Expression von IRS1 und IRS2 im interplazentomaren Gewebe und Vergleich mit IGF1 und IGF2

Die Untersuchung der interplazentomaren Proben ergab folgendes Expressionsmuster für IRS1: am stärksten angefärbt waren die uterinen Drüsen, während das luminale Epithel variabel angefärbt war, im Bereich der Glykokalix jedoch immer deutlich. Denkbar ist, dass im Uteruslumen eine hohe Konzentration an IGF vorhanden gewesen ist, welches auf das Epithel eingewirkt hat. So könnte es zu der IRS1-Expression gekommen sein. Darauf deutet der Nachweis dieses Proteins in der direkten Kontaktzone, nämlich der apikalen Membran hin. Die Intensität der Expression im Epithel könnte allerdings auch durch die Individualität des Trächtigkeitsverlaufes bedingt sein. Denn der vom Versuchsablauf vorgegebene Tag der Probenentnahme, könnte je nach Tier, unterschiedlich weit vom natürlichen Zeitpunkt der Geburt entfernt sein, bzw. die Geburt fand spontan statt im Gegensatz zur Sectio caesarea. Das Stratum reticulare, das Myometrium, die Venen und meist auch das Stratum compactum wiesen keine Expression von IRS1 auf. Bei einigen Tieren konnten jedoch in aufgelockerten Bereichen, vermutlich ödematöse Bezirke, und um Immunzellen herum positive Areale festgestellt werden. Außerdem konnte eine IRS1 Expression in der Tunica interna der Arterien und in kleinen Blutgefäßen im Myometrium gezeigt werden. Die Immunzellen waren abermals nicht einheitlich angefärbt.

Auch IRS2 wurde am stärksten in den uterinen Drüsen exprimiert. Das uterine Epithel zeigte eine variable Reaktion, in den meisten Fällen war jedoch eine Expression festzustellen. Auch hier gelten die Überlegungen zum tatsächlichen Zeitpunkt im Trächtigkeitsverlau, wie bei IRS1, die Expressionsstärke betreffend. Sowohl das Stratum compactum als auch das Stratum reticulare wiesen unterschiedlich gefärbte Bereiche auf. Im Stratum compactum waren vornehmlich Fibrozyten und Immunzellen positiv angefärbt, während im Stratum reticulare negative Bereiche um Drüsen und Blutgefäße herum auffielen. Bei den Blutgefäßen wies nur das Endothel der Arterien eine IRS2-Expression auf. Das Myometrium war schwach positiv bis positiv angefärbt, auffällig war jedoch bei vielen Tieren das deutlich angefärbte Bindegewebe zwischen

den Muskelzellen. Die Expression von IRS2 in den Immunzellen war abermals unterschiedlich.

Damit werden IRS1 und IRS2 hauptsächlich in den uterinen Drüsen exprimiert. Im Vergleich zur IGF1 und IGF2 Expression an dieser Lokalisation fallen verschiedene Dinge auf. Sowohl IGF1 als auch IGF2 sind in hohem Maße im Epithel, den Drüsen und im Stratum compactum zu finden. Das Myometrium und die Blutgefäße sind hingegen nur positiv für IGF1 (Lütkehus, 2012). Die Liganden des IGF-Systems sind also fast im gesamten Uterus bis auf das Stratum reticulare vertreten. Eine Übereinstimmung kann für IRS1 und IRS2 in den uterinen Drüsen und im Stratum reticulare festgestellt werden, das Epithel ist nur bei einigen Tieren deutlich positiv für IRS1 und IRS2. Abweichende Ergebnisse zwischen den IRS-Proteinen und den IGFs sind folglich im Stratum compactum, und Myometrium vorzufinden.

Übereinstimmende Ergebnisse im Uterus deuten auf einen Gebrauch der IRS1- und IRS2-Proteine in der IGF-Signalkaskade der betroffenen Zellpopulationen. Das größtenteils negativ angefärbte Stratum reticulare lässt vermuten, dass zu beiden Zeitpunkten der Probenentnahme keine IGF-Signale über die Adaptormoleküle IRS1 und IRS2 abliefen. Die im Stratum reticulare, Myometrium und Stratum compactum voneinander abweichenden Ergebnisse lassen auf eine Verwendung anderer intrazellulärer Signalmoleküle schließen. In Betracht kämen unter anderem auch IRS3 und IRS4, deren Rolle beim Rind noch nicht weiter untersucht ist (Tsuruzoe et al., 2001). Geklärt werden müsste, ob diese beiden Adaptorproteine im Reproduktionstrakt des Rindes vorkommen. Bislang ist bekannt, dass sie nicht in allen Geweben vorhanden sind, bzw. IRS3 bislang erst beim Nager identifiziert wurde (Lavan et al., 1997; Boller et al., 2012). In der durchgeführten RT-PCR wurde allerdings IRS3 in den in vitro kultivierten Fibroblasten nachgewiesen.

