8. Anhang
8.3 Medien für die Färbungen
Substrat Menge Konzentration Hersteller Produktnr.
Polyvinylalkohol 10 mg 0,1 % Sigma-Aldrich P8136 Dulbecco´s Phosphate
Buffered Saline 100 ml Invitrogen 14190-136
Tabelle 51: Hoechst 33342-Stocklösung
Substrat Menge Konzentration Hersteller Produktnr.
Hoechst 33342 2 mg 2 mg/ml Sigma-Aldrich 14533
ad. H2O* 1 ml
Tabelle 52: Ethidium homodimer-Stocklösung
Substrat Menge Konzentration Hersteller Produktnr.
Ethidium homodimer 1 mg 1 mg/ml Invitrogen E1169
ad. H2O* 1 ml
123 8.4 Labormaterial und Geräte
Tabelle 53: Aufführung aller verwendeten Geräte
Geräte Firma Sitz Bestellnummer
Blau-Filter für Immunfluoreszenz
Olympus Hamburg U-FBWA
Chemilumineszenz Imagingsystem
Vilber Lourmat Eberhardzell
Dynex MRXe Photometer Magellan Biosciences USA 99000210
Fluoreszenzmikroskop Olympus Hamburg IX73
Gammacounter Perkin Elmer USA 2470-0150
Gammacounter Berthold Technologies Gütersloh LB200 Grün-Filter für Ethidium und PI Olympus Hamburg U-FGW Heracell 150i CO2 Inkubator Thermo Fisher Braunschweig 51026281
Mini-Protean Tetra Cell Biorad München 165-8025FC
Mini-spin Plus Zentrifuge Eppendorf Hamburg 5453000011
Monochrome CCD-Kamera Olympus Hamburg DP73
Real-Time PCR Detection System
Biorad München 184-5096
Spectra II Photometer Tecan Group Männedorf Schweiz
Stereomikroskop Olympus Hamburg SZX7
Thermocycler C1000 Biorad München 185-2197
Thermocycler T1 Biometra Göttingen 050-90
Thermoschüttler Peqlab Erlangen 90-TS-100
UV-Filter für Hoechst 33342 Olympus Hamburg U-FUW
Vakuumpumpe KNF Laboport Freiburg Z288284
124
Geräte Firma Sitz Bestellnummer
Vortexer Peqlab Erlangen 90-V-1
Wärmeplatte minitüb Tiefenbach HT200 W
Wasserbad Memmert Schwabach ONE 10
Tabelle 54: Aufführung aller verwendeten Labormaterialien
Labormaterial Firma Sitz Bestellnummer
Actinomycin D Enzo Life Science Lörrach BML-GR300-0005
Deckgläschen Carl Roth Karlsruhe NK75.1
Dynabeads® mRNA
DIRECT™ Micro Purification Kit
Life technologies Darmstadt 61021
Eppendorfgefäße (1,5 ml) Eppendorf Hamburg 30120086
IGF1 Sigma Aldrich Steinheim I3769
Kanüle G 20 B. Braun Melsungen 4657500
Magnetic Particle
Concentrator Life technologies Darmstadt Dynal MPC®-S micro-classic Pipettierhelfer Brand Wertheim 25900
Mikropipette The Stripper Gynemed GmbH Lensahn MXL3-STR Mikrotiterplatte Greiner Bio one Kremsmünster
Österreich 655801 Nitrocellulosemembran Sigma Aldrich Steinheim GE10600016
Objektträger Carl Roth Karlsruhe NK72.1
Pasteurpipette (Glas) Carl Roth Karlsruhe 4522.1
125
Labormaterial Firma Sitz Bestellnummer
Petrischale groß (60 mm) Greiner Bio one Kremsmünster
Österreich 628160 Petrischale klein (35 mm) Greiner Bio one Kremsmünster
Österreich 627160 S-(+)-Camptothecin Enzo Life Science Lörrach
ALX-350-015-M050
single stripes Biozym Hessisch
Oldendorf Thermobehälter Duwer KGW Isotherm Karlsruhe
Thoma-Kammer Carl Roth Karlsruhe T732.1
Whatman Papier Sigma Aldrich Steinheim Z763187 Zentrifugenröhrchen (15 ml) Greiner Bio one Kremsmünster
Österreich 188161
126
8.5 Einzeldaten der durchgeführten Untersuchungen
Tabelle 55: Einzeldaten der Zellzahlfärbung mit Hoechst 33342 und Ethidium homodimer
Laufende
Nr. Kontrolle DMSO Apop. I100 I+A100 I1000 I+A1000 GZZ TZ GZZ TZ GZZ TZ GZZ TZ GZZ TZ GZZ TZ GZZ TZ
