analysen mit vier verschiedenen Antikörpern wurden zum Nachweis des IGF1-Rezeptorproteins 440 Embryonen im Stadium der geschlüpften Blastozyste eingesetzt.

Der spezifische Peptidantikörper anti-popp IGF1R wurde zunächst an Proteinextrakten von bovinem Gewebe getestet. Hierfür wurden Proben aus boviner Leber, Karunkel und Kotyledone verwendet, die nachweislich den IGF1R enthielten (BAUER et al. 1998, FOWDEN 2003). Nach der Lyse der Gewebeproben wurden die Proteinkonzentrationen mittels BCA-Assay bestimmt, sodass eine Menge von 20 µg eingesetzt werden konnte. Als zum wiederholten Mal ein Signal mit korrekter Molekülmasse aufgezeigt wurde, folgte die Durchführung eines Western blots mit bovinen Embryonen (Abb. 26).

Abbildung 26: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des Peptidantikörpers anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin, 1: 50 Embryonen, 2-4:

Positivkontrollen (bovine Leber, Karunkel, Kotyledone)

In insgesamt acht Wiederholungen konnte kein Signal des IGF1R in einer Gruppe von 50 bovinen Blastozysten beobachtet werden. Auch durch das Heraufsetzen der Anzahl an Embryonen auf 100 pro Versuch konnte der IGF1-Rezeptor nicht nachgewiesen werden.

44 kDa 100 kDa

1 2 3 4

Aus diesem Grund wurden drei weitere kommerziell erhältliche Antikörper zum Nachweis des IGF1R im Western blot getestet.

Zunächst erfolgte die Austestung des IGF-1Rα-Antikörpers (santa cruz biotechnology, CA, USA) in bovinen Gewebeproben aus Leber und Plazenta, sowie in humaner Plazenta. Im Western blot wurde durch diesen Antikörper ein schwaches Signal in 20 µg Proteinextrakten detektiert (Abb. 27). Allerdings konnte dieses Signal durch Variationen in den Protein- und/oder Antikörperkonzentrationen nicht verstärkt werden. Eine semi-quantitativen Auswertung des IGF1R-Proteins in insgesamt drei Durchgängen erfolgte deshalb nicht.

Abbildung 27: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rα (santa cruz biotechnology, CA, USA);

Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin; 1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta

Daraufhin kam ein weiterer Antikörper der Firma santa cruz biotechnology zum Einsatz (IGF-1Rβ Antikörper). Dieser Antikörper wurde ebenfalls eingangs in 20 µg Proteinextrakten aus boviner Leber und Plazenta, sowie in humaner Plazenta untersucht. Nach insgesamt drei Wiederholungen des Western blots konnte nur in der humanen Plazenta ein Signal aufgezeigt werden (Abb. 28). Der Antikörper konnte in bovinen Gewebeproben das Protein des IGF1R nicht nachweisen und wurde daher nicht für den Nachweis in bovinen Embryonen eingesetzt.

1 2 3 4

44 kDa 200 kDa

Abbildung 28: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rβ (santa cruz biotechnology, CA, USA);

Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin; 1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta

Als dritter Antikörper kam der Anti-IGF1 Antikörper der Firma AVIVA systems biotechnology (CA, USA) zum Einsatz, der ebenfalls in Proteinextrakten aus Gewebeproben ausgetestet wurde. Nach dreimaligem Wiederholen des Western blots mit Anpassung der Protein- und/oder Antikörperkonzentrationen konnte kein Signal in den Positivkontrollen detektiert werden. Der Antikörper führte nicht zu einem Nachweis des IGF1R in Gewebeproben und wurde daher nicht zum Nachweis in bovinen Embryonen herangezogen.

Zusammenfassend konnte mit Hilfe des speziell produzierten Peptidantikörpers anti-popp IGF1R der Firma Seqlab eine qualitative Aussage über das Vorhandensein des IGF1R in bovinen Embryonen getroffen werden. Allerdings konnte weder dieser Antikörper, noch einer der kommerziell erhältlichen zur Quantifizierung des IGF1-Rezeptorproteins eingesetzt werden.

A B C

E D

G F

4.7.2 Proteinnachweis mittels Immunfluoreszenzfärbung

Zur Bestimmung der Lokalisation des IGF1R und für die semi-quantitative Auswertung der Graustufenintensitäten in insgesamt 61 bovinen Embryonen unterschiedler Stadien wurde der spezifische Peptidantikörper anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen) verwendet. Lokalisiert wurde der IGF1R hauptsächlich in der Plasmamembran der einzelnen Blastomeren, sowie im Zytoplasma (Abb. 29).

