Anti-apototische (B-cell CLL/lymphoma 2 like 1) und pro-apoptotische

2. Literatur

2.3 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen

2.3.4 Anti-apototische (B-cell CLL/lymphoma 2 like 1) und pro-apoptotische

Mitglieder der BCL2-Familie spielen eine entscheidende Rolle in der Regulierung von Apoptose. Hierzu zählen sowohl anti-apoptotische Gene, wie z.B. das B-cell CLL/lymphoma 2 like 1 (BCL2L1), deren Synthese das Auftreten der Apoptose verhindert, als auch pro-apoptotische Gene, wie das BCL2-assoziierte X Protein (BAX), deren Transkription die Apoptose in Zellen fördert.

In Eizellen und embryonalen Entwicklungsstadien konnten BAX-Transkripte bereits nachgewiesen werden, was auf eine besondere Bedeutung der BCL2-Familie während der bovinen Embryonalentwicklung schließen lässt (MELKA et al. 2010). Im Vergleich zu in vivo generierten Embryonen kam es zur Detektion größerer Transkriptmengen für BAX in In-vitro-Embryonen. Diese deuten auf ein häufigeres Vorkommen der Apoptose in IVP-Embryonen hin (RIZOS et al. 2002). Bei der IVP wird die Expression anti- und pro-apoptotischer Gene zusätzlich durch verschiedene

Kultivierungsbedingungen beeinflusst (RIZOS et al. 2002, WARZYCH et al. 2007).

So kam es zu einem gesteigerten Vorkommen von BAX-Transkripten nach Kultivierung der Embryonen in SOF-Medium im Vergleich zu solchen aus einer Kultivierung in TCM (RIZOS et al. 2002). Bei der Untersuchung unterschiedlicher Supplementationen (FBS, PVA oder fatty acid free BSA) während der Kultivierung boviner Embryonen wurde jedoch kein Unterschied in der Expression von BCL2L1- oder BAX-Transkripten gefunden (WARZYCH et al. 2007). Weiterhin konnte bei einer gezielten Induktion von Apoptose mit Staurosporin keine Veränderung der BCL2L1- oder BAX-Transkripte beobachtet werden (VANDAELE et al. 2008). Insgesamt kam es zum Nachweis einer Korrelation zwischen der Qualität und der BAX-Expression, die sich besonders im 4-Zellstadium äußerte (MELKA et al. 2010). Zu diesem Entwicklungszeitpunkt wurden signifikant höhere BAX-Transkriptmengen in Embryonen mit einer schlechteren Morphologie detektiert. Des Weiteren zeigte sich, dass die IGF1-Supplementation keinen Einfluss auf das Vorkommen des anti-apoptotischen Gens BCL2L1 ausübt, aber die Expression des pro-anti-apoptotischen Gens BAX steigert. Dabei bewirkt IGF1 jedoch keine Veränderung des Vorkommens von Apoptose, welches mit einer TUNEL-Analyse untersucht wurde (BLOCK et al.

2011).

32 2.4 Ziele des vorliegenden Projektes

Da die Rolle von IGF1 während der Eizellreifung und frühen Embryonalentwicklung des Rindes kontrovers diskutiert wird (WATSON et al. 1992, YASEEN et al. 2001), soll die vorliegende Arbeit zur Aufklärung des Einflusses von IGF1 beitragen. Dazu soll das Proteinexpressionsmuster und die -lokalisation des IGF1R anhand verschiedener Methoden (Western blot, Immunfluoreszenzfärbung) in bovinen präimplantatorischen Embryonalstadien untersucht und mit dem stadienspezifischen mRNA-Expressionsmuster verglichen werden.