1 113 4 104 3 118 14 96 8 115 9 101 8 122 3 2 170 8 131 19 134 11 89 10 110 11 120 2 108 9 3 126 11 92 11 153 13 108 5 117 10 156 25 88 8 4 160 8 154 7 149 18 108 12 114 9 96 7 120 17 5 124 5 109 7 133 11 146 22 94 4 132 5 122 11 6 148 12 136 12 147 18 107 8 112 8 172 6 120 11 7 112 8 101 11 91 15 92 18 127 5 151 18 83 13 8 147 8 120 14 120 8 143 11 107 9 147 6 103 3
9 139 8 103 8 170 4 114 8
10 134 9 118 8 120 7 86 19
11 130 8 126 5 152 14
12 127 8
13 156 8
14 149 4
15 110 5
16 114 4
GZZ= Gesamtzellzahl; TZ= Anzahl toter Zellen
127
Tabelle 57: Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte IGF1R, IGFBP2 und IGFBP4 in den unterschiedlichen Supplementationsgruppen
128
Tabelle 58: Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte BAX, BCL2L1, SLC2A1 und SLC2A3 in den unterschiedlichen Supplementationsgruppen
BAX BCL2L1 SLC2A1 SLC2A3
n MW SEM n MW SEM n MW SEM n MW SEM Kontrolle 3 14,1 5,8 4 14,6 6,5 4 48,4 11,2 5 57,3 23,0 DMSO 3 20,9 15,0 3 9,8 8,1 2 23,0 21,0 2 20,9 16,4 Apop. 4 17,3 3,3 4 8,7 4,4 3 47,0 36,9 4 51,3 34,4 I100 3 11,4 5,2 3 7,3 1,0 2 20,2 14,2 3 32,8 31,2 I+A100 4 21,8 13,7 5 8,9 2,4 3 46,4 19,8 5 51,9 22,0 I1000 3 14,6 2,9 3 5,0 0,6 2 22,6 9,8 3 47,4 42,2 I+A1000 3 29,2 10,9 2 68,2 48,7 3 18,2 16,2 3 74,7 50,2
Tabelle 59: Einzeldaten der mRNA- und Proteinanalyse von IGF1R in unterschiedlichen Stadien der Embryonalentwicklung
IGF1R mRNA IGF1R Protein n MW SEM n MW SEM 2-Zeller 4 62,8 24,3 8 1007,8 123,8 4-Zeller 3 47,4 18,1 9 934,1 165,0 8-Zeller 5 4,1 2,1 8 717,9 58,8 16-Zeller 4 6,2 1,7 8 417,6 54,3 Morula 6 15,9 4,8 9 577,7 35,0 Blastozyste 5 31,2 6,2 9 1319,6 116,3 Exp. Blastozyste 5 40,2 10,1 10 1215,3 110,5
129
BCL2L1 B-cell CLL/lymphoma 2 like 1
bp Basenpaare
130
faf fatty acid free (fettsäurefrei)
FCS fetales Kälberserum (fetal calf serum)
FD Fold difference
Fert-TALP Fertilisierungsmedium mit Tyrodes Albumin Laktat Pyruvat FSH Follikelstimulierendes Hormon
g Erdschwerebeschleunigung
g Gramm
GH Growth hormone
GLUT Glukosetransporter (ehemalige Bezeichnung) GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung
GnRH Gonadotropin Releasing-Hormon
GOI Gene of Interest
GRFi Growth Hormone Releasing Factor
h Stunde (hora)
H2O Wasser
hCG humanes Choriongonadotropin HHE Heparin-Hypotaurin-Epinephrin
HRP Horseradish peroxidase
I 100 IGF1 in 100 ng/ml
I 1000 IGF1 in 1000 ng/ml
IE Internationale Einheiten
IETS International Embryo Transfer Society IGF1 Insulin-like growth factor 1
131
IGF1R Insulin-like growth factor 1 receptor IGF2 Insulin-like growth factor 2
IGF2R Insulin-like growth factor 2 receptor IGFBP Insulin-like growth factor binding protein IRMA Immunradiometrische Assay
IVC In-vitro-Kultivierung (in vitro culture) IVF In-vitro-Fertilisierung
132
NCCD Nomenclature Committee on Cell Death
Neg. Negativ
PMSG Pregnant Mare Serum Gonadotropin
PVA Polyvinylalkohol
SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamidgelelektrophorese SEM Standardfehler des Mittelwertes
SLC solute carrier
SLC2A1 solute carrier family 2 member 1 SLC2A3 solute carrier family 2 member 3
SNEB severe (ausgeprägte) negative Energiebilanz SOF synthetic oviduct fluid
133
T Tag
Tab. Tabelle
Taq Thermus aquaticus
TBS Tris-buffered Saline