Der Grund für die unterschiedlich starken Immunreaktionen einzelner Tiere, aber auch von IGF1 und IRS2, könnte der Östrogenspiegel sein. Es erscheint wahrscheinlich, dass Östrogene, nach Aktivierung des IGF1R durch IGF, für eine Modifizierung des IRS2 verantwortlich sind. Denkbar wären Vorgänge wie eine Phosphorylierung, die wiederum zu Ubiquitinierung oder Degradation führen könnte. Durch diesen Mechanismus könnten IRS2-Signale im Uterus inhibiert werden. Bei Mäusen wurde

die IRS2-Expression im Uterus durch Östrogene reduziert. Dieser Prozess lief vornehmlich posttranslational ab und war einerseits abhängig von proteosomalen Proteasen und IGF1, aber andererseits nicht allein abhängig vom IRS1-PI3K Signalweg (Richards et al., 2001). Der Einfluss von Östrogenen auf IGF1 wurde auch in den Arbeiten von Ohtani (1996) und Robinson (2000) bestätigt. Da bei den von uns gewählten Versuchstieren, bedingt durch die späte Phase der Trächtigkeit (bzw. die Geburt), der Östrogenspiegel Maximalwerte aufwies (Holzhausen, 2012), käme diese Erklärung in Betracht. Allerdings konnten in der erwähnten Studie von Holzhausen (2012), in der 17ß-Östradiol im Serum bestimmt wurde, kein signifikanter Unterschied zwischen der IGF-low- und der IGF-high-Gruppe gemessen werden. Der Einfluss von steroidalen Hormonen auf die Expression von Bestandteilen des IGF-Systems wird schon lange diskutiert. So existieren Arbeiten, in denen eine Beeinflussung des IGF-Systems durch steroidale Hormone beim Rind nachgewiesen werden konnte (Ohtani et al., 1996; Robinson et al., 2000), neben solchen, in denen dies aber nicht gelang (Geisert et al., 1991). Es wurde im Rahmen der letztgenannten Arbeit aber festgestellt, dass östrogenbedingt ein vermehrter Transport von IGF aus dem Blutkreislauf in das Uteruslumen hinein erfolgt (Geisert et al., 1991). Dies müsste zur Konsequenz haben, dass von hier ausgehend auch die IRS-Signalkette in Gang gesetzt wird. Neben Östrogen ist auch Progesteron in der Lage, den IRS2-Spiegel zu beeinflussen. Dieser Vorgang ist auf Zellen mit Progesteron-Rezeptor beschränkt und vermag nicht auf den IRS1-Spiegel einzuwirken. Gleichzeitig wird aber das IRS1/IRS2-Mengenverhältnis verändert. Durch die Beeinflussung von IRS2 kann Progesteron so also in die Signalwege von IGF1, Insulin und verschiedenen anderen Zytokinen eingreifen (Vaßen et al., 1999; Vaßen et al., 1999 (2)).

5.7. Schlussfolgerung

Das Vorhandensein der einzelnen Komponenten des IGF-Systems in Uterus und Plazenta des Rindes (Wathes et al., 1998; Robinson et al., 2000; Richterich, 2008;

Lütkehus, 2012) lassen darauf schließen, dass sie eine wichtige Rolle während der Trächtigkeit, aber auch der folgenden Regeneration spielen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass IGF1 und IGF2 positiven Einfluss auf die Proliferation und Motilität boviner Zellen plazentaren Ursprungs hatten. Beide Vorgänge sind für eine erfolgreiche Trächtigkeit von entscheidender Bedeutung. Auch Wechselwirkungen mit EGF waren ersichtlich. Die Erkenntnis, dass MAPK, Akt und p38 MAPK an der intrazellulären Signalvermittlung beteiligt sind und der Nachweis von IRS1 und IRS2, welche intrazelluläre Signalvermittler nach Aktivierung von IGF sind, in Teilen von Uterus und Plazenta bieten für die Zukunft mögliche Startpunkte für die Entwicklung prophylaktischer und therapeutischer Maßnahmen. Dies ist von Bedeutung, da verschiedene Studien zu dem Schluss kamen, dass die IGF-Komponenten Einfluss auf die postpartale Heilung haben (Vangroenweghe et al., 2005; Piechotta et al., 2012). Daher sind weitergehende Untersuchungen in Bezug auf die Eignung von IRS1 und IRS2 als Marker zur prophylaktischen Diagnostik puerperaler Erkrankungen beim Rind und zur genauen Kommunikation zwischen den potenten Wachstumsfaktoren IGF1/IGF2 und EGF denkbar und wünschenswert.

6. Zusammenfassung

„Charakterisierung des bovinen plazentaren Insulin-like growth factor Systems in vitro und der peripartalen Expression von IRS1 und IRS2 im Plazentom und in interplazentomaren Bereichen des Rindes in vivo.“ Von Lisa Lenz (Helmstedt)

Postpartale Erkrankungen des Uterus spielen bei den heutigen Hochleistungs-Milchkühen eine große Rolle, da sie zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten führen.