Weiterhin soll der Effekt des Zusatzes einer physiologischen (100 ng/ml) oder supraphysiologischen IGF1-Konzentration (1000 ng/ml) zum In-vitro-Reifungsmedium bei Ab- bzw. Anwesenheit von Apoptoseinduzierern (Actinomycin D und Campothecin) untersucht werden. Dabei wird eine Analyse des Einflusses auf die Gesamtzellzahl, die Lebend-Tot-Ratio und die Anzahl apoptotischer Zellen erfolgen. Außerdem wird mittels ELISA (Enzym-linked Immunosorbent Assay) und IRMA (Immunoradiometrischen Assay) untersucht, inwieweit die hinzugegebene Konzentration IGF1 während der Eizellreifung beeinflusst wird. Die Ergebnisse sollen mit Hilfe von Untersuchungen der mRNA-Expression von spezifischen Gentranskripten des IGF-Systems (IGF1R, IGFBP2, IGFBP4), apoptoserelevanten Transkripten (BAX, BCL2L1) und Transkripten des Glukosestoffwechsels (SLC2A1, SLC2A3) verglichen werden. Damit könnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, ein besseres Verständnis des IGF-Systems und dessen Wirkung auf die Eizellreifung und die frühe Embryonalentwicklung zu erhalten.

3. Material und Methoden

Die verwendeten Chemikalien stammten, sofern nicht anders angegeben, von der Firma Sigma Aldrich (Steinheim, Deutschland). Eine Zusammenfassung der verwendeten Geräte und Medien ist im Anhang zu finden.

3.1 In-vitro-Produktion

Die vitro-Produktion setzt sich aus den drei aufeinanderfolgenden Schritten der In-vitro-Maturation, der In-vitro-Fertilisation und der In-vitro-Kultivierung zusammen.

3.1.1 Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe

Die Kumulus-Oozyten-Komplexe für die IVP boviner Embryonen wurden aus Ovarien frisch geschlachteter Tiere eines nahe gelegenen Schlachthofes gewonnen. Zum einen handelte es sich hierbei um die VION GmbH (Bad Bramstedt, Deutschland) und zum anderen um den Fleischmarkt Olpe (Olpe, Deutschland). Bei der Auswahl der Ovarien wurde darauf geachtet, dass die Tiere weder krank noch trächtig und die Ovarien frei von Zysten waren. Der Transport der abgetrennten Ovarien zum Labor erfolgte in 37°C warmer PBS Complete in einem Thermobehälter (Duwer, KGW Isotherm, Karlsruhe) in einer Zeit von ein bis zwei Stunden. Dort wurden sie dreimal mit je 350 ml einer auf 37°C erwärmten 0,9%igen Natrium-Chlorid-Lösung gewaschen. Mit Hilfe der Slicing-Methode (ECKERT u. NIEMANN 1995) konnten die Kumulus-Oozyten-Komplexe anschließend aus den Follikeln der Ovarien isoliert werden. Die Ovarien wurden dafür in einer Glas-Petrischale (150 mm), in der sich 100 ml 37 °C warmes PBS Complete befand, durch eine Arterienklemme am Mesovarium fixiert und mit einem Schneideblock bestehend aus zehn dicht nebeneinander liegenden Rasierklingen angeschnitten, um die oberflächlichen und tiefer liegenden Follikel zu öffnen und die KOK freizusetzen. Danach wurde die gewonnene Flüssigkeit durch ein Teesieb in ein 500 ml Becherglas überführt, um

größere Gewebeteile aus der Flüssigkeit zu entfernen. Nach einer Sedimentationsdauer von etwa 10 Minuten (min) bei Raumtemperatur wurde der Überstand im Becherglas mit einer Vakuumpumpe (KNF Laboport, Freiburg) bis auf ca. 80 ml abgesaugt und der Bodensatz auf mehrere 15 ml Zentrifugenröhrchen (Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) mit einem Volumen von 15 ml verteilt.

Nach einer erneuten Sedimentationsdauer von etwa 10 min auf einer Wärmeplatte (minitube, Tiefenbach) bei 37°C wurde das Sediment mit einer Pasteurpipette (Carl Roth, Karlsruhe) in eine große Petrischale (60 mm, Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) überführt und mit PBS Complete aufgefüllt. Die Durchsuchung der Petrischale erfolgte unter einem Stereomikroskop (Olympus, Hamburg), integriert in einen beheizten Tisch. Das Heraussammeln und Überführen der gefundenen KOK in TCM air (bei Luftsauerstoff pH-stabiles Tissue Culture Medium) erfolgte mit einer 25 µl Glaskapillare und einem Pipettierhelfer (Brand, Wertheim). Dort verblieben sie, bis die Sedimente aller Zentrifugenröhrchen durchsucht wurden, um sie anschließend gemäß ihrer Qualität zu selektieren (KHURANA u. NIEMANN 2000).