TBS-T Tris-buffered Saline + Tween TCM199 Tissue Culture Medium 199 TdT deoxynucleotidyl transferase TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin
TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling
U Units
USA United States of America
UV Ultraviolett
V Volt
z. B. zum Beispiel
α alpha
β beta
134 9.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Proteinstruktur des IGF1 (A; SATO et al. 1993) und IGF2 (B;
TORRES et al. 1995). Proteinketten sind vom N- (Rot) zum C-Terminus (Blau) unter Verwendung eines
Regenbogenfarben-Spektrums coloriert dargestellt ...5 Abbildung 2: Insulin-like growth factor System mit Darstellung der spezifischen
Signalübertragung (mod. nach HWA et al. 1999)...7 Abbildung 3: Darstellung des Energiehaushaltes während der Laktationsphase
des Rindes (mod. nach EMMICK et al. 2000) ... 10 Abbildung. 4: Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion boviner
Embryonen (mod. nach LONERGAN 2007) ... 12 Abbildung 6: Schematische Darstellung des programmierten Zelltods (mod.
nach WEEDON et al. 1979) ... 21 Abbildung 5: Schematische Darstellung der maternal-embryonic transition
während der präimplantatorischen Entwicklung boviner
Embryonen (mod. nach GRAF et al. 2014) 24
Abbildung 7: Kumulus-Oozyten-Komplexe der Qualitätskategorie 1 (A) bis
5 (E) ... 35 Abbildung 8: Petrischale mit Einzelwells für die ölfreie Maturation boviner
Oozyten ... 36 Abbildung 9: Repräsentative Darstellung einer Oozyte im Metaphase-II
Stadium angefärbt mit Hoechst 33342; ... 40 Abbildung 10: Repräsentative Darstellung der Lebend-Tot-Färbung einer
expandierten Blastozyste; Blau: Lebende Zellen (Hoechst 33342);
Rot: Tote Zellen (Ethidium homodimer und Hoechst 33342) ... 47 Abbildung 11: Repräsentative Darstellung der TUNEL-Färbung einer expandierten
Blastozyste; Blau: TUNEL-negative Zellen (Hoechst 33342); Grün:
TUNEL-positive Zellen (TUNEL-Reaktionslösung) ... 49 Abbildung 12: Darstellung des Magnetic Particel Concentrators mit
Dynabead-Lösung (Pfeil) ... 51
135
Abbildung 13: Peptidsequenz des IGF1R mit gekennzeichneten Positionen der getesteten Antikörper; hellgrau: α-Untereinheit (Aminosäure 1-710), weiß: β-Untereinheit (Aminosäure 711-1367), dunkelgrau:
Transmembrandomäne (Aminosäure 906-929) ... 61 Abbildung 15: Darstellung der prozentualen Entwicklungsraten der einzelnen
Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung an Tag
sieben und Tag acht (MW + SD); a:b P ≤ 0,05 ... 70 Abbildung 16: Repräsentative Illustration der Kumuluszellexpansion in den
unterschiedlichen Versuchsgruppen nach 24-stündiger Maturation;
A: Kontrolle, B: DMSO; C: Apoptoseinduzierer; D: IGF 100, E: I+A 100, F: IGF 1000, G: I+A 1000 ... 71 Abbildung 17: Repräsentative Darstellung der nukleären Stadien boviner Oozyten
während der Reifung mit Hilfe einer Hoechst 33342-Färbung; A:
Prophase I, B: Telophase I, C: Metaphase II ... 72 Abbildung 18: Repräsentative Abbildung der Lebend-Tot-Färbung mit Höchst
33342 und Ethidium homodimer; Blau: Lebende Zellen; Rot: Tote Zellen ... 76 Abbildung 19: Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der
unterschiedlichen Supplementationsgruppen (MW + SD);
a:b P ≤ 0,05... 78 Abbildung 20: Repräsentative Darstellung expandierter Blastozysten nach
TUNEL- und Zellkernfärbung ... 79 Abbildung 21: Darstellung des prozentualen Anteils TUNEL-positiver und
