Charakterisierung des bovinen plazentaren Insulin-like growth factor systems in vitro und der peripartalen Expression von IRS1 und IRS2 im Plazentom und in interplazentomaren Bereichen des Rindes in vivo

Charakterisierung des bovinen plazentaren Insulin-like growth factor systems in vitro und der peripartalen Expression von IRS1

und IRS2 im Plazentom und in

interplazentomaren Bereichen des Rindes in vivo

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Lisa Lenz, geb. Schütte Helmstedt

Hannover 2015

1. Gutachterin: Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut

Tierärztliche Hochschule Hannover

2. Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Meinecke

Institut für Reproduktionsbiologie Tierärztliche Hochschule Hannover

Tag der mündlichen Prüfung: 21.05.2015

Diese Arbeit wurde unterstützt von Pfizer Inc.

Für Marko, Frieda und Lennard

2. Literaturübersicht

2.1. Der bovine Uterus 3

2.2. Die bovine Plazenta 4

2.3. Peri- und postpartale Änderungen in Uterus und Plazenta 7

2.4. Komplikationen im Puerperium 9

2.5. Das IGF-System 11

2.5.1. Liganden des IGF-Systems 13

2.5.1.1. IGF1 14

2.5.1.2. IGF2 15

2.5.2. Rezeptoren des IGF-Systems 15

2.5.2.1. IGF1R 16

2.5.2.2. IGF2R 17

2.5.2.3. HR 18

2.5.3. IGFBPs 19

2.6. Das IGF-System in der Plazenta und im Zusammenhang mit 21 der Fortpflanzung

2.7. IRS-Proteine 26

2.8. EGF 28

3. Material und Methoden 3.1. In vitro Versuche

3.1.1. Zelllinien 29

3.1.2. Isolation BUVEC 29

3.1.3. Kultivierung der Zellen 30

3.1.4. LDL-Färbung 31

3.1.5. Quantifizierung der Zellen 32

3.1.6. Proliferations-Assay 32

3.1.7. Motilitäts-Assay 35

3.1.8. Molekularbiologie 36

3.2.1. Material und Gewebeentnahme und -aufbereitung 44

3.2.2. Gruppe 1: Proben der präpartalen Phase 44

3.2.3. Gruppe 2: Proben der postpartalen Phase 45

3.3. Histologie 47

3.3.1. Protokoll der Handeinbettung 47

3.3.2. Protokoll der automatischen Einbettung 47

3.3.3. Vorbereitung der Schnitte für Histologie und Immunhistochemie 48

3.3.4. Hämatoxylin-Eosin-Färbung 49

3.3.5. Immunhistochemie 50

4. Ergebnisse

4.1. Ergebnisse der in vitro Versuche 53

4.1.1. Ergebnisse der RT-PCR 53

4.1.2. Untersuchung des Einflusses von IGF1, IGF2, EGF, IGF1+EGF 56 und IGF2+EGF auf die Proliferation plazentarer Zellen in vitro

4.1.2.1. Proliferation nach Stimulation mit IGFs und EGF bei BCEC 58 4.1.2.2. Proliferation nach Stimulation mit IGFs und EGF bei F3 Zellen 59 4.1.2.3. Proliferation nach Stimulation mit IGFs und EGF bei Fibroblasten 60 4.1.3. Einfluss von IGF1, IGF2, EGF, IGF1+EGF, EGF und 61

IGF2+EGF auf die Motilität plazentarer Zellen in vitro

4.1.3.1. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei BCEC 62 4.1.3.2. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei F3 Zellen 63 4.1.3.3. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei Fibroblasten 64 4.1.3.4. Motilität nach Stimulation mit IGFs und EGF bei BUVEC 65 4.1.4. Aktivierung verschiedener Signalwege in plazentaren Zellen in vitro 66 4.1.4.1. Aktivierung des MAPK Kinase 42/44, Akt-Kinase und 66

p38-MAP Kinase Signalweges bei BCEC, F3 Zellen und Fibroblasten 4.1.4.2. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei BCEC 68 4.1.4.3. Aktivierung intrazellulärer Signalwege bei F3 Zellen 70

4.2.2. Immunhistochemie 76

4.2.2.1. IRS1 76

4.2.2.1.1. IRS1-Expression im Plazentom 77

4.2.2.1.2. IRS1-Expression im interplazentomaren Gewebe 80

4.2.2.2. IRS2 83

4.2.2.2.1. IRS2-Expression im Plazentom 83

4.2.2.2.2. IRS2-Expression im interplazentomaren Gewebe 86 4.2.2.2.3. Zusammenfassung der immunhistologischen 89

Untersuchungen an Plazentom und interkarunkulärem Gewebe

5. Diskussion 91

5.1. Wirkung von IGF1 und EGF 91

5.2. Wirkung von IGF2 und EGF 97

5.3. Expression von IRS1 und IRS2 mRNA in BCEC, F3-Zellen und

Fibroblasten 100

5.4. Immunhistochemische Lokalisation von IRS1 und IRS2 101 5.5. Expression von IRS1 und IRS2 im Plazentom und Vergleich mit 102

IGF1 und IGF2

5.6. Expression von IRS1 und IRS2 im interplazentomaren Gewebe 106 und Vergleich mit IGF1 und IGF2

5.7. Schlussfolgerung 109

6. Zusammenfassung 110

7. Summary 113

8. Literaturverzeichnis 116

9. Anhang 135

9.1. Abkürzungen 135

9.2. Puffer und Lösungen 140

9.3. Reagenzien 146

9.4. Verbrauchsmaterialien 150

10. Danksagung 156

1. Einleitung

Das insulin-like growth factor (IGF)-System spielt während der Trächtigkeit und auch post partal beim Rind eine große Rolle. Den einzelnen Komponenten kommen verschiedene Aufgaben zu. Unter anderem sind sie wichtig für die feto-maternale Kommunikation, das fetale Wachstum und das der Plazenta, sowie die entsprechende Nährstoffversorgung des Fetus über die Plazenta (Giudice et al., 1995; Klauwer et al., 1997; Forbes und Westwood, 2008). Durch die bekannte positive Wirkung des IGF- Systems auf die Wundheilung (Lynch et al., 1987; Bitar, 1997) ist auch eine Beteiligung an den Heilungsprozessen des Uterus nach der Geburt denkbar (Piechotta et al., 2012), auch durch immunmodulatorische Effekte von IGF1 (Vangroenweghe et al., 2005).

Ein im Puerperium verringerter IGF1-Spiegel im Blut wird mit verzögerter Uterusinvolution und erhöhten Entzündungsgraden des Uterus in Verbindung gebracht (Wathes et al., 2007; Wathes et al., 2009; Wathes et al, 2011), postpartale Erkrankungen sind beim Rind von enormer wirtschaftlicher Bedeutung, weshalb die genaue Rolle des IGF hierbei geklärt werden soll.

Ein weiterer potenter Wachstumsfaktor dessen positiver Einfluss auf die Plazenta schon nachgewiesen wurde, ist EGF (Miettinen et al., 1995; Dilly et al., 2010;

Hambruch et al., 2010). Im Rahmen dieser Dissertation soll auch das mögliche Zusammenwirken dieser beiden Stoffe untersucht werden.

Dafür wurden verschiedene Zelllinien, bovine Karunkelepithelzellen (BCEC), Trophoblastzellen (F3), Fibroblasten und bovine Endothelzellen der Nabelvene (BUVEC), aus der bovinen Plazenta gewonnen und der Einfluss von IGF1, IGF2, EGF und einer Kombination aus IGF1+EGF bzw. IGF2+EGF auf die Proliferation und Motilität dieser Zellen in vitro analysiert. Weiterhin wurden mit der MAP-Kinase 42/44, der Akt Kinase und der p38-MAP Kinase mögliche intrazelluläre Signalwege nach Aktivierung durch bereits genannte Faktoren mittels Western Blot untersucht.

Für eine Kommunikation zwischen IGF und EGF innerhalb der Zelle und eine Vermittlung der Signale nach IGF-Aktivierung, kommen mit großer Wahrscheinlichkeit die IRS-Proteine in Frage (Myers et al., 1992; White, 1997; Lassarre und Ricort, 2003;

O’Connor, 2003). Aus diesem Grund wurde eine Lokalisation der IRS1- und IRS2- Proteine in Plazenta und Uterus des Rindes, mittels Immunhistochemie, vorgenommen. Hierfür wurden Proben von Rindern gewonnen, die entweder eine Sectio caesarea oder eine spontane Geburt erfuhren. Diese wurden außerdem aufgrund ihrer IGF-Blut-Spiegel in eine IGF-low- und IGF-high-Gruppe eingeteilt. Nach einer bestimmten Zeitspanne wurde den Tieren eine LPS-Instillation zugeführt und die Kühe im Folgenden euthanasiert.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Bedeutung von IGF, aber auch die Wechselwirkung von IGF und EGF, in der Plazenta auf. Die in dieser Arbeit gesammelten Erkenntnisse, zusammen mit dem Nachweis von IRS1 und IRS2 in Plazenta und Uterus des Rindes, können nach weitergehenden Untersuchungen möglicherweise eine Diagnostik und Therapie puerperaler, boviner Erkrankungen ermöglichen.

2. Literaturübersicht

2.1. Der bovine Uterus

Das Rind weist einen Uterus bicornis auf, der sich nach kranial verjüngende Hörner besitzt. Diese sind widderhornartig aufgerollt. Kaudal davon liegt das Corpus uteri. Die Cervix uteri liegt zwischen Vagina und Corpus uteri und ist außer zur Geburt und während der Brunst verschlossen. Die Schleimhaut des Uterus, welche in Längs- und Querfalten angeordnet ist, besitzt außerdem eine tierartliche Besonderheit, die Karunkeln. Diese sind in vier Reihen unregelmäßig angeordnet (Nickel et al., 1987;

Budras, 2002).