Durch fünf Kategorien (Tab. 3 und Abb. 7) konnten die KOK ihrer Qualität nach eingeteilt werden, wobei für die weitere IVP nur solche verwendet wurden, die in die Kategorien 1, 2 oder 3 einzuordnen waren.

Tabelle 3: Qualitätskategorien der Kumulus-Oozyten-Komplexe Kategorien Beschreibung

1. Kategorie Homogenes, dunkles Ooplasma; kompakter drei- bis vierlagiger Cumulus oophorus (Abb. 7: A)

2. Kategorie Homogenes, dunkles Ooplasma; mindestens eine durchgehende Schicht an Kumuluszellen (Abb. 7: B)

3. Kategorie Homogenes, dunkles oder helles Ooplasma oder abweichend heterogenes Ooplasma; einzelne anhaftende Kumuluszellen (Abb. 7: C) 4. Kategorie Beschaffenheit des Ooplasmas wie in Kategorien 1 bis 3; keine

anhaftenden Kumuluszellen (Abb. 7: D)

5. Kategorie Beschaffenheit des Ooplasmas wie in Kategorien 1 bis 3; deutliche Expandierung des Cumulus oophorus (Abb. 7: E)

Abbildung 7: Kumulus-Oozyten-Komplexe der Qualitätskategorie 1 (A) bis 5 (E)

3.1.2 In-vitro-Maturation

Die IVP-tauglichen KOK wurden nach der Selektion zufällig in Gruppen von 20 Oozyten zusammengeführt und dreimal in unter Siliconöl befindlichen 100 µl-Tropfen TCM + BSA pipettiert, um Zellreste und das TCM air durch Ausverdünnung zu entfernen. Die so gewaschenen KOK konnten nun in das Reifungsmedium überführt werden, das aus TCM + BSA + Suigonan® bestand und ebenfalls mit Siliconöl überschichtet war. Suigonan® ist eine kommerziell erhältliche Lösung, die sowohl 10 IE Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG), als auch 5 IE humanes Choriongonadotropin pro ml enthält.

Für die Supplementationsversuche fand ein ölfreies Kultivierungssystem Verwendung, da einige der eingesetzten Substanzen lipophile Eigenschaften besitzen. Hierzu fanden einzelne Wells einer Mikrotiterplatte (Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) Anwendung, die mit jeweils 200 µl des Reifungsmediums befüllt wurden. Um einer eventuellen Verdunstung des Mediums vorzubeugen, wurden die einzelnen Wells in eine kleine Petrischale (35 mm, Greiner Bio one,

A B C

D E

Kremsmünster, Österreich), in der sich 1 bis 2 ml destilliertes Wasser befanden, gestellt (Abb. 8).

Abbildung 8: Petrischale mit Einzelwells für die ölfreie Maturation boviner Oozyten

Bei den Supplementationsversuchen kam es zu einer zufälligen Aufteilung der KOK in 7 verschiedene Gruppen, mit je 30 Oozyten pro Well. Eine Auflistung der einzelnen Versuchsgruppen ist in Tabelle 4 zu finden. Kumulus-Oozyten-Komplexe, die in Reifungsmedium ohne weitere Zusätze kultiviert wurden, dienten als Kontrollgruppe. Supplementiert wurde sowohl eine physiologische Konzentration (100 ng/ml), als auch eine supraphysiologische Konzentration IGF1 (1000 ng/ml;

recombinant human IGF-I, Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland). Um gezielt den Einfluss von IGF1 auf die Unterbindung von Apoptose zu untersuchen, kam es zur Supplementation einer Kombination zweier Apoptoseinduzierer zum Reifungsmedium. Zum einen handelte es sich hierbei um Actinomycin D, zum anderen um S-(+)-Camptothecin (beides von Enzo Life Sciences, Lörrach, Deutschland), die in einer Konzentration von 0,005 µg/ml bzw. 0,01 µg/ml eingesetzt wurden. Da diese Komponenten in dem Lösungsvermittler DMSO gelöst wurden, erfolgte die Untersuchung einer weiteren, sogenannten Vehikel-Kontrolle, in der dem Reifungsmedium DMSO in der gleichen Konzentration zugesetzt wurde, wie zum Lösen der Apoptoseinduzierer. Mindestens für eine Stunde vor Verwendung fand eine Äqulibrierung des Reifungsmediums im Kulturschrank bei 39°C und 5 % CO2