-negativer Zellen in expandierten Blastozysten der
unterschiedlichen Supplementationsgruppen ... 80 Abbildung 22: Relative Transkriptmenge von BCL2L1 in expandierten
Blastozysten der verschiedenen Supplementationsgruppen an
Tag sieben (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05 ... 81 Abbildung 23: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGF1R, IGFBP3
und BAX in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen
Versuchsgruppen an Tag sieben ... 82
136
Abbildung 24: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGFBP2, SLC2A1 und SLC2A3 in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben ... 82 Abbildung 25: Darstellung der relativen Transkriptmenge des IGF1R im Verlauf
der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05 ... 83 Abbildung 26: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen
Proteinextrakten unter Verwendung des Peptidantikörpers anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin, 1: 50 Embryonen, 2-4: Positivkontrollen (bovine Leber, Karunkel, Kotyledone) ... 84 Abbildung 27: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen
Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rα (santa cruz biotechnology, CA, USA); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin;
1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta .. 85 Abbildung 28: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen
Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rβ (santa cruz biotechnology, CA, USA); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin;
1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta .. 86 Abbildung 29: Repräsentative Darstellung der Proteinexpression des IGF1R im
2- (A), 4- (B), 8- (C), 16-Zellstadium (D), Stadium der Morula (E), der Blastozyste (F) und der expandierten Blastozyste (G); Rot:
Zellkernfärbung mit Propidiumiodid, Grün: spezifische Antikörperfärbung mit Hilfe des anti-popp IGF1R
(Seqlab, Göttingen) ... 87 Abbildung 30: Darstellung der mittleren Graustufenintensitäten im Verlauf der
frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b:c P ≤ 0,05 ... 88 Abbildung 31: Vergleich der relativen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R
während der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM), die Proteinexpression wurde für Darstellungszwecke um ein
Zehnfaches verringert ... 89
137 9.3 Verzeichnis der Tabellen
Tabelle 1: Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum
Maturationsmedium und dessen Einfluss auf unterschiedliche Parameter der Embryonalentwicklung ... 17 Tabelle 2: Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum
Kultivierungsmedium und dessen Einfluss auf unterschiedliche Parameter der Embryonalentwicklung ... 19 Tabelle 3: Qualitätskategorien der Kumulus-Oozyten-Komplexe ... 34 Tabelle 4: Übersicht der Versuchsgruppen und ihrer jeweiligen
Mediumszusätze während der Maturation boviner Oozyten ... 37 Tabelle 5: Auflistung der verwendeten Testkits zum Nachweis von IGF1 ... 41 Tabelle 6: Mastermixe für die Reverse Transkription ... 52 Tabelle 7: Pipettierschema der Reversen Transkription mit einem
Volumen von 20 µl ... 53 Tabelle 8: Übersicht der verwendeten Primer für die RT-qPCR von