Histologisch ist die Gebärmutter in vier verschiedene Schichten einzuteilen. Dem Lumen anliegend befindet sich die Mukosa (Endometrium). Sie besteht aus einem einschichtig hochprismatischen Epithel, das teilweise aber auch mehrreihig sein kann, und der Lamina propria mucosae. In dieser sind die uterinen Drüsen zu finden. Die Karunkeln stellen knopfförmige, drüsenfreie Bezirke mit einer bindegewebigen Grundlage in der Mukosa dar, welche sich in der Trächtigkeit vergrößern. Daran schließt sich die Tunica muscularis (Myometrium) an. Sie besteht aus zwei Muskelschichten, von denen die innen liegende zirkulär und die äußere longitudinal verläuft. Es folgt die Tela subserosa und anschließend die Tunica serosa (Perimetrium) (Liebich, 2010).

Abb. 1: Übersicht Uterus Rind (HE). Abgebildet sind die Mukosa mit Stratum compactum (A) und luminalem Epithel (Pfeil) und das Stratum reticulare (B) mit den uterinen Drüsen (gelber Pfeil) sowie das Myometrium (C). Messbalken: 50µm.

2.2. Die bovine Plazenta

Säugetiere bilden während der Trächtigkeit die Plazenta, ein temporäres Organ, aus.

Sie entsteht an den Kontaktstellen der fetalen Membranen mit der Mukosa des Uterus und ermöglicht den fetomaternalen Austausch (Leiser und Kaufmann, 1994). Neben dieser entscheidenden Aufgabe ist sie auch in der Lage unterschiedliche Stoffe wie Hormone (Schlafer et al., 2000; Sousa et al., 2008) oder auch Wachstumsfaktoren (Richterich, 2008) zu sezernieren. Es sind zwei Anteile der Plazenta zu unterscheiden, die Pars fetalis, welche vom mit Zotten besetzten Chorion gebildet wird, und die Pars maternalis, die durch das Endometrium der uterinen Karunkel gebildet wird (Michel, 1995). Beim Rind formen beide Anteile zusammen etwa 80-140 Plazentome. Zwischen diesen liegen die interkotyledonären Bereiche. An diesen Stellen weist das Chorion nur eine dünne Membran mit atrophierten Zotten auf, die der Mukosa des Uterus

gegenüberliegt und auch als Chorion laeve bezeichnet wird (Leiser und Kaufmann, 1994). Deshalb wird von einer Placenta cotyledonaria sive multiplex gesprochen (Strahl, 1906; Grosser ,1927). Allerdings wird auch in gewissem Maße über das Chorion laeve ein fetomaternaler Austausch ermöglicht (Leiser und Kaufmann, 1994).

Die verzweigten Zottenbüschel der Kotyledone, die im gegenüberliegenden maternalen Gewebe, den Krypten der Karunkel liegen, haben zur Klassifikation als villöser Plazentatyp geführt (Steven, 1975; Kaufmann, 1981; Wooding, 1992). Die Zotten bestehen aus vaskularisiertem Mesenchym (Grosser, 1927), welches mit einer Zellschicht aus Trophoblastektoderm überzogen ist (Björkmann und Sollen, 1960). In den maternalen Krypten ist ein gut vaskularisiertes Bindegewebe zu finden, welches von einem einschichtigen, kubischen Epithel bekleidet wird (Björkmann und Sollen, 1960). Gegenüberliegendes Kryptenepithel und Trophoblasten tragen jeweils Mikrovilli und stehen in engem Kontakt. Dies führt zu einer Vergrößerung der Kontaktfläche zwischen fetalen und maternalen Gewebeanteilen (Björkmann und Bloom, 1957). Die wohl bekannteste Klassifizierung der Plazenta erfolgt nach Grosser (1909; 1927).

Hierbei werden die verschiedenen Schichten herangezogen, die fetales und maternales Blut voneinander trennen. Das Rind wird hier prinzipiell zum epitheliochorialen Typ gezählt, da alle sechs Gewebsschichten, die für die Klassifizierung wichtig sind, vorhanden sind. Dazu gehören das maternale Epithel, Bindegewebe und Endothel sowie fetales Epithel/Trophoblasten, Bindegewebe und Endothel. Bei einer epitheliochorialen Plazenta liegt das Chorion also einer fast intakten uterinen Mukosa an, ohne endometriale Invasion, mit den entsprechenden Folgen für den Stoffaustausch zwischen Muttertier und Fetus. Bei den Wiederkäuern kommt es allerdings zu einer geringgradigen Invasion. Spezielle Trophoblastzellen, die Trophoblast giant cells (TGC) oder auch binukleäre Riesenzellen (BNC) genannt, fusionieren mit dem maternalen Epithel zu feto-maternalen Hybridzellen, die per definitionem Synzytien sind (Wooding, 1992; Leiser und Kaufmann, 1994; Schlafer et al., 2000). Dieses spezielle Charakteristikum hat zur einer weiteren Spezifizierung als synepitheliochoriale Plazenta geführt (Wooding, 1992). Die TGC haben große Granula, die mehr als die Hälfte des Volumens ausmachen können. In diesen Granula sind verschiedene Proteine und Glykoproteine gespeichert, wie z.B. das plazentare

Laktogen (Wooding, 1992). Die ersten TGC sind kurz vor der Implantation nachzuweisen (Leiser, 1975; Wooding, 1984) und sie machen etwa 15-20% der fetalen Epithelzellen aus. Trotz ihres mikroskopisch gleichen Erscheinungsbildes sind verschiedene Subpopulationen von binukleären Trophoblasten bekannt (Munson, 1989; Jones et al., 1994;). Ein bis zwei Tage vor der Geburt kommt es zu einem starken Absinken der Anzahl an TGC (Wooding, 1984). Die Aufgabe der TGC ist einerseits fetomaternale Synzytien zu bilden und andererseits die Produktion und Abgabe verschiedener steroidaler Hormone (Reimers et al., 1985; Wooding, 1992;

Matamoros et al., 1994; Roberts et al., 1995). Es ist auch bekannt, dass TGC eine Reihe von Wachstumsfaktoren exprimieren wie z.B: FGF-1, -2 und -7 (Pfarrer et al., 2006 a), VEGF (Pfarrer et al., 2006 b) oder PAF (Bücher et al., 2006). Es wird vermutet, dass der Vorgang der Fusion und die spezifischen Produkte für eine erfolgreiche Implantation und ein entsprechendes Wachstum der Plazentome wichtig sind.

Die Form der Plazenta beeinflusst auch die plazentare Separation während/nach der Geburt. Die Trennung erfolgt entlang der fetomaternalen Kontaktfläche, wodurch das maternale Gewebe zu weiten Teilen intakt bleibt und die größtenteils fetale Plazenta ohne großen Gewebsverlust oder Blutungen ausgeschieden wird (Leiser und Kaufmann, 1994). Damit gehört das Rind zu den „Adeciduata“. Nach Huxley (1864) wird diese Form der Plazenta auch als Plazenta apposita oder nach Strahl als Semiplazenta (Strahl, 1906) bezeichnet.

Eine weitere Form der Einteilung betrifft die Anordnung von maternalen und fetalen Blutgefäßen zueinander und die vorherrschende Blutflussrichtung. Dies bestimmt die Effizienz des Sauerstoffaustauschs zwischen Muttertier und Fetus und beeinflusst so auch die Relation zwischen Gewicht der Plazenta und des Fetus (Leiser und Kaufmann, 1994). Es wurde zunächst angenommen, dass es bei den Wiederkäuern einen so genannten multivillösen Blutfluss gibt, der nur zu einem gewissen Grad ein Gegenstromprinzip aufweist, sonst aber zwischen Parallelstrom und Gegenstromprinzip anzusiedeln ist (Dantzer et al., 1988). Neuere Arbeiten ergaben jedoch, dass im 3./4. Monat der Trächtigkeit das Gegenstromprinzip vorherrscht. Vom mittleren Drittel bis zum Ende spielt diese Art des Blutaustausches immer noch die größte Rolle. Mit der Entwicklung der tertiären Krypten und der entsprechenden

interdigitierenden Zotten, erfolgt der Blutaustausch in den Kapillaren dieser Bereichen nach dem Querstromprinzip (Pfarrer et al., 2001).

Abb. 2: Histologischer Schnitt der Rinderplazenta (HE). Zu erkennen sind sowohl die fetalen Zotten mit uninukleären Trophoblasten (blauer Pfeil), TGC (schwarzer Pfeil) und fetalem Mesenchym (F), als auch die Pars maternalis, die Krypten, mit maternalen Epithelzellen (grüner Pfeil) und Stroma (M). Die Länge des Messbalkens entspricht 50µm

2.3. Peri- und postpartale Änderungen in Uterus und Plazenta

Während der Trächtigkeit, welche beim Rind 285 Tage dauert (Grosser, 1927), kommt es zu erheblichen Veränderungen auf maternaler aber auch fetaler Seite des Kontaktbereiches zwischen Muttertier und Fetus. Etwa in der vierten Trächtigkeitswoche kommt es zur Kontaktaufnahme zwischen Chorioallantois und dem Endometrium. Am engsten wird diese Verbindung im Bereich der Karunkeln. Die

Chorioallantois bildet auf der den Karunkeln gegenüberliegenden Fläche die Kotyledonen aus, welche mit ihren Zotten in die Oberfläche der Karunkeln hineinragen und somit die Kontaktoberfläche vergrößern. Im Verlauf der Trächtigkeit nehmen die Plazentome an Größe zu, sie werden bis zu 12cm lang und 2-3cm dick. In dem tragenden Uterushorn sind sie deutlich größer als im nicht tragenden (Schlafer et al., 2000).

Gegen Ende der Trächtigkeit kann das maternale Epithel in einigen Krypten abflachen, atrophieren oder auch komplett fehlen (Björkmann und Sollen, 1960). Andererseits ist es aber auch möglich, dass sich zu diesem Zeitpunkt Plasmodien ausbilden, welche 10-20 Kerne besitzen können (Björkmann, 1954).