statt. Die Reifung der KOK erfolgte für 24 Stunden unter einer feuchtigkeitsgesättigten Atmosphäre im CO2-Inkubator (Heracell 150i, Thermo Fisher, Braunschweig) bei 39°C und 5 % CO2. Im Anschluss an die Maturation kam

es zur Vorbereitung der Oozyten für die Fertilisierung. Das Maturationsmedium wurde bis zur Messung der IGF1-Konzentration bei -20°C in sterilen 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen (Eppendorf, Hamburg) gelagert.

Tabelle 4: Übersicht der Versuchsgruppen und ihrer jeweiligen Mediumszusätze während der Maturation boviner Oozyten

Versuchsgruppe Kürzel Zusatz Konzentration

1 Kontrolle K - - IGF1 = Insulin-like growth factor 1

DMSO = Dimethylsulfoxid

3.1.3 In-vitro-Fertilisation

Für die Befruchtung der gereiften Oozyten wurde tiefgefrorenes bzw. aufgetautes Sperma eines im Vorfeld auf seine IVF-Tauglichkeit getesteten Bullen verwendet.

Das Auftauen des Tiefgefrierspermas fand in einem Wasserbad (Memmert, Schwabach) bei 30°C für 30 Sekunden (s) statt. Nach dem Auftauen erfolgte die Beurteilung der Qualität von etwa 5 µl des Spermas unter dem Mikroskop bei

100-facher Vergrößerung nach den Kriterien Motilität und Morphologie. Anschließend wurden die Spermien auf einen 90-prozentigen Gradienten aus Spermfilter® und Fert-TALP-Gebrauchslösung in ein 2 ml Eppendorfgefäß geschichtet und bei 380 g für 16 min in einer Zentrifuge (Mini Spin plus, Eppendorf, Hamburg) zentrifugiert.

Danach wurde der Überstand bis auf etwa 50 µl abgenommen und verworfen. Es folgte ein Resuspendieren des verbliebenen Restes mit 750 µl Fert-TALP-Gebrauchslösung und Zentrifugation für 3 min bei 380 g. Im Anschluss wurde der Überstand bis auf etwa 50 µl abgenommen und verworfen. Durch diese Zentrifugation trennten sich die motilen Spermien von den toten und nicht motilen Spermien (ECKERT u. NIEMANN 1995). Daraufhin kam es zu einer Resuspension des Pellets mit 750 µl Fertilisationsmedium, bestehend aus Heparin, Hypotaurin und Epinephrin (HHE), gelöst in Fert-TALP-Gebrauchslösung, um unter anderem die Kapazitation auszulösen. Nachdem die letzte Zentrifugation für 3 min bei 380 g beendet war, wurde der Überstand bis auf etwa 100 µl abgenommen. Es folgte die Beurteilung der Gesamtmotilität und Kapazitation der verbliebenen Spermien bei 100-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop. Die Bestimmung der Spermiendichte fand mit Hilfe der Auszählung einer 1:50 mit destilliertem Wasser verdünnten Spermiensuspension in einer Thoma-Kammer (Carl Roth, Karlsruhe) statt. Dafür wurden beide Seiten der Thoma-Kammer mit je 10 µl verdünnter Suspension befüllt und je 5 Großquadrate des Sichtfeldes ausgezählt. Unter Berücksichtigung der Verdünnung der Spermiensuspension und des Volumens pro ausgezähltem Großquadrat konnte die einzusetzende Menge berechnet werden, welche dem Fertilisationsmedium zugegeben werden musste, um eine Dichte von einer Million Spermien pro Milliliter Medium zu erhalten [einzusetzende Menge Spermien (µl) = (gezählte Spermien x Verdünnung) / (Anzahl Kästchen x Volumen)].

Die gereiften KOK wurden inzwischen dreimalig durch 100 µl Tropfen Fert-TALP-Gebrauchslösung unter Siliconöl pipettiert und anschließend in 100 µl Fertilisationsmedium unter Siliconöl überführt, das zuvor mindestens eine Stunde im CO2-Inkubator bei 39°C und 5 % CO2 äquilibrierte. Nachdem die Aufbereitung der Spermien abgeschlossen war, wurde die berechnete Menge an Spermien zu den KOK in die Fertilisationstropfen pipettiert. Die Kokultivierung der Spermien und KOK

erfolgte für 19 Stunden im Kulturschrank bei 39°C und 5 % CO2 unter feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre.