Embryonen der unterschiedlichen Versuchsgruppen ... 54 Tabelle 9: Ansätze für die qPCR ... 55 Tabelle 10: Eingesetzte Embryonenäquivalente der zu untersuchenden
Gentranskripte ... 55 Tabelle 11: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Teilungs- und
Entwicklungsraten der IVP-Versuche zur Gewinnung
expandierter Blastozysten für die Western blot - Versuche ... 68 Tabelle 12: Anzahl eingesetzter Kumulus-Oozyten-Komplexe, sowie
Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen in den einzelnen Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung ... 69 Tabelle 13: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Maturationsraten von Oozyten
der unterschiedlichen Versuchsgruppen ... 73 Tabelle 14: Vergleich der Messergebisse der IGF1-Konzentration im
Medium mit Hilfe unterschiedlicher Methoden vor und nach 24-stündiger Oozytenmaturation ... 75
138
Tabelle 15: Gesamtzellzahlen, Anzahl toter Zellen und Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben ... 77 Tabelle 16: Prozentuale Verteilung TUNEL-negativer und -positiver Zellen
expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben ... 80 Tabelle 17: PBS-Gebrauchslösung ... 112 Tabelle 18: PBS-Complete ... 112 Tabelle 19: TCMair ... 112 Tabelle 20: TCM199-Gebrauchslösung ... 113 Tabelle 21: Fert-TALP-Stocklösung ... 113 Tabelle 22: Fert-TALP-Gebrauchslösung ... 114 Tabelle 23: Epinephrin-Lösung ... 114 Tabelle 24: Hypotaurin-Lösung ... 114 Tabelle 25: Heparin-Lösung ... 114 Tabelle 26: HHE-Stocklösung ... 115 Tabelle 27: HHE-Gebrauchslösung ... 115 Tabelle 28: Fertilisationsmedium ... 115 Tabelle 29: Spermfilter-Gebrauchslösung ... 115 Tabelle 30: SOF-Stocklösung A ... 116 Tabelle 31: SOF-Stocklösung B ... 116 Tabelle 32: SOF-Stocklösung C ... 116 Tabelle 33: SOF-Stocklösung D ... 117 Tabelle 34: Glutamin-Stocklösung ... 117 Tabelle 35: SOFaa-Kultivierungsmedium ... 117 Tabelle 36: Polyacrylamid-Gel ... 118 Tabelle 37: Boehringer Lysepuffer ... 118 Tabelle 39: 10x-Tris-Glycin-Puffer (TG) ... 119 Tabelle 40: 10x-TBS ... 119 Tabelle 41: TBS-T ... 120 Tabelle 42: SDS-Laufpuffer ... 120
139
Tabelle 43: Blottingpuffer ... 120 Tabelle 44: Blockierungslösung ... 120 Tabelle 45: Stripping-Puffer ... 121 Tabelle 46: Paraformaldehyd-Lösung ... 121 Tabelle 47: Triton-X100-Lösung ... 121 Tabelle 48: Polyvinylpyrrolidon-Lösung ... 121 Tabelle 49: BSA-Lösung ... 122 Tabelle 50: PVA/PBS-Lösung ... 122 Tabelle 51: Hoechst 33342-Stocklösung ... 122 Tabelle 52: Ethidium homodimer-Stocklösung ... 122 Tabelle 53: Aufführung aller verwendeten Geräte ... 123 Tabelle 54: Aufführung aller verwendeten Labormaterialien ... 124 Tabelle 55: Einzeldaten der Zellzahlfärbung mit Hoechst 33342 und Ethidium
homodimer ... 126 Tabelle 56: Einzeldaten der TUNEL-Analyse ... 127 Tabelle 57: Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte IGF1R,
IGFBP2 und IGFBP4 in den unterschiedlichen
Supplementationsgruppen ... 127 Tabelle 58: Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte BAX,
BCL2L1, SLC2A1 und SLC2A3 in den unterschiedlichen
Supplementationsgruppen ... 128 Tabelle 59: Einzeldaten der mRNA- und Proteinanalyse von IGF1R in
unterschiedlichen Stadien der Embryonalentwicklung ... 128
140 9.4 Literaturverzeichnis
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