Bei der Geburt kommt es zur Ablösung der fetalen Membranen. Damit ein physiologischer Nachgeburtsabgang stattfinden kann, ist eine abgeschlossene Reifung der Plazenta Voraussetzung (Paisley et al., 1986). Der dafür notwendige Lösungsprozess beginnt bereits in den letzten Monaten der Gravidität (Grunert et al., 1983). Dazu zählt unter anderem das bereits erwähnte Abflachen des maternalen Epithels, aber auch ein Umbau der bindegewebigen Grundlage der Plazentome (Schulz und Merkt, 1956). Welche Mechanismen aber genau ausschlaggebend sind, ist immer noch nicht endgültig geklärt (Schlafer et al., 2000; Dilly et al., 2011; Shenavai et al., 2012). Nach dem Abgang der Nachgeburt, also den fetalen Anteilen der Plazenta, sind die Karunkeln als bindegewebiges System zurückgeblieben, die Krypten sind meist leer und kollabiert (Björkmann und Sollen 1969), können aber auch verbliebene Reste der fetalen Anteile enthalten. Diese werden phagozytiert und gehen im weiteren Verlauf, als physiologischer Prozess, mit den Lochien ab. Die oberflächlichen Anteile der Karunkel werden ebenfalls mit den Lochien abgestoßen (Archbald et al., 1972). In den ersten Tagen post partum kommt es außerdem, durch Vasokonstriktion bedingt, zu Nekrosen in den Karunkeln und damit einhergehend zu Nekrosen und einer Desorganisation des Gewebes. Dies wiederum führt zur Einwanderung von Leukozyten (Gier und Marion, 1968) und der vorangehend beschriebenen Abschilferung in der Karunkel.

Wird die Nachgeburt nicht in einem bestimmten Zeitfenster abgestoßen, wird von einer Nachgeburtsverhaltung/Retentio secundinarum gesprochen. Für einige Autoren ist

dies nach 12 Stunden der Fall (Herschler und Lawrence, 1984; Borsberry und Dobson, 1989; Eiler und Hopkins, 1993) für andere wiederum erst nach 24 Stunden (Holt et al., 1989; Brooks, 2001; Drillich et al., 2003).

Während der ersten Woche post partum kommt es zu Kontraktionen des Uterus, die dafür sorgen, dass noch verbliebene Reste fetaler Membranen und Flüssigkeiten mit den Lochien ausgestoßen werden (Sheldon et al., 2009). Im folgenden Verlauf findet eine Ausheilung statt, wobei unterschiedliche Angaben zur Dauer existieren, sie reichen von 19 Tagen (Archbald et al., 1972) bis zu mindestens 25 Tagen (Gier und Marion, 1968). Während der Heilungs- und Rückbildungsphase des Uterus kommt es zu einer Ödembildung. Die Involution des Uterus ist in der Regel 40 Tage post partum abgeschlossen, während die endgültige Wiederherstellung nach histologischer Kontrolle erst nach 50 Tagen erreicht wird (Gier und Marion, 1968).

2.4. Komplikationen im Puerperium

Zu den möglichen Erkrankungen des Uterus post partum zählen beim Rind die puerperale Metritis, Pyometra und die Endometritis. Diese können die Fertilität erheblich beeinflussen (Sheldon et al, 2009).

In der Gravidität ist der Uterus steril, aber post partum ist die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination des Uterus mit Bakterien sehr groß, da sonst vorhandene Schutzmechanismen zu diesem Zeitpunkt nur eingeschränkt vorhanden sind (Singh et al., 2008; Sheldon et al., 2008). Etwa 80-100% aller Kühe weisen, in den ersten zwei Wochen nach dem Kalben, Bakterien im Uteruslumen auf. Auch wenn bei einem Großteil der Tiere das Immunsystem eine Erkrankung verhindern kann, kommt es immer noch bei bis zu 40%, innerhalb von drei Wochen post partum, zu einer bakteriellen Infektion des Uterus. Eine Nachgeburtsverhaltung stellt ein großes Risiko für folgende Infektionen des Uterus dar (Sheldon et al., 2008).

Da verschiedene klinische Definitionen zu den Uteruserkrankungen vorlagen, wurde von Sheldon et al. (2006; 2008) eine einheitliche Nomenklatur zur besseren Differenzierung und Therapie vorgeschlagen.

Die puerperale Metritis bezeichnet eine akute, systemische Erkrankung, welche durch eine bakterielle Uterusinfektion bedingt ist. Sie tritt in den ersten zehn Tagen post partum auf. Tritt in den 21 Tagen nach der Geburt purulenter Ausfluss mit einem vergrößerten Uterus einhergehend auf, wird dies als klinische Metritis bezeichnet.

Hierbei sind meist keine weiteren Symptome erkennbar und das Allgemeinbefinden ist ungestört.

Die klinische Endometritis zeichnet sich nach Sheldon durch purulenten, bzw.

mukopurulenten Ausfluss nach dem 21. Tag post partum aus, ohne dass systemische Symptome vorliegen.

Die subklinische Endometritis kann durch zytologische Untersuchungen nachgewiesen werden und stellt eine Entzündung des Endometriums dar, mit signifikanter Reduktion der Fertilität. Es ist in diesem Fall kein purulentes Material in der Vagina nachzuweisen. Ausschlaggebend ist der Zeitpunkt und die Anzahl vorhandener neutrophiler Granulozyten.

Als Pyometra wird ein Zustand beschrieben, bei dem es zu einer Ansammlung von purulentem oder auch mukopurulentem Exsudat in der Gebärmutter kommt, der mit einer Erweiterung des Uterus und einem aktiven Corpus luteum einhergeht. Die Zervix ist zu diesem Zeitpunkt funktionell verschlossen, es ist aber dennoch möglich, dass durch eine kleine Öffnung purulentes Material in die Vagina gelangt und dort sichtbar wird (Sheldon et al., 2006, Sheldon et al., 2008; Sheldon et al., 2009).

Infektionen des Uterus spielen eine wichtige Rolle, denn sie können unter anderem zu Infertilität oder systemischen Erkrankungen führen und sich insgesamt negativ auf die Reproduktion auswirken (Gilbert et al., 2005; Lincke et al., 2007; Sheldon et al., 2009;

Turner et al., 2012). Bedingt durch die Erkrankung des Uterus sinkt die Wahrscheinlichkeit einer Ovulation, denn die Ovarfunktion ist eingeschränkt.

Außerdem kommt es zu einer geringeren Östradiol Konzentration im Plasma und einer Dysregulation von Hypothalamus und Hypophyse. Auch die Lutealphase ist verlängert.

Insgesamt haben etwa 50% aller Milchkühe abweichende Zyklen in der postpartalen

Phase (Sheldon, 2009). Nach LeBlanc (2008) erkranken 15-20% der Hochleistungsmilchkühe an klinischer und 30% an subklinischer Endometritis (LeBlanc, 2008). Um aber das Zwischenkalbeintervall möglichst kurz halten zu können, muss der Genitaltrakt sowohl anatomisch als auch funktionell wieder den intakten Zustand erreichen (Mateus et al., 2002). Die Zwischenkalbezeit sollte nach wirtschaftlichen Maßstäben bei 12-13 Monaten liegen, folglich müsste die Kuh 80-110 Tage post partum wieder trächtig werden (Bretzlaff, 1987). Dies kann aber nur erreicht werden, wenn keine Erkrankungen des Uterus im Puerperium auftreten.

In der peripartalen Phase weist die Mehrheit der Milchkühe eine negative Energiebalance auf, während der verschiedene Parameter der Fett- und Proteinmobilisation verändert sind. Kühe, die eine Erkrankung des Uterus aufweisen, sind hiervon noch stärker betroffen, da sie weniger Trockenmasse aufnehmen, als klinisch gesunde Tiere (Wathes et al., 2007). Diese Veränderungen beeinflussen die Immunabwehr und in der Folge auch das Entstehen von Infektionen im Uterus, die wiederum mit unter anderem verschlechterter Fertilität einhergehen (Cai et al., 1994;

Sheldon et al., 2004). Die metabolischen Veränderungen post partum mit der negativen Energiebalance führen zu einer Entkopplung der Growth Hormone (GH)- Insulin-like growth factor (IGF) Achse, was zur Folge hat, dass der IGF1-Spiegel im Blut sinkt. Dieser Vorgang wird mit einer Verzögerung der Uterusinvolution, schlechterer Heilung und erhöhten Entzündungsgraden des Uterus in Verbindung gebracht (Wathes et al., 2007; Wathes et al., 2009; Wathes et al., 2011). Auch präpartal verringerte IGF1-Werte scheinen auf ein erhöhtes Risiko post partaler Erkrankungen hinzudeuten (Piechotta et al., 2012). Die Liganden des IGF-Systems sind als potente Faktoren in der Wundheilung bekannt (Lynch et al., 1987; Bitar, 1997).

Auch als Immunmodulatoren scheinen sie als ein wichtiger Faktor bei der Verhinderung und Bekämpfung uteriner Erkrankungen post partum denkbar (Vangroenweghe et al., 2005). Ebenfalls denkbar ist ein Einfluss von MMPs (Matrix- Metallo-Proteinasen) bei der Involution und Heilung des Uterus nach der Geburt (Wathes et al., 2011).

2.5. Das IGF-System

Das Insulin-like growth factor System besteht aus zwei Liganden, dem Insulin-like growth factor 1 (IGF1) und dem Insulin-like growth factor 2 (IGF2), den Insulin-like growth factor binding proteins (IGFBPs) sowie den spezifischen Zelloberflächen- Rezeptoren Insulin-like growth factor Rezeptor 1 (IGF1R) und Insulin-like growth factor Rezeptor 2 (IGF2R). Weiterhin können auch der Insulin Rezeptor (IR) und der Insulin- Hybrid Rezeptor (HR) die Wirkung der Liganden vermitteln. In den folgenden Abschnitten werden die einzelnen Bestandteile näher erläutert.