3.1.4 In-vitro-Kultivierung

Im Anschluss an die Fertilisation wurden die vermeintlichen Zygoten in eine kleine Petrischale (35 mm, Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich), die 2 ml 37°C warmes TCM air enthielt, überführt. Es folgte die Entfernung der Kumuluszellen, die sogenannte Denudierung unter dem Stereomikroskop (Olympus, Hamburg) durch Verwendung einer Mikropipette mit flexibler Pipettenspitze mit einem Durchmesser von 135 µm (Stripper®, Gynemed GmbH, Lensahn). Dieser Vorgang ist wichtig für die nachfolgende Kultivierung der Zygoten. Da Kumuluszellen ebenfalls einen Stoffwechsel aufweisen, bei dem Nährstoffe verbraucht werden und Stoffwechselendprodukte entstehen, würde die weitere Kultivierung mit den Kumuluszellen zu einer Nährstoffknappheit und gleichzeitiger Anreicherung von schädlichen Stoffwechselendprodukten im Medium führen.

Nach dem Entfernen der Kumuluszellen wurden die vermeintlichen Zygoten durch drei Tropfen TCM air pipettiert und außerdem dreimal in 80 µl Tropfen des Kultivierungsmediums SOFaa unter Siliconöl gewaschen. Anschließend kamen die Embryonen in einer Gruppengröße von sechs in die vorbereiteten 30 µl-Tropfen des Kultivierungsmediums unter Siliconöl und wurden unter feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre im CO2-Inkubator bei 39°C, 5 % O2, 5 % CO2 und 90 % N2 für bis zu 8 Tage kultiviert.

3.2 Beurteilung der Reifung durch Färbung mit Hoechst 33342

Die Beurteilung des Maturationserfolges fand mit Hilfe einer Hoechst 33342 - Färbung, modifiziert nach RACEDO et al. (2008), statt. Dazu wurden die Oozyten nach 22- bis 24-stündiger Reifung zunächst wie unter 3.1.4 beschrieben denudiert und in drei Tropfen einer PVA/PBS-Lösung (0,1 % PVA in PBS) gewaschen. Die Färbung erfolgte in 0,002 % Hoechst 33342 für drei Minuten. Nach einem erneuten Waschschritt in PVA/PBS wurden die Eizellen auf Objektträger (Carl Roth, Karlsruhe) verbracht und mit Vaseline als Abstandshalter mit einem Deckgläschen (Carl Roth, Karlsruhe) versehen. Die Beurteilung der angefärbten Oozyten fand bei 20- bis 40-facher Vergrößerung unter dem Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus, Hamburg, Deutschland) durch Einsatz eines UV-Filters (Olympus, Hamburg) statt.

Als gereift wurden solche Oozyten klassifiziert, die sich im Metaphase-II-Stadium befanden und eine Metaphasenplatte, sowie ein sichtbares, ausgeschleustes Polkörperchen aufwiesen. Eizellen mit einzeln vorliegenden Chromosomen, die sich noch in der Metaphase-I befanden, galten als unreif. Abbildung 9 zeigt eine beispielhafte Darstellung zur Beurteilung der Maturation.

Abbildung 9: Repräsentative Darstellung einer Oozyte im Metaphase-II Stadium angefärbt mit Hoechst 33342;

Polkörper

Metaphasenplatte

3.3 Untersuchung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium

Für die Messung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium wurden insgesamt vier kommerziell erhältliche Kits ausgetestet, deren Antikörper alle gegen den humanen IGF1 gerichtet waren (Tab. 5). Zum einen fand die Methode des ELISA Anwendung, die auf dem „Sandwichprinzip“ basiert, bei der die Bindung des zu untersuchenden Antigens an den spezifischen Antikörper mit einem zweiten Antikörper zu einer enzymatischen Farbreaktion führt. Zum anderen wurde ein IRMA verwendet, bei dem das zu untersuchende Antigen mit einem radioaktiv markierten Antigen um die Bindungsstellen am Antikörper konkurriert.