Abbildung 29: Repräsentative Darstellung der Proteinexpression des IGF1R im 2- (A), 4- (B), 8- (C), 16-Zellstadium (D), Stadium der Morula (E), der Blastozyste (F) und der expandierten Blastozyste (G); Rot: Zellkernfärbung mit Propidiumiodid, Grün:

spezifische Antikörperfärbung mit Hilfe des anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen)

Bei der Messung der Graustufenintensitäten konnte eine stadienspezifische Expression des IGF1R beobachtet werden (Abb. 30). Dabei wurde die größte Graustufenintensität im 2-Zellstadium gemessen (1007,8 ± 123,8), woraufhin es zu einem signifikanten Abfall der Signalstärke bis zum 16-Zellstadium kam (417,6 ± 54,3). Das stärkste Fluoreszenzsignal konnte im Stadium der Blastozyste detektiert werden (1319,6 ± 116,3). Es wurde eine signifikant größere Proteinexpression des IGF1R im 2- und 4-Zeller im Vergleich zum 16-Zeller nachgewiesen. Weiterhin kam es zur Detektion eines signifikant höheren IGF1R-Fluoreszenzsignals in Blastozysten und expandierten Blastozysten im Unterschied zum 16-Zellstadium.

Abbildung 30: Darstellung der mittleren Graustufenintensitäten im Verlauf der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b:c P ≤ 0,05

ac ac

bc b

a a

n=8 n=9 n=8 n=8 n=9 n=9 n=10

89 F

4.8 Vergleich der stadienspezifischen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R

Beim Vergleich der mRNA-Expression des IGF1R mit dessen Proteinexpression konnten Übereinstimmungen in der stadienspezifischen Verteilung der Signalstärken herausgefunden werden (Abb. 31). Die jeweils stärkste Expression konnte zu Beginn der Entwicklung im 2- und 4-Zellstadium detektiert werden. Während die relative Anzahl an IGF1R-Transkripten die geringste Intensität im 8-Zellstadium aufwies, zeigte die Proteinexpression ein Minimum im 16-Zellstadium. Bei beiden Untersuchungen konnte daraufhin ein Anstieg der Expression bis zum Stadium der Blastozyste gezeigt werden.

Abbildung 31: Vergleich der relativen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R während der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM), die Proteinexpression wurde für Darstellungszwecke um ein Zehnfaches verringert

5. Diskussion

In den letzten Jahren konnte in der Reproduktionsmedizin eine deutliche Weiterentwicklung biotechnologischer Methoden beobachtet werden, die zu einer gesteigerten Produktion qualitativ hochwertiger Embryonen, vor allem bei der Spezies Rind, geführt hat. Dennoch unterscheiden sich in vitro produzierte Embryonen von ihren in vivo generierten Gegenstücken in vielerlei Hinsicht. So wurden Unterschiede in der Morphologie und im Genexpressionsmuster, sowie in der Einfrierbarkeit und der resultierenden Trächtigkeitsrate nachgewiesen (GREVE et al.

1987, WRENZYCKI et al. 1998). Es fanden bereits zahlreiche Versuche statt, die Qualität der in vitro produzierten Embryonen zu verbessern. Zum einen wurde versucht, die Auswahl der KOK nach morphologischen Kriterien zu standardisieren, da die Entwicklungskompetenz der Oozyte nachweislich die weitere Entwicklung des Embryos bestimmt (LONERGAN et al. 2003). Zum anderen wurde durch die Optimierung des Kultivierungsmediums mit unterschiedlichen Zusätzen versucht, die Qualität der resultierenden Embryonen zu erhöhen (WRENZYCKI et al. 1999, NATALE et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2001, RIZOS et al. 2002, LONERGAN et al.

2003).