Erste Hinweise auf das IGF-System finden sich in der „Somatomedin-Hypothese“. Ziel dieser Versuche war es, zu verstehen, wie das somatische Wachstum durch Faktoren aus der Hypophyse beeinflusst wird. Dabei stellte sich heraus, dass dort produziertes Growth hormone (GH) nicht direkt das Wachstum der Zielorgane beeinflusst, sondern dass eine zwischengeschaltete Substanz wie ein endokrines Hormon oder ein Wachstumsfaktor nötig ist (Salmon und Daughaday ,1957). Dieser Wirkstoff wurde als Somatomedin bezeichnet, um deutlich zu machen, dass er die Wirkung von GH, das auch als Somatropin bezeichnet wird, vermittelt. Später erfolgte eine Einteilung der Somatomedine und die, die GH-Wirkung mediierende Substanz, wurde als Somatomedin C bezeichnet. Etwa 20 Jahre später wurden IGF1 und IGF2 das erste Mal charakterisiert und es wurde bewiesen, dass IGF1 dem Somatomedin C entspricht (Rinderknecht und Humbel, 1978). Sie wurden als „insulin-like“ benannt, da sie genauso wie Insulin in der Lage sind, die Aufnahme von Glukose in Fett- und Muskelzellen zu stimulieren (Randle, 1954).

Zu dieser Zeit wurde davon ausgegangen, dass IGFs vornehmlich als Wachstumsfaktoren wirken, auch wenn ihre Ähnlichkeit zu Insulin metabolische Funktionen nahe legte. In der zu dieser Zeit noch gängigen ursprünglichen

„Somatomedin-Hypothese“ hieß es, dass das in der Hypophyse gebildete GH vor allen Dingen die Leber beeinflusse, welche daraufhin IGF1 synthetisiere und ausschütte.

Dieses sollte dann zu den Zielorganen zirkulieren und somit seine endokrine Wirkung

vermitteln (Le Roith et al., 2001). Versuche an Rindern, denen bovines Somatotropin (bST) injiziert wurde, bestätigten diese Hypothese. Das bST führte sowohl in der Laktation, als auch während der Trockenstehphase zu einem Anstieg von IGF1 im Serum. Die Konzentration von IGF2 im Serum hingegen wurde nur während der Trockenstehphase durch bST-Applikation gesteigert, nicht während der Laktation (Vicini et al., 1991). Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit denen von Bilby et. al., in denen gezeigt wurde, dass die Verabreichung von rekombinantem bovinen GH (rbGH) zu einem Anstieg des Blut-IGF1 Gehaltes führte (Bilby et al., 1999).

Weitere Experimente zeigten allerdings, dass IGF1 in zahlreichen Organen synthetisiert und auch durch verschiedene lokale und endokrine Faktoren beeinflusst wird (D’Ercole et al., 1980; Le Roith et al., 2001).

Dies führte zu einer modifizierten Form der „Somatomedin-Hypothese“. Der Nachweis der Expression des IGF1-Gens in verschiedenen Geweben prä- und postnatalen Ursprungs bestärkte die Annahme, dass IGF1 eine wichtige Rolle in der Regulation des Wachstums verschiedener Zellen und Gewebe spielt. Dabei kann es lokal auf parakrine und autokrine Weise Einfluss ausüben (Roberts et al., 1987; Han et al., 1988).

Alle diese Erkenntnisse finden sich in der „alternativen Somatomedin-Hypothese“

wieder. Diese beschreibt, dass sowohl endokrines IGF1, als auch lokal produziertes IGF1 auf GH reagieren und dessen Effekte vermitteln. Allerdings wird hier auch die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass sowohl GH, als auch IGF1 unabhängig voneinander, positiv das Wachstum beeinflussen können (Le Roith et al., 2001).

2.5.1. Liganden des IGF-Systems

Die Liganden IGF1 und IGF2 sind sequenzhomologe, einzelkettige Polypeptide mit großer struktureller Ähnlichkeit (50% homolog) zu Pro-Insulin (Le Roith et al., 2001).

Beide können die Aufnahme von Glukose in Fett- und Muskelzellen stimulieren (Rinderknecht und Humbel, 1978). Die Aminosäuresequenz des bovinen IGF1

entspricht der des humanen IGF1, wohingegen bovines IGF2 sich in drei Aminosäureresten von der humanen Variante unterscheidet (Honegger und Humbel, 1986).

Beim Rind konnte die Expression der IGFs in verschiedenen Organsystemen nachgewiesen werden. Unter anderem im Reproduktionstrakt (Geisert et al., 1991;

Kirby et al., 1996; Ohtani et al., 1996; Wathes et al., 1998; Robinson et al., 2000; Meikle et al., 2001; Pershing et al., 2002; Pushpakumara et al., 2002; Llewellyn et al., 2007;

Fenwick et al., 2008; Rhoads et al., 2008), in unterschiedlichen fetalen (Farin et al., 2010) und embryonalen Geweben (Moore et al.,2007) wie auch in der Leber (Fenwick et al., 2008; Rhoads et al., 2008).

2.5.1.1. IGF1

Für IGF1 sind zahlreiche unterschiedliche Funktionen im Organismus beschrieben und aufgrund der Vielfalt ist zu erkennen, dass es eine wichtige Rolle bei vielen verschiedenen Prozessen spielt.

In vitro spielt dieser Wachstumsfaktor eine große Rolle bei der DNA-Synthese und Zellreplikation. Er kann als Progressions-Faktor im Zell-Zyklus bezeichnet werden, dessen Aktivität zu DNA-Synthese und Zellproliferation führt. Außerdem kann IGF1 den Zelltod verhindern, die Zelldifferenzierung fördern und verschiedene Zellen zur Hormonsekretion anregen (Jones und Clemmons, 1995).

Auch in vivo gibt es eine Vielzahl von beschriebenen Wirkungen für IGF1. Unter anderem wurde in Studien festgestellt, dass es nach IGF1-Infusionen zu Hypoglykämie durch Stimulation der Glukose-Aufnahme kommt (Rossetti et al., 1991).

Anabolische Effekte wie eine Beeinflussung der Protein-Synthese und der Stickstoff- Balance wurden ebenfalls nachgewiesen (Jones und Clemmons, 1995).

Versuche mit Mäusen die IGF1-Null-Mutationen aufwiesen zeigten, dass in diesem Fall eine erhöhte neonatale Todesrate vorhanden war und die Tiere nur 60% des normalen Geburtsgewichts hatten. Mäuse, die eine Null-Mutation für sowohl IGF1 als

auch IGF2 aufwiesen, hatten nur noch 30% des normalen Geburtsgewichts und starben innerhalb einiger Minuten post partum (Baker et al., 1993). Da IGF1 in so vielen verschiedene Geweben im Körper produziert wird und an unterschiedlichen Stoffwechselprozessen beteiligt ist, liegt auch eine Beteiligung an der Entstehung vieler Krankheiten, wie unter anderem IUGR (intrauterine growth restriction), neurodegenerativen Erkrankungen, Diabetes oder auch malignen Veränderungen nahe (Monzavi und Cohen, 2002; Cohen, 2006).

2.5.1.2. IGF2

Durch die Sequenzierung eines zweiten, bioaktiven insulin-like Moleküls, das in seiner Struktur ähnlich zu IGF1 war, wurde IGF2 entdeckt und benannt (Rinderknecht und Humbel, 1978).

Bei Versuchen, in denen IGF2-Null-Mutationen bei Mäusen untersucht wurden, zeigte sich, dass diese Tiere nur 60% des üblichen Geburtsgewichts hatten, aber eine normale Überlebensrate. Das plazentare Wachstum bei diesen Tieren war außerdem reduziert und schien unabhängig von IGF1 und IGF1R zu sein (Baker et al., 1993).

2.5.2. Rezeptoren des IGF-Systems

Die Liganden des IGF-Systems können an verschiedene Rezeptoren mit unterschiedlicher Affinität binden. Dazu gehören der Insulin-like growth factor receptor 1 (IGF1R), der Insulin-like growth factor receptor 2 (IGF2R), der Insulin Rezeptor (IR) und der Insulinhybrid Rezeptor (HR).

2.5.2.1. IGF1R

Dieser Rezeptor besteht aus einer extrazellulären α-Untereinheit und einer transmembranären β-Untereinheit, die miteinander durch Disulfidbrücken verbunden sind. Zwei dieser αβ-Halbrezeptoren sind jeweils durch Disulfidbrücken zwischen den α-Untereinheiten miteinander zu einem α2β2-Holorezeptor verbunden. Die Ligandenbindungsspezifität ist durch die Cystein-reichen Regionen in der extrazellulären Domäne der α-Untereinheit gegeben (Jones und Clemmons, 1995).

Die β-Untereinheit besitzt eine ATP-Bindungsstelle und eine cytoplasmatische Tyrosin-Kinase-Domäne, die intrazelluläre Signaltransduktion als Reaktion auf Ligandenbindung vermittelt (Cohen, 2006; Bowman et al., 2010).

Von den möglichen Liganden hat IGF1 die höchste Affinität zu IGF1R, gefolgt von IGF2, Insulin besitzt die geringste Affinität zu diesem Rezeptor (Jones und Clemmons, 1995).

Bindet IGF1 an den IGF1R, kommt es zu einer Autophosphorylierung an Tyrosin- und Serinresten. Bei dem Vorgang, der auch als intramolekulare Transreaktion bezeichnet wird, phosphoryliert die Tyrosin-Kinase einer β-Untereinheit die Reste auf der anderen β-Untereinheit des α2β2-Holorezeptors (Frattali und Pessin, 1993). Die Phosphorylierung des Rezeptors führt zu einer Vermittlung von Signalen ins Zellinnere. Die Bindung von IGF1 verursacht die Phosphorylierung von unter anderem Insulin Rezeptor Substrat 1 (IRS1). Dieses wiederum kann zwei SH2-Domänen besitzende Proteine binden, die Phosphatidylinositol-3 Kinase (PI3K) und das growth factor rebound protein (Grb2), so werden intrazelluläre Signalketten aktiviert (Myers et al., 1992; Giorgetti et al., 1993; O’Connor, 2003). Weiterhin kann es zu einer Aktivierung von den MAPK 42/44 (mitogen activated protein kinases) kommen.