Tabelle 5: Auflistung der verwendeten Testkits zum Nachweis von IGF1

Testbezeichnung Hersteller Testprinzip Nachweisgrenzen

(ng/ml) Kreuzreaktivität

EIA-4140 DRG

Instruments ELISA 9,75 – 600,0 IGF2 1,02 % Insulin 3,3 %

UK58011 IBL

International ELISA 3,1 – 1137,0 Keine

RIA-4701 DRG

Bei allen Tests wurden die Proben des Maturationsmediums in Eppendorfgefäßen aufgetaut, auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt und zentrifugiert. Alle nachfolgenden Schritte fanden bei Raumtemperatur statt.

Zunächst fand die Austestung des ELISA IGF-I 600 (EIA-4140, DRG Instruments GmbH, Marburg, Deutschland) nach Herstellerangaben im Hormonlabor der Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Justus-Liebig-Universität Gießen statt.

Dafür wurden zu 200 µl der Proben 20 µl 1N HCl zur Probenansäuerung hinzugegeben und für 15 min inkubiert. Anschließend kam es zum Versetzen der Proben mit 20 µl Neutralisierungspuffer. Dieser Schritt diente der pH-Neutralisierung.

Zur Berechnung der Messergebnisse wurde eine vom Hersteller empfohlene Standardreihe mit einem Nullwert und 6 verschiedenen Konzentrationen (5, 10, 50, 150, 300 und 600 ng/ml) angesetzt. Außerdem dienten zwei Proben des Herstellers mit einer Konzentration von 29,5 und 320,3 ng/ml als Kontrollproben. In die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich), die mit einem gegen das IGF1-Protein gerichteten Antikörper beschichtet war, wurden 50 µl der zu untersuchenden Proben, sowie der Standardproben und Kontrollen ein letztes Mal kräftig auf Saugtüchern ausgeklopft, um die Pufferreste gründlich zu entfernen. Mit der Hinzugabe und Inkubation 100 µl eines Enzymkomplexes für eine Stunde kam es zur spezifischen Anlagerung eines Meerrettich-Peroxidase gekoppelten Zweitantikörpers an das gebundene IGF1. Es folgte eine Wiederholung des Waschschrittes. Durch die Zugabe von 200 µl des spezifischen Substrates TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin) wurde ein Farbumschlag ausgelöst, der nach einer Inkubation von 30 min mit 100 µl einer schwefelsäurehaltigen Stopplösung angehalten wurde. Die optische Dichte der Proben, Kontrollen und Standards konnte sofort im Anschluss mit Hilfe eines Dynex MRXe Mikrotiterplatten-Photometers (Magellan Biosciences, VA, USA) gemessen und mit dem Programm Magellan Software (Magellan 3.11, Dortmund, Deutschland) ausgewertet werden. Anhand der Messergebnisse der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve, aus der die Konzentrationen der untersuchten Proben berechnet wurden. Der Messbereich dieses Kits lag zwischen 1,29 und 600 ng/ml mit einem Interassay- bzw. Intraassay-Koeffizienten von 7,22 bzw. 4,72 %.

Ein weiterer ELISA (IGF-1 ELISA, UK58011, IBL International GmbH, Hamburg, Deutschland) wurde im endokrinologischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover unter der Leitung von Juniorprofessorin Dr.

Marion Piechotta durchgeführt. Für die Messung kam es ebenfalls zum Ansatz einer Standardreihe mit den Konzentrationen 0, 16, 32, 107, 357 und 1137 ng/ml. Als Kontrollproben dienten zwei Proben des Herstellers, die auf eine Konzentration von 59,2 – 81,8 ng/ml bzw. 158 – 215 ng/ml eingestellt waren. Im Gegensatz zu dem in Gießen durchgeführten Test fand in Hannover zunächst eine Vorbehandlung der Proben statt. Dafür wurden je 100 µl der Proben mit 100 µl Verdünnungspuffer versetzt, 5 s auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt und für 10 min inkubiert. Die weitere Vorgehensweise dieses ELISA ist mit dem bereits beschriebenen identisch. Die optische Dichte der Proben, Standards und Kontrollen wurde in Hannover mittels Spectra II (Tecan Group, Männedorf, Schweiz) bestimmt und mit dem Programm Magellan Software ausgewertet. Eine Standardreihe konnte erstellt und die Konzentrationen der untersuchten Proben konnten abgelesen werden. Der Messbereich lag zwischen 10 und 450 ng/ml mit einer analytischen Sensitivität von 0,03 ng/ml. Der Intra-Assaykoeffizient betrug 3,5 % und der Inter-Assaykoeffizient 8,5 %. Kreuzreaktionen zu IGF2, Insulin und Proinsulin können aufgrund der hohen Spezifität des Antikörpers ausgeschlossen werden.