Auch in der Grundlagenforschung findet die IVP boviner Embryonen häufig Anwendung. Dabei werden oft bestimmte Mechanismen nachgestellt, um spezifische Funktionen und Wirkungsweisen von Einflussfaktoren zu untersuchen. So wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der IVP die Funktion des Wachstumsfaktors IGF1 während der Eizellreifung und frühen Embryonalentwicklung untersucht. Im Detail wurde die Aufgabe von IGF1 in Bezug auf das Auftreten von Apoptose in bovinen Embryonen dargestellt. Weiterhin erfolgte die Untersuchung des Einflusses einer supraphysiologischen Konzentration IGF1. Außerdem wurde untersucht, ob es zu einer Verbesserung der Qualität boviner Embryonen durch den Zusatz einer physiologischen Konzentration IGF1 während der Eizellreifung kommt. Die Qualität der Oozyten und der sich entwickelnden Embryonen wurde mit morphologischen Methoden, wie der Bestimmung der Maturations-, Teilungs- und Entwicklungsrate, aber auch der Auszählung der Gesamtzellzahl und der Anzahl apoptotischer Zellen ermittelt. Des Weiteren erfolgten Untersuchungen auf molekularer Ebene, wie die

Analyse des Expressionsmusters entwicklungsrelevanter Gentranskripte und das des IGF1R-Proteins. Überdies fand eine vergleichende Analyse des Expressionsmusters des Insulin-like growth factor 1-Rezeptors auf mRNA- und Proteinebene während der frühen bovinen Embryonalentwicklung statt.

5.1 Einfluss einer IGF1-Supplementation auf die morphologische Qualität boviner Embryonen

Die in dieser Arbeit erzielten Maturationsraten in Oozyten der Kontrollgruppe von 83,5 ± 2,3 % lagen im Durchschnitt der für die In-vitro-Maturation zu erwarteten Werte von 80 bis 90 % (GALLI et al. 2003). Der Zusatz von IGF1 in einer Konzentration von 100 ng/ml führte nicht zu einer Beeinflussung der Maturationsrate und entspricht bisherigen Untersuchungen, die zu dem gleichen Ergebnis führten (RIEGER et al. 1998, MEIYU et al. 2014). Da reduzierte IGF1-Werte im Blut allerdings nachweislich zu einer Verzögerung der Ovulation in vivo führen (WATHES et al. 2007), wäre es interessant zu untersuchen, inwiefern in vitro der Zeitpunkt der zweiten Reifeteilung durch die Supplementation des Maturationsmediums mit IGF1 beeinflusst wird. Dies könnte in einer nachfolgenden Arbeit durch Untersuchungen der Maturationsstadien zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgen. Außerdem stehen die Vorgänge während der negativen Energiebilanz in direkter Verbindung zur Fruchtbarkeit. So konnte gezeigt werden, dass eine geringere IGF1-Produktion in der Leber zu einer reduzierten Verfügbarkeit von IGF1 im Blut führt, was wiederum einen Einfluss auf die GnRH-FSH/LH-Achse ausübt. Damit kommt es direkt zu einer Verschlechterung der Eizellqualität durch Beeinflussung der follikulären Umgebung, was indirekt zu einer Verringerung der Fruchtbarkeit des Rindes führt (ZULU et al.

2002, WATHES et al. 2007). Letztlich beeinflusst die follikuläre Umgebung der Eizelle auch nach einer erfolgreichen Befruchtung die Viabilität des resultierenden Embryos und fördert damit die frühe embryonale Mortalität (BROWN et al. 2009).

Ferner kam es in der Gruppe von Eizellen, die 1000 ng/ml IGF1 ausgesetzt waren, zu einer signifikanten Reduzierung der Reifungsrate. Zudem bewirkte die Zugabe

von Apoptoseinduzierern allein, ebenso wie zusammen mit IGF1, eine signifikant geringere Maturationsrate. Diese Ergebnisse in bovinen Oozyten sind bisher die ersten ihrer Art und weisen auf einen negativen Einfluss der Apoptoseinduzierer Actinomycin D und S-(+)-Camptothecin, sowie der supraphysiologischen IGF1-Konzentration auf die nukleäre Maturation boviner Eizellen hin. Weiterhin konnten in Embryonen der Kontrollgruppe durchschnittliche Teilungsraten von 60,6 ± 8,1 % und Entwicklungsraten von 22,1 ± 6,4 % an Tag sieben und 24,1 ± 8,5 % an Tag acht der Kultivierung erzielt werden. Diese Werte liegen im Durchschnitt der zu erwartenden Werte von 20 bis 40 %, die mit dem angewendeten Kultursystem erzielt werden können (RIZOS et al. 2002). Die Supplementation von 100 ng/ml IGF1 führte nicht zu einer Veränderung der Teilungs- und Entwicklungsraten boviner Embryonen und stimmt mit Ergebnissen aus vorherigen Studien überein (RIEGER et al. 1998, MAKAREVICH u. MARKKULA 2002, MEIYU et al. 2014). Jedoch konnte ein negativer Einfluss des IGF1-Zusatzes (1000 ng/ml) zusammen mit Apoptoseinduzierern auf die Teilungs- und Entwicklungsrate beobachtet werden.