Studien haben zudem ergeben, dass vermutlich sowohl die Tyrosinkinase-Aktivität, als auch die Autophosphorylierung nötig sind, um eine vollständige Aktivierung des IGF1R zu erreichen (Jones und Clemmons, 1995). Auch aktiviert werden können sogenannte stress activated protein kinases (SAPKs), zu denen unter anderem die p38 MAPK (phospho-p38 MAP Kinase) zählt. Dieser Signalweg steht in Zusammenhang mit der Regulation von DNA-Schäden und dem Zell-überleben (Héron-Milhavet et al., 2001).

Die Bedeutung des IGF1R für die physiologische Entwicklung der Nachkommen sowie das Erreichen eines durchschnittlichen Geburtsgewichtes wurde durch Experimente deutlich gemacht, in denen eine Deletion des IGF1R vorgenommen wurde. In Versuchen, bei denen Mäuse IGF1R-Null-Mutationen aufwiesen, zeigten diese ein um 55% geringeres Geburtsgewicht als durchschnittlich und sie starben sofort nach der Geburt (Baker et al., 1993).

2.5.2.2. IGF2R

Dieser Rezeptor wird auch als kationenunabhängiger Mannose-6-Phosphat-Rezeptor bezeichnet, da er Mannose-6-Phosphat Reste an lysosomalen Enzymen bindet (Jones und Clemmons, 1995). Nur ungefähr 10% der IGF2R einer Zelle liegen an der Zelloberfläche. Der Rest befindet sich im Golgi-Apparat oder endo- beziehungsweise lysosomalen Bereichen (Chakraborty et al., 2002). Es ist ein monomerer Rezeptor, der weder Tyrosinkinase-Aktivität noch eine Autophosphorylierungsstelle besitzt. Der IGF2R bindet mit der höchsten Affinität IGF2, während die Affinität zu IGF1 500-fach niedriger ist und Insulin gar nicht gebunden wird (Jones und Clemmons, 1995). Die Bindung von IGF2 an den IGF2R führt zu einer Internalisierung und folgenden Degradation des Wachstumsfaktors (Clairmont und Czech, 1991). Somit kommt es zu einer Entfernung des IGF2 aus dem Kreislauf (Jones und Clemmons, 1995; Forbes und Westwood, 2008). Allerdings gibt es auch Studien, die zu dem Ergebnis kommen, dass auch IGF2R für die Signaltransduktion verantwortlich ist und abweichend von der traditionell beschriebenen Rolle auch Migration, (Chakraborty et al., 2002; Harris et al., 2011) Invasion, (Hamilton et al., 1998) plazentare Angiogenese und vaskuläres remodelling (Herr et al., 2003) vermittelt.

2.5.2.3. HR

Durch die Dimerisierung von IGF1R αβ-Halbrezeptoren mit Insulin αβ-Halbrezeptoren in Anwesenheit von ATP (Adenosintriphosphat), IGF1 oder Insulin kommt es zur Bildung von Hybridrezeptoren (Treadway et al., 1992). Die Affinität von IGF1 und Insulin zum HR entspricht in etwa der zum IGF1R. Sie ist im Fall von IGF1 15-50-fach höher als von Insulin (Jones und Clemmons, 1995). Auch die IGF1R αβ- Halbrezeptoren können IGF1 binden, aber für die Autophosphorylierung und Tyrosinkinase-Aktivität ist die Dimerisierung nötig (Frattali und Pessin, 1993). Da zwei verschiedene Splice-Varianten des Insulin-Rezeptors vorkommen (IR-A und IR-B), kommt es in der Folge zur Ausbildung von zwei Isoformen der Hybridrezeptoren (IGF1/IR-A und IGF1/IR-B). Diese Varianten wurden bis jetzt in allen Zellen vorgefunden, in denen sowohl IGF1R, als auch IR exprimiert werden (Slaaby et al., 2006). Die Affinität von IGF2 zu den beiden Isoformen der Hybridrezeptoren liegt zwischen der von Insulin und IGF1 (Slaaby et al., 2006). Der wichtigste funktionelle Unterschied dieser beiden Isoformen besteht in der hohen Affinität von IGF2 zu IR-A (Belfiore et al., 2009). IR-A wird hauptsächlich während der pränatalen Phase exprimiert und kann so die Effekte von IGF2 auf Embryogenese und fetale Entwicklung steuern, während IR-B vornehmlich in adultem, ausdifferenzierten Gewebe vorzufinden ist (Belfiore et al., 2009).

Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die in erster Linie mitogenen Wirkungen von IGF1 und IGF2 durch den IGF1R vermittelt werden und bei hohen IGF- Konzentrationen auch der IR aktiviert werden kann (Jones und Clemmons, 1995;

Forbes und Westwood, 2008).

2.5.3. IGFBPs

Es gibt sechs hochaffine IGFBPs und eine Reihe von IGFBP-related Proteinen, die eine geringere Affinität zu den Liganden IGF1 und IGF2 haben (Rechler und Clemmons, 1998; Hwa et al., 1999; Monzavi und Cohen, 2002). Diese unterscheiden sich in ihrem molekularen Gewicht, der Anordnung der Aminosäuren, der Verteilung im Organismus und dem unterschiedlich stark ausgeprägten Einfluss auf die IGF- Aktivität. Sie erfüllen verschiedene Aufgaben, wie die Inhibierung aber auch Potenzierung von IGF-Effekten, die Inaktivierung von IGFs oder den Transport der IGF Moleküle zu den Rezeptoren (Kostecka und Blahovec, 1999). Im Serum kommen die Liganden zu etwa 75% als ein gebundener Komplex mit IGFBP3 und einer nicht IGF- bindenden Komponente, dem ALS (acid labile subunit), vor. In diesem biologisch inaktiven, ternären Komplex können sie das vaskuläre System nicht verlassen und ihre Halbwertszeit verlängert sich auf mehrere Stunden. Sind sie frei im Organismus vorhanden, beträgt diese z.B. bei IGF1 nur circa 10 min. Vermutlich kann so ein Pool an verfügbarem IGF1 und IGF2 bereitgehalten werden, der bei Bedarf durch IGFBP3 spaltende Proteasen schnell genutzt werden kann (Jones und Clemmons, 1995).

Dissoziiert der Komplex aus IGFBP3, ALS und dem Liganden, formen die IGFs kleinere, binäre Komplexe mit anderen IGFBPs, die sie durch das Endothel zu den Zielgeweben transportieren (Le Roith et al., 2001). Auch IGFBP5 kann solche ternären Komplexe bilden, es kommt allerdings nur in viel geringerer Menge als IGFBP3 vor.

Alle IGFBPs können auch in freier Form oder wie oben erwähnt als binärer Komplex mit IGF vorliegen (Firth und Baxter, 2002).

Die Affinität der IGFs zu den IGFBPs ist höher, als zu den dazugehörigen Rezeptoren.

Die IGF-Bindungsproteine können sowohl hemmend als auch fördernd auf die IGF- Aktivität wirken. Die Effekte der IGFBPs sind von verschiedenen Faktoren wie unterschiedlichen Proteasen, posttranslationalen Modifikationen oder den unterschiedlichen Lokalisationen der IGFBPs abhängig, welche alle die Affinität zu den Liganden beeinflussen (Jones und Clemmons, 1995). Unter bestimmten Bedingungen, wie zum Beispiel während der Trächtigkeit, werden die IGFBPs anders posttranslational modifiziert, wodurch ihre Affinität zu den IGFs reduziert wird. So ist

eine höhere Bioverfügbarkeit zu diesem Zeitraum vorhanden (Forbes und Westwood, 2008).

Außerdem sind inzwischen auch IGF-unabhängige Wirkungen der IGFBPs bekannt (Jones und Clemmons, 1995). Zu diesen gehören unter anderem Wachstums- Hemmung oder auch direkte Apoptose-Induktion. Vermittelt werden diese Wirkungen durch eigene Rezeptoren wie z.B. den nuclear transcription factor RXR (Lee und Cohen, 2002). Aber auch die Förderung der Motilität und Zelladhäsion (Jones et al., 1993) oder die Beeinflussung des Zellzyklus gehören dazu. Es sind auch IGF1R- unabhängige Wirkungen von IGFBPs beschrieben worden (Firth und Baxter, 2002).

Abb. 3: Darstellung des IGF-Systems mit Liganden, Rezeptoren und IGFBPs.

2.6. Das IGF-System in der Plazenta und im Zusammenhang mit der Fortpflanzung

Es ist bekannt, dass IGF wichtig für die Regulation des fetalen Wachstums ist. Immer mehr Studien deuten darauf hin, dass dieser Effekt über die Förderung der plazentaren Entwicklung und Sicherstellung der Funktion der Plazenta erreicht wird (Sibley et al., 2005; Forbes und Westwood, 2008). Erste Hinweise, dass IGFs an der Regulation des fetalen Wachstums beteiligt sind, gab es, als Messungen von IGF1 im Nabelschnurblut gemacht wurden und sich eine positive Korrelation zwischen Geburtsgewicht und IGF1-Spiegel ergab (Klauwer et al., 1997). Small-for-gestational-age (SGA) Neugeborene hatten erniedrigte und large-for-gestational-age (LGA) Neugeborene hatten erhöhte IGF-Level (Giudice et al., 1995). Durch restriktive Ernährung kann es zu einer Reduktion der IGF1- und IGF2- Konzentrationen im Fetus, der Mutter und der Plazenta kommen. Dies kann zu plazentarer und fetaler Mangelentwicklung führen (Roberts et al., 2008). Bei Versuchen an Meerschweinchen wurde allerdings auch festgestellt, dass die Behandlung mit IGF1 und IGF2 zu einem erhöhtem Geburtsgewicht und erhöhter plazentarer Transportrate führt, wobei IGF2 eher die Morphologie der Plazenta und IGF1 eher die Verteilung der Nährstoffe über die Plazenta beeinflusste (Sferruzzi-Perri et al., 2006). Beide Liganden werden schon von Beginn der Embryonalphase an im Embryo produziert. In der fortgeschrittenen Trächtigkeit ist die Konzentration von IGF2 10-fach höher als die von IGF1 (Daughaday et al., 1982; Jones et al., 1987; Gluckmann und Ambler, 1993), wobei sich dieses Verhältnis nach der Geburt allerdings umkehrt (Jones und Clemmons, 1995).