Hierbei wird eine Beteiligung des Systems vermutet, da veränderte IGF-Serumspiegel mit negativer Energie-Balance und einem erhöhten Risiko von einer puerperalen Erkrankung betroffen zu sein vergesellschaftet sind (Wathes et al., 2009;

Piechotta et al., 2012). Nach der Lokalisation von Mitgliedern des IGF-Systems im Reproduktionstrakt des Rindes (Robinson et al., 2000; Richterich, 2008; Lütkehus, 2012) ist das Ziel der vorliegenden Studie, die der IGF Signalgebung zugrundeliegenden Mechanismen auf in vitro Ebene zu erforschen.

Hierfür wurden bovine plazentäre Zelllinien (BCEC, F3, Fibroblasten) mit IGF1 und IGF2 alleine, beziehungsweise in Kombination mit EGF stimuliert und die Wirkungen auf die Zellproliferation und Motilität untersucht. Die intrazelluläre Signalvermittlung wurde mittels Western Blot über die Aktivierung der MAP Kinase 42/44, Akt-Kinase und p38 MAP Kinase analysiert.

Da nach Aktivierung des IGF1R die Adaptorproteine IRS1 und IRS2 für die Signalvermittlung in der Zelle entscheidend sind, wurden diese im Plazentom und in interplazentomaren Bereichen des Rindes mittels Immunhistochemie lokalisiert. Das Material wurde am 275. Tag der Trächtigkeit während einer Sectio caesarea oder nach spontan erfolgter Geburt, normalem Abgang der Nachgeburt und Instillation von LPS-Lösung in den Uterus mit anschließender Euthanasie entnommen. Beide Gruppen wurden zusätzlich anhand ihrer IGF1-Blutspiegel noch in IGF-high und IGF-low Tiere eingeteilt.

In Vitro kam es bei den BCEC, F3 Zellen und Fibroblasten nach Stimulation mit IGF1 und IGF1+EGF zu einer signifikant höheren Steigerung der Proliferation. IGF2

vermochte die Proliferation von F3 Zellen und Fibroblasten signifikant zu steigern. Die Kombination von IGF2+EGF führte bei den untersuchten Zelllinien ebenfalls zu einer signifikant höheren Proliferation, während EGF ausschließlich die Proliferation von F3 Zellen signifikant steigern konnte. Hervorzuheben ist, dass die Kombination von IGF2 +EGF bei den BCEC diese signifikante Steigerung erreichen konnte, obwohl die Stoffe einzeln nicht dazu in der Lage waren. Bei den F3 Zellen hingegen war eine antagonistische Wirkung festzustellen. IGF2+EGF verursachten eine signifikant schwächere Proliferation im Vergleich mit EGF, wenn auch signifikant höher als die Wachstumskontrolle.

Bei den BCEC wurde mit jeder Stimulation eine signifikante Steigerung der Motilität erreicht. IGF1 und IGF2+EGF verursachten eine signifikante Steigerung bei den F3 Zellen und den Fibroblasten, ebenso wie IGF1+EGF bei den F3 Zellen und IGF2 bei den Fibroblasten. Bei den F3 Zellen kam es durch Kombination von IGF2 und EGF zu einem synergistischen Effekt, die Motilität war signifikant höher als nach Stimulation mit den einzelnen Wachstumsfaktoren. Bei den Fibroblasten kam es hingegen durch das Zusammenwirken von IGF1+EGF zu einem antagonistischen Effekt.

Die Untersuchung der intrazellulären Signalwege brachte folgende Ergebnisse: bei den F3 Zellen wurden die MAP-Kinase 42/44 und die Akt Kinase durch alle eingesetzten Stimulantien aktiviert. Die p38 MAPKinase erfuhr durch Stimulation mit IGF1+EGF, EGF und IGF2+EGF eine Aktivierung. Bei den Fibroblasten kam es durch jede Stimulation zu einer Aktivierung aller untersuchten Kinasen. Die MAP-Kinase 42/44 und die p38 MAP Kinase wurden bei den BCEC durch IGF1+EGF, EGF und IGF2+EGF aktiviert, die Akt Kinase durch EGF. Es ist erkennbar, dass bei den F3 Zellen und den BCEC die Wirkung von EGF überwiegt.

Im Folgenden werden die immunhistochemischen Färbungen der Plazentome betrachtet. Die Orte der stärksten Expression waren für sowohl IRS1 als auch IRS2 die mononukleären Trophoblasten. IRS2 wurde in gleichem Maße auch im fetalen Mesenchym exprimiert. Auf maternaler Seite waren nur schwache bis negative Expression auszumachen, bis auf die Arterien, welche positiv angefärbt waren. In den interplazentomaren Proben wurde eine deutliche Expression von IRS1 und IRS2 in den uterinen Drüsen festgestellt. Das luminale Epithel wies eine von negativ bis positiv

ausfallende Expression beider Adaptormoleküle auf. Auffällig war eine sehr starke Anfärbung der darauf sitzenden apikalen Membran bei IRS1. Auch die Arterien waren wieder positiv, im Gegensatz zu den Venen. Die Immunzellen zeigten für beide Antikörper sowohl im Plazentom, als auch im interplazentomaren Bereich eine variable Anfärbung.

Die Ergebnisse lassen auf zellspezifische Aufgaben der beiden Adaptormoleküle