Dieses Ergebnis wurde für das Rind erstmals in der vorliegenden Arbeit gezeigt und bestätigt, dass eine Veränderung der Maturationsbedingungen, die Entwicklungskompetenz der Eizelle negativ beeinflussen kann (LONERGAN et al.

2003). Bisherige Untersuchungen dieser Art beim Rind, aber auch bei der Maus, behandelten vorwiegend den Einfluss einer IGF1- und/oder Apoptoseinduzierer-Supplementation während der In-vitro-Kultivierung von Embryonen, wo ebenfalls eine negative Beeinflussung der Teilungs- und Entwicklungsraten nachgewiesen werden konnte (FABIAN et al. 2004, BLOCK et al. 2007).

Als weiterer Parameter zur Untersuchung der Embryonenqualität wurden die Gesamtzellzahl und das Verhältnis von lebenden zu toten Zellen in expandierten Blastozysten bestimmt. In Embryonen der Kontrollgruppe konnte eine durchschnittliche Gesamtzellzahl von 134,9 ± 4,7 Zellen pro Blastozyste erreicht werden. Auch hier lagen die Werte im Bereich derer, die bereits in anderen Arbeiten veröffentlicht wurden (NEDAMBALE et al. 2004). Erneut zeigte sich allein ein Einfluss der Zugabe von 1000 ng/ml IGF1 mit Apoptoseinduzierern. Dieser Zusatz führte zu einer signifikanten Verringerung der Gesamtzellzahl und zu einer

gesteigerten Anzahl toter Zellen pro Blastozyste, was erneut auf die negative Beeinflussung der Entwicklungskompetenz der Eizelle während der Maturation hindeutet und erstmals auf diese Art untersucht wurde.

Die Untersuchung des Auftretens von Apoptose während der frühen Embryonalentwicklung stellt einen weiteren Parameter dar, anhand dessen externe Einflüsse auf in vitro produzierte Embryonen geprüft werden können. Zu diesem Zweck fand die Methode der TUNEL-Analyse Anwendung, die mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes apoptose-spezifische DNA-Brüche in Zellkernen sichtbar macht. Allerdings ist diese Untersuchung nur bedingt spezifisch für Apoptose, da es auch während des Vorgangs der Nekrose zum Zerfall von DNA kommt. Aus diesem Grund wurde darauf geachtet, dass nur solche Zellen als TUNEL-positiv bezeichnet wurden, die eine apoptotische Morphologie aufwiesen. Eine Supplementation des IVM-Mediums mit 100 ng/ml IGF1 führte nicht zu einer Veränderung des Auftretens von Apoptose in Blastozysten. Dieses Ergebnis bestätigt vorherige Arbeiten mit einem vergleichbaren Versuchsaufbau (MAKAREVICH u. MARKKULA 2002).

Allerdings konnten andere Studien zeigen, dass die Anzahl TUNEL-positiver Eizellen und der sie umgebenden Kumuluszellen durch die Hinzugabe von IGF1 deutlich gesenkt wird (KÖLLE et al. 2003, WASIELAK u. BOGACKI 2007). Diese anti-apoptotische Wirkung von IGF1 konnte in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden. Ein Grund dafür könnte sein, dass in diesem Versuchsaufbau ein anderes Kultivierungsmedium verwendet wurde. Nachweislich haben die Medien, in denen die Einzelschritte der IVP stattfinden, einen großen Einfluss auf die Entwicklung und auch das Auftreten von Apoptose (LONERGAN et al. 2003). Die Anzahl TUNEL-positiver Nuclei war dagegen in Blastozysten, resultierend aus Oozyten der IVM-Gruppe mit Apoptoseinduzierern, signifikant erhöht. Dies bestätigt die erwartete Wirkung der Apoptoseinduzierer Actinomycin D und S-(+)-Camptothecin und ist mit Resultaten bisheriger Studien bei der Maus, beim Hamster und beim Rind zu vergleichen (ALEXANDRE et al. 2000, MATWEE et al. 2000, FABIAN et al. 2004).

Gleichzeitig zeigte sich aber kein Einfluss der Apoptoseinduzierer auf die Gesamtzellzahl in Blastozysten, was darauf hindeutet, dass Apoptose in

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