Außerdem ist der IGF1 Wert bei den Feten niedriger als bei Adulten, steigt jedoch im Laufe der Trächtigkeit an (Gluckmann und Butler, 1983). Ein kritischer Punkt in der Trächtigkeit ist die Angiogenese, welche entscheidend für eine normale Entwicklung von Plazenta und Fetus ist. Studien deuten darauf hin, dass IGF2 für diesen Prozess wichtig ist (Herr et al., 2003). Auch die Menge an vorhandenen IGFBPs scheint ausschlaggebend für die altersgerechte Entwicklung der Feten zu sein (Klauwer et al., 1997). Bei Erkrankungen wie Präeklampsie oder intrauterine growth restriction (IUGR) wurden erhöhte maternale IGFBP1 Spiegel im Blut festgestellt (Forbes und Westwood,

2008). Auch Veränderungen des IGF1R können das fetale Wachstum beeinflussen.

Der IGF1R ist hauptsächlich für die Vermittlung der Wirkungen von IGF1 und IGF2 zuständig. So können Veränderungen dieses Rezeptors durch Wirkungen auf Zellproliferation, Differenzierung oder die Sicherung des Zellüberlebens, das fetale Wachstum beeinflussen (Walenkamp et al., 2006). Der IGF2R ist hauptsächlich für die Entfernung von IGF2 aus der Zirkulation und damit einhergehend, die Inaktivierung, zuständig. Wird er ausgeschaltet oder ist fehlerhaft führt dies zu stark erhöhten Geburtsgewichten bei Neugeborenen (Lau et al., 1994).

Reduziertes fetales Wachstum ist in den meisten Fällen mit abnormer plazentarer Entwicklung verbunden und es wurde schon früh angenommen, dass dies in Zusammenhang mit IGFs steht (Forbes und Westwood, 2008). Bestätigt wurde diese Annahme unter anderem durch Versuche in denen imprinted genes untersucht wurden. Bei Mäusen mit fehlendem Promotor (P0) des igf2 Gens, einem Plazenta- spezifischen Transkript, trat reduzierte fetale Größe kombiniert mit Veränderungen der Plazenta im Bezug auf Morphologie und Größe auf (Constância et al., 2002).

Außerdem wird durch das Fehlen des igf2 Gens erheblich die Transportkapazität der Plazenta beeinträchtigt (Sferruzzi-Perri et al., 2011). Auch beim Rind konnte der Einfluss des IGF-Systems auf die Trächtigkeit nachgewiesen werden. Die Deletion von IGF1 hingegen, führte zu keiner Beeinflussung des plazentaren Gewichts. Erfolgt die Beeinflussung des plazentaren Wachstums am Anfang der Trächtigkeit, kann die Anzahl der Plazentome reduziert werden. Erfolgt die negative Beeinflussung jedoch später, kommt es eher zu einer Veränderung der Größe und der Morphologie der Plazentome (Wathes et al., 1998).

Beide Liganden sind in der Lage, die Entwicklung von kultivierten, präimplantierten Blastozysten zu stimulieren (Kaye et al., 1992). IGF1 und IGF2 werden sowohl im bovinen Uterus, als auch im Konzeptus exprimiert (Geisert et al., 1991; Kirby et al., 1996). Außerdem wurde gezeigt, dass sie beim Schaf in vitro die embryonale Produktion von INF-

τ

die von IGFBP3 im Endometrium des graviden Uterus erniedrigt war (Geisert et al., 1991; Kirby et al., 1996). Eine Studie von Robinson et al. (2000) untersuchte die Expression der einzelnen Faktoren des IGF-Systems im bovinen Uterus. Die stärkste Expression von IGF1 mRNA im bovinen Endometrium wurde im subepithelialen Stroma festgestellt, schwächere Expressionen konnten auch im Myometrium und restlichen Stroma beobachtet werden. IGF2 mRNA war hauptsächlich im karunkulären Stroma zu finden, zu geringeren Teilen aber auch im Myometrium, endometrialen Stroma und uterinen Drüsen. IGF1R mRNA wurde auf einem hohen Niveau in den Drüsen und zu geringeren Teilen im luminalen Epithel exprimiert. Diese Erkenntnisse decken sich, was IGF1 und IGF1R betrifft, auch mit den von Wathes et al. (1998) erhobenen Befunden, dass die IGF1 Konzentrationen während der Trächtigkeit abfallen. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass sich die Expression der Liganden im Verlauf des Zyklus im Endometrium aber auch in Uterusspülungen unterscheiden (Geisert et a., 1991; Ohtani, et al., 1996; Meikle et al., 2001). IGF1R und IGF2R konnten sowohl im Uterus, als auch der Plazenta des Rindes nachgewiesen werden (Robinson et al., 2000; Llewellyn et al., 2008; Richterich, 2008; Wathes et al., 2011).

Auch im Eileiter (Pushpakumara et al., 2002) und fetalen Geweben (Farin et al., 2010) wurden beide Rezeptoren detektiert. Llwellyn et al. untersuchten die Expression verschiedener Mitglieder des IGF-Systems post partum, da sie eine Beteiligung dieser Wachstumsfaktoren am Geschehen der Retentio secundinarum vermuteten. Sie stellten eine Expression von IGF1 mRNA im subepithelialen Stroma sowie im inter- karunkulären und karunkulären Endometrium fest. IGF2 mRNA und IGF1R mRNA wurden im tiefen endometrialen Stroma und Myometrium lokalisiert (Llewellyn et al., 2007).

Viele Studien beschäftigten sich mit dem Zusammenhang von IGF-Expression und dem Ernährungszustand der Kühe post partum. Es wurde nachgewiesen, dass die Konzentration von IGF1 im Blut mit der Energieverfügbarkeit zusammenhängt (Rutter et al., 1989; Spicer et al., 1990). Geraten die Kühe nach der Abkalbung in eine negative Energiebalance, kommt es zu einem Absinken des IGF1 Wertes im Blut (Llewellyn et al., 2007; Wathes et al., 2007). Außerdem wurde berichtet, dass peripartal weniger GH-Rezeptoren in der Leber exprimiert werden, was wiederum zu einem Absinken des

Blut IGF-Wertes führt (Kobayashi et al., 1999; Lucy et al., 2001; Radcliff et al., 2004).

Es wird weiterhin angenommen, dass dieser niedrige IGF1 Wert post partum und damit zu Beginn der Laktation, mit einer erhöhten Anfälligkeit für Krankheiten in Verbindung steht. Als mögliche Erklärung wird angenommen, dass die stimulatorische Wirkung von IGF1 auf neutrophile Granulozyten vermindert sei (Vangroenweghe et al., 2005).

Beim Menschen sind IGF1 und IGF2 ab der 6. Schwangerschaftswoche in allen Zelltypen der Plazenta nachzuweisen (Han et al., 1996). Studien ergaben, dass sowohl IGF1 als auch IGF2 die Proliferation plazentarer Fibroblasten erhöhen und IGF1 die Apoptose von Trophoblasten und Fibroblasten verhindern kann (Miller et al., 2005).

Beide Liganden können außerdem die Trophoblastenmigration und auch -invasion fördern. In der humanen Plazenta ist es von entscheidender Bedeutung, dass Zytotrophoblasten sich zu Synzytiotrophoblasten oder extravillösen Trophoblasten differenzieren. IGF1 reguliert auch diesen Prozess (Forbes und Westwood, 2008), wobei IGF2 eher bei der Regulation des Nährstoffaustauschs eine Rolle zu spielen scheint. Die Oberfläche, über die ein Austausch stattfinden kann, ist bei IGF2 Knock- out Mäusen erniedrigt, genauso wie die Permeabilität für Nährstoffe reduziert ist. Diese Auswirkungen wurden auch bei Meerschweinchen beobachtet (Constância et al., 2005; Sferruzzi-Perri et al., 2006). Allerdings scheinen IGF2 und IGFBP1 beim Menschen eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Migration und Invasion von extravillösen Trophoblasten (Irving und Lala, 1995; Hamilton et al., 1998;

Chakraborty et al., 2000) und der Stimulation eines erhöhten uteroplazentaren Blutflusses zu spielen (Nayak und Giudice, 2003). Andere Studien wiederum zeigten, dass IGFBP1 die durch IGF1 vermittelte Trophoblastenmigration verhinderte. Durch die Multimerisierung von IGFBP1 konnte dieser inhibitorische Effekt von IGFBP1 vermindert werden (Shibuya et al., 2010).

Der IGF1R kommt in allen Zelltypen der humanen Plazenta vor (Holmes et al., 1999).

Der Insulinrezeptor wird in der Plazenta in zwei Isoformen exprimiert, IR-A und IR-B.

Die Affinität von IGF2 zum IR-A im fetalen Gewebe ist genauso groß wie die zum IGF1R. Allerdings werden bei Bindung von IGF2 an den IR-A hauptsächlich mitogene Signale ausgesendet, anders als bei Aktivierung durch Insulin (Frasca et al., 1999).

Das Zusammenspiel von IGF2 und IR-A könnte erklären, warum Versuchstiere, denen

sowohl IGF1R als auch IGF2 fehlen, sehr viel stärker in ihrem fetalen Wachstum eingeschränkt sind, als die Tiere, denen nur IGF1R fehlt (Baker et al., 1993).

Das IGF-System ist auch für die hormonelle Steuerung in der Trächtigkeit von entscheidender Bedeutung. So werden unter anderem die Wirkungen von Östradiol und Progesteron durch das IGF-System beeinflusst (Bowman et al., 2010). Aber auch in entgegen gesetzter Richtung ist eine Beeinflussung möglich, da z.B. Cortisol und Schilddrüsenhormone einen Einfluss auf IGF1 und IGF2 zu haben scheinen (Fowden, 2003).