Weiterhin kam es zur Austestung eines IRMA in Gießen (IGF-I RIA, RIA-4701, DRG Instruments GmbH, Marburg, Deutschland). Auch hier wurde für die Bestimmung der IGF1-Konzentration zunächst eine Standardreihe angesetzt. Diese bestand aus einem Nullwert und 5 weiteren Konzentrationen (23, 67, 168, 438 und 1200 ng/ml).

Zusätzlich kamen zwei Kontrollproben zum Einsatz, die eine Konzentration an IGF1 von 158 ± 63 ng/ml bzw. 258 ± 77 ng/ml enthielten. Für den Test wurden 50 µl der Proben vorab mit 50 µl einer Pretreatment-Lösung vermischt und für 30 min inkubiert. Anschließend erfolgte die Hinzugabe von 1 ml Verdünnungspuffer. Bei diesem Kit kamen 10 ml Röhrchen zum Einsatz, die mit einem spezifischen anti-IGF1 Antikörper beschichtet waren. Dort hinein wurden sowohl 100 µl der Proben, Kontrollen und Standards pipettiert, als auch 200 µl Tracer-Lösung, die den

125I-markierten Anti-IGF1-Antikörper enthielt. Zwei unbeschichtete Röhrchen wurden

ebenfalls mit der Tracer-Lösung befüllt und dienten der Auswertung der Totalaktivität.

In einer zweistündigen Inkubationszeit auf einem Rüttler bei 400 rpm konnte nun das IGF1 in der Probe mit dem radioaktiv markierten IGF1 um die Bindungsstellen des Antikörpers konkurrieren. Anschließend wurde der Inhalt der Röhrchen dekantiert und mit 2 ml Waschlösung ausgespült. Die Röhrchen zur Bestimmung der Totalaktivität waren von diesem Waschschritt ausgenommen. Daraufhin konnten die gebundenen radioaktiv-markierten IGF1 in einem Gammacounter (LB200, Berthold Technologies, Gütersloh, Deutschland) für je 60 s gemessen werden. Anhand der Messergebnisse der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve, aus der die Konzentrationen der untersuchten Proben abgelesen werden konnten.

Ein zusätzlicher immunoradiometrischer Assay (IRMA IGF-1, A15729, Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) wurde in den Laboren der Klinik für Rinder getestet.

Für die Messung erfolgte ebenfalls der Ansatz einer Standardreihe mit den Konzentrationen 0, 30, 100, 300, 600 und 1200 ng/ml. Als Kontrollprobe diente eine Probe des Herstellers, die auf eine Konzentration von 275 bis 413 ng/ml eingestellt war. Zunächst fand eine Vorbehandlung der Proben und Kontrollen statt. Dafür wurden je 25 µl der Proben und Kontrollen mit 500 µl Dissoziationspuffer versetzt und 5 s auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt. Danach kamen nacheinander 300 µl Tracer, und 50 µl der vorbereiteten Proben, Kontrollen und Standards im Doppelansatz in die beschichteten Röhrchen dazu. Ebenso dienten hier zwei weitere Röhrchen dem Nachweis der Totalaktivität der Antikörper und waren nur mit 300 µl Tracer befüllt. Es folgte eine einstündige Inkubation auf einem Schüttler (Peqlab, Erlangen) bei 350 rpm. Der gesamte Inhalt der Röhrchen wurde daraufhin entfernt, indem die Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe (KNF Laboport, Freiburg) abgesaugt und verworfen wurde. Anschließend erfolgte ein Waschschritt der Röhrchen zweimal mit 2 ml Waschlösung. Daraufhin konnte das gebundene

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