Die Wachstumsfaktoren vermitteln ihre Wirkungen, wie bereits erwähnt, über intrazelluläre Signalkaskaden. Die Kenntnis dieser Wege in der Zelle ist wichtig, da sie mögliche Angriffspunkte in der Therapie verschiedener Dysregulationen in der Trächtigkeit darstellen (Forbes und Westwood, 2010). In Versuchen an Mäusen wurde festgestellt, dass MAPK essentiell für eine normale Entwicklung der Plazenta sind. In der humanen Plazenta werden sie im Trophoblasten exprimiert und sind unter anderem für die Entwicklung von einzelnen Trophoblasten zu Synzytien verantwortlich (Kita et al., 2003; Daoud et a., 2005). Sie stellen den Hauptsignalweg nach Aktivierung durch Wachstumsfaktoren dar (Forbes und Westwood, 2010). Die p38 MAPK schien in vielen Versuchen nur für die Vermittlung von Stresssignalen in der Plazenta verantwortlich zu sein (Renaud et al., 2009). Neuere Ergebnisse zeigen aber, dass sie auch Signale von Wachstumsfaktoren vermittelt (Forbes und Westwood, 2010). Von anderen Geweben ist bekannt, dass durch Aktivierung des IGF1R das Insulinrezeptorsubstrat (IRS) phosphoryliert und somit aktiviert wird, was wiederum zu einer Aktivierung von PI3K/Akt (Akt Kinase) führt. Für Akt ist bekannt, dass es bei Nagern für die Regulation von fetalem Wachstum und die Entwicklung der Plazenta wichtig ist (Forbes und Westwood, 2008).

2.7. IRS-Proteine

Die IRS-Proteine sind eine Gruppe von zytoplasmatischen Adaptor-Proteinen, die Signale von IGF1, Insulin und verschiedenen Zytokinen vermitteln. Unter anderem sind sie auch für Signalvermittlung der Rezeptorsysteme der IL6 Familie (Interleukin 6), der IL2 Familie (Interleukin 2) und der Interferone zuständig (White, 1997). Dies geschieht insbesondere über IGF1R und IR (White, 1998; Karas et al., 2001; Chitnis et al., 2008;

Shaw, 2011). Bis jetzt wurden sechs verschiedene IRS-Proteine identifiziert (White, 1985; Cai et al., 2003; Boller et al., 2012). IRS1 und IRS2 werden beim Menschen ubiquitär exprimiert und sind die hauptsächlichen Vermittler Insulin-abhängiger Wirkungen der Regulation des Glukosestoffwechsels (White, 2002). IRS1 wird in allen Zelltypen von Mäuseembryonen der Periimplantationsphase exprimiert (Puscheck et al., 1998). Außerdem wird im humanen Organismus auch IRS4 exprimiert, allerdings nur in einigen Geweben, vor allem in Gehirn, Niere, Thymus und Leber (Lavan et al., 1997). IRS3 hingegen wurde bis jetzt nur bei Nagern identifiziert (Boller et al., 2012).

Es bestehen Unterschiede in der subzellulären Lokalisierung der Mitglieder dieser Gruppe. In den Adipozyten sind IRS1 und IRS2 vor allen Dingen in den Mikrosomen zu finden, während IRS3 eher an der Plasmamembran angesiedelt ist (Anai et al., 1998). Die IRS-Proteine haben keine intrinsische Enzymaktivität, sondern vermitteln die Signale von IGF1R und IR, indem sie als Proteingerüste fungieren, die Signalkomplexe organisieren (Sun et al., 1991). Eine wichtige Funktion der IRS- Proteine ist die Aktivierung der PI3K und anschließend der Akt (Okada et al., 1994;

Robey und Hay, 2009). IRS binden an Proteine mit SH2 Domänen (Src homology 2), wie z.B. Shc, Nck (non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1), Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2) oder die p85 Untereinheit der PI3K. Über diese Protein-Protein-Interaktionen wird die Aktivierung verschiedener Signalwege sichergestellt, mit denen die spezifischen biologischen Aktivitäten von IGFs vermittelt werden (White, 1997; Lassarre und Ricort, 2003; Tsuruzoe et al., 2001). Die IRS- Proteine scheinen verschiedene Aufgaben zu übernehmen und für viele verschiedene physiologische Prozesse von Bedeutung zu sein. Dazu gehören unter anderem der Kohlenhydratstoffwechsel und die ß-Zellfunktion im Pankreas (Withers et al., 1999),

aber auch das somatische Zellwachstum (Brüning et al., 1997) und die weibliche Reproduktion (Burks et al., 2000). Für einige Zellen ist beschrieben, dass IRS1 nach Aktivierung durch den IGF1R Zellproliferation vermittelt (O’Connor, 2003; Byron et al., 2006), während IRS2 die Motilität stimuliert (Byron et al., 2006). Aber auch IRS2 scheint für die Proliferation von Bedeutung zu sein (Lingohr et al., 2002). Aus verschiedenen Versuchen ist bekannt, dass diese beiden Adaptorproteine eine wichtige Rolle in der Vermittlung der IGF1 Signale spielen und nicht ohne weiteres austauschbar sind. Deletion von IRS1 z.B. führt zu intrauteriner growth restriction (IUGR) und peripherer Insulinresistenz. Die Deletion von IRS2 wiederum führt zu Insulin-Resistenz und einer defekten Entwicklung von ß-Zellen im Pankreas, die ihrerseits einen Diabetes verursachen (Tsuruzoe et al., 2001). Die bis jetzt noch nicht so gut charakterisierten IRS3 und IRS4 könnten die IGF1R Funktion aber auch durch die Modulation der Expression von IRS1 und IRS2 Proteinen indirekt beeinflussen (Tsuruzoe et al. 2001; Tseng et al., 2003) Ob IRS4, genauso wie IRS1, mitogene Signale vermittelt, ist umstritten (Tsuruzoe et al., 2001). Mäuse, denen IRS3 oder IRS4 fehlen, haben keine augenscheinlichen Phänotypen, im Gegensatz zu IRS1- oder IRS2-knockout Mäusen (Liu et al., 1999; Fantin et al., 2000). Für IRS5 (DOK4) ist bekannt, dass dieses nach Phosphorylierung durch IGF1-Signale den MAPK Signalweg aktiviert. Auch IRS6 (DOK5) kann durch IGF1 aktiviert werden. Weitere Details zu diesen beiden Vertretern müssen aber noch erforscht werden (Cai et al., 2003). Außerdem sollte bedacht werden, dass sie nur entfernt ähnlich zu den restlichen IRS-Proteinen sind (Versteyhe et al., 2010).

2.8. EGF

EGF gehört ebenfalls zu den Wachstumsfaktoren und übernimmt mitogene Rollen in vielen verschiedenen Organen (Casalini et al., 2004), unter anderem auch im Zusammenhang mit der Regulation von fetalem Wachstum und Entwicklung (Forbes und Westwood, 2010). Die Wirkung von EGF (Epidermal growth factor) wird durch den EGFR (Epidermal growth factor receptor) vermittelt. Nach Bindung des Liganden kommt es zu intrinsischer Tyrosin Phosphorylierung und nachfolgender Aktivierung promitogener Signalmoleküle (Prenzel et al., 2001), wie z.B. MAPK, Akt, p38 MAPK oder PI3K (Oda et al., 2005; LaMarca et al., 2008). Veränderungen des EGFR führen zu reduzierter plazentarer und fetaler Entwicklung sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen (Fondacci et al., 1994; Dackor et al., 2009). Unterstützt wurden diese Annahmen durch Versuche, in denen gezeigt werden konnte, dass die Konzentration maternalen EGFs mit dem fetalen Wachstum korreliert (Kamei et al., 1999), und Mäuse ohne EGFR signifikant kleinere Plazenten aufwiesen (Miettinen et al., 1995).

Belege für die Wichtigkeit von EGF bei der Regulation von plazentarer Funktion und Entwicklung beim Menschen kommen auch aus vielen in vitro Studien, in denen nachgewiesen wurde, dass EGF die Trophoblastendifferenzierung (Barnea et al., 1990; Garcia-Lloret et al., 1996), -proliferation (Li und Zhuang, 1997) und -motilität stimuliert (LaMarca et al., 2008) sowie die Apoptose der Trophoblasten verhindert (Johnstone et al., 2005; Moll et al., 2007). Auch für das Rind konnte gezeigt werden, dass EGF die Motilität und Proliferation von fetalen Trophoblastzellen fördert (Dilly et al., 2010; Hambruch et al., 2010).

EGF wird in der bovinen Plazenta ubiquitär, der EGFR im Trophoblasten und im maternalen Epithel exprimiert (Weise, 2001). Auch in Blastozysten und dem Endometrium des Rindes konnte EGF nachgewiesen werden (Ohtani et al., 1996;

Kliem et al., 1998). In vitro konnte der EGFR in bovinen fetalen Trophoblastzellen nachgewiesen werden (Dilly et al., 2010).

In verschiedenen Arbeiten, wird von synergistischen Wirkungen zwischen IGF1 und EGF berichtet (Qureshi et al., 1997), wobei verschiedene Interaktionen denkbar sind und diskutiert werden. Dies wird in Kapitel 5.1. weiter ausgeführt.

3. Material und Methoden

Alle benutzten Reagenzien und Materialien sowie die Zusammensetzungen der Puffer und Lösungen werden im Anhang beschrieben.

3.1. In vitro Versuche

3.1.1. Zelllinien

Im Rahmen dieser Arbeit wurden in den Versuchen vier verschiedene bovine, plazentare Zelllinien untersucht: BCEC (bovine Karunkelepithelzellen), F3 (fetale Trophoblasten), bovine plazentare Fibroblasten und BUVEC (bovine Endothelzellen der Nabelvene). BCEC (Bridger et al., 2007), F3-Zellen (Hambruch et al., 2010) und Fibroblasten (Häger et al., 2010) waren als permanente Zelllinien im Labor vorhanden.

Diese waren bei -150°C in DMSO/FCS eingefroren (100µl DMSO, 100µl FCS und 800µl Zellsuspension) und wurden bei Bedarf aufgetaut und fortlaufend kultiviert (siehe 3.1.3.). Die Isolation der BUVEC ist unter 3.1.2. beschrieben.

3.1.2. Isolation BUVEC

Für die Isolation von BUVEC wurden ungefähr im 4./5. Monat trächtige Uteri vom Schlachthof verwendet. Nach Eröffnung der Uteri mit einer sterilen Schere wurde die jeweilige Nabelschnur abgetrennt und in ein Becherglas mit Hanks Balanced Salt Solution (Hanks BSS) gegeben. Die folgenden Schritte fanden alle unter der sterilen Werkbank statt. Aus der Nabelschnur wurden die Blutgefäße von der Wharton’schen Sulze befreit und anschließend die Arterien verworfen. In die Venen wurde ein Katheter eingeführt und diese mit ca. 5ml Hanks BSS gespült. Anschließend wurde

durch denselben Katheter eine Spülung mit einer zuvor hergestellten Kollagenase Lösung (0,025% in Hanks mit Ca²⁺/Mg²⁺) durchgeführt. Waren die Venen komplett mit Kollagenase Lösung gefüllt, wurden sie an beiden Enden abgeklemmt und in diesem Zustand für 20min in den Inkubator (37°C, 5%CO2) verbracht. Nach dieser Zeit wurden die Venen aus dem Inkubator geholt und über ein mit einigen ml Hanks BSS befülltes 50ml Reaktionsgefäß gehalten, die Klemmen gelöst und eine Spülung mit FCS (Fetal Calf Serum) durchgeführt. Die so gewonnene Suspension wurde zentrifugiert (5min, 1000rpm, 23,5°C).

Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 10ml EBM (Endothelzell-Basal- Medium) resuspendiert. Die Aussaat erfolgte in 75cm² Zellkulturflaschen. Am Ende wurde eine optische Kontrolle der Zellen unter dem Mikroskop vorgenommen, bevor sie in den Inkubator verbracht wurden.

Nach 24h wurde ein Mediumwechsel vorgenommen, der von da an alle drei Tage wiederholt wurde. Zur Charakterisierung der BUVEC erfolgte ein Nachweis der erhöhten Aufnahme von acetyliertem LDL (Low Density Lipoprotein) (siehe 3.1.5).

3.1.3. Kultivierung der Zellen

Die Zellen (BCEC, F3, Fibroblasten) wurden in 75 cm² Zellkulturflaschen bei 37°C und 5%CO2 in FSM (Vollmedium), bzw. die BUVEC in EBM (Endothelzell-Basal-Medium) kultiviert. Nach ca. einer Woche erreichten die Zellen eine 90%ige Konfluenz und wurden daraufhin passagiert. Hierbei wurden die Zellen voneinander und von der Zellkulturflasche abgelöst und konnten dann in eine neue Zellkulturflasche überführt werden oder für die verschiedenen Versuchsreihen genutzt werden. Zur Passage wurde das in der Flasche vorhandene Medium abgesaugt und 5ml steriles PEM (PBS mit 2mM EDTA) hineingegeben. Bei F3, Fibroblasten und BUVEC erfolgte eine kurze Spülung mit PEM, welches dann wieder entfernt wurde. BCEC wurden mit dem PEM für 6 min in den Inkubator gegeben. Hiermit sollten Reste des FSM ausgespült werden und Ca²⁺-abhängige Zelladhäsionsmoleküle inhibiert werden. Das PEM wurde dann aus der Flasche abgenommen. Im nächsten Schritt wurden 3ml Trypsin hinzugefügt

und die Zellen unter den bereits angegebenen Bedingungen, für 4-6min inkubiert, um die Zelladhäsion aufzuheben. Nach diesem Zeitraum wurde die Zellkulturflasche aus dem Inkubator genommen, vorsichtig geschwenkt und leicht dagegen geklopft um die Ablösung der Zellen in die Flüssigkeit zu erleichtern. Nach mikroskopischer Kontrolle, ob sich die Zellen vollständig abgelöst hatten, erfolgte eine Zugabe von 7ml FSM/EBM.

Die gesamt Lösung wurde in ein 15ml Röhrchen überführt und anschließend bei 900rpm und RT für 4min zentrifugiert. Das so gewonnene Zellpellet wurde, nach Entfernung des Überstandes, mit FSM/EBM resuspendiert. Je nach gewünschter Verdünnung erfolgte dann die Aussaat der Zellen in FSM/EBM in die Zellkulturflaschen. Der Mediumwechsel wurde am folgenden Tag und daraufhin alle 2 Tage unter sterilen Bedingungen vorgenommen. Die BUVEC wurden, im Gegensatz zu den BCEC, F3-Zellen und Fibroblasten, nur in der Primärkultur verwendet (Passage 0-1).

3.1.4. LDL-Färbung

Zur Charakterisierung der Endothelzellen, BUVEC, wurde die erhöhte Aufnahme von acetyliertem LDL (Ac-LDL) nachgewiesen. Diese Methode schloss sich der Isolierung an. Die Endothelzellen sind in der Lage, acetyliertes LDL in vermehrtem Umfang aufzunehmen und im Zytoplasma anzureichern. Das verwendete Ac-LDL ist an den Fluoreszenzfarbstoff 1,1’Dioctaldecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbozyanin Perchlorat (Dil) gekoppelt. Nach erfolgter Aufnahme durch die Zelle, wird das Ac-LDL-Dil durch lysosomale Enzyme gespalten und der fluoreszierende Farbstoff reichert sich an der Membran des Lysosoms an (Voyta et al., 1984). Diese Anlagerungen sind mittels Fluoreszenzmikroskopie als punktförmige, perinukleäre Bereiche zu identifizieren. Ihr Auftreten gilt als Nachweis für die erfolgreiche Isolation von Endothelzellen.

Hierfür wurden die BUVEC passagiert und ein Teil der Zellsuspension auf Deckgläschen in einer 24 well-Platte aufgebracht. Mit 500µl EBM wurden sie für 2-3d in den Inkubator verbracht (37°C, 5%CO2). Nach diesem Zeitraum wurde das EBM abgenommen und 300µl/well LDL-Farbstoff in einer Verdünnung von 10µg/ml (in EBM)

aufgetragen. Die Zellen wurden abermals für 4h inkubiert (37°C, 5%CO2). Nach dem Abnehmen des Farbstoffs erfolgte eine Spülung mit PBS1x. Im nächsten Schritt wurde 500µl/well Hoechst-Farbstoff 33342 (5mg/ml) in einer Verdünnung von 1:15.000 (in PBS1x) aufgetragen und wirkte 10min auf dem Schüttler ein. Überschüssige Reste wurden durch mehrmaliges Waschen mit PBS1x entfernt. Die Deckgläschen wurden mit Prolong Antifade auf Objektträgern befestigt und über Nacht trocknen gelassen.

Am darauf folgenden Tag erfolgte die Kontrolle unter dem Fluoreszenz Mikroskop (Carl Zeiss Vision®, MTB 2004).

3.1.5. Quantifizierung der Zellen

Hierfür wurde das Zellpellet nach der Passage mit einer Menge von 5-8ml Medium resuspendiert. Zur zuverlässigen Quantifizierung der Zellen wurde eine Neubauer- Zählkammer verwendet. Vor dem Gebrauch wurde ein Deckgläschen auf die Grundplatte aufgelegt und der korrekte Sitz durch Auftreten von Newtonschen Interferenzfarben bestätigt. Nach Mischen von Zellpellet und Medium wurden 10µl dieser Suspension abgenommen und in die Neubauer-Zählkammer gegeben. Unter dem Lichtmikroskop, bei Durchlicht und 10-facher Vergrößerung, wurden vitale Zellen in den Zählfeldern ausgezählt, wobei pro Auszählung eines Quadrates nur zwei Grenzlinien verwendet wurden, um doppelte Zählung zu vermeiden. Aus Anzahl der Zellen und dem Volumen wurde abschließend die Zellmenge errechnet.

3.1.6. Proliferations-Assay

Die jeweils zu untersuchenden Zellen wurden passagiert, gezählt (siehe 3.1.5.) und in 96 well-Platten (F3, Fibroblasten) bzw. 24 well-Platten (BCEC) ausgesät. BUVEC wurden von den Proliferations-Assays mit kombinierten Stimulationen ausgeschlossen, da sie in den Vorversuchen auf keine Stimulation reagierten.

Tab. 1: Verwendete Zellzahlen/well und Zelllinie im Proliferations-Assay

Zelllinie Zellzahl/well

BCEC 15.000

F3 10.000

Fibroblasten 10.000

Nach 24h (37°C und 5%CO2) wurde das FSM durch SFM (serum free medium) für 4h ersetzt, um eine Beeinflussung durch die Bestandteile des FSM ausschließen zu können. Nach diesem Serum-Entzug folgte die Stimulation mit den unterschiedlichen Wachstumsfaktoren. Diese wurden in der jeweiligen Konzentration (Tab. 2) in SFM/EBM 1% angesetzt und jeweils 100µl (96 well-Platte)/500µl (24 well-Platte) pro well appliziert. Die genannten Konzentrationen wurden in Vorversuchen als am besten geeignet ermittelt, genauso wie die Stimulationszeit von insgesamt 48h.

Tab. 2: Konzentrationen der untersuchten Wachstumsfaktoren im MTT-Assay und Live Cell Imaging

Zelllinie

Wachstumsfaktor

IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF

BCEC 100ng/ml 100+20ng/ml 20ng/ml 50ng/ml 50+20ng/ml F3 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml Fibroblasten 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml

Nach weiteren 24h wurde die Stimulation wiederholt. Zum späteren Bezug wurde SFM zu einer Gruppe von Zellen gegeben. Als interne Kontrolle wurde eine Gruppe von Zellen mit FSM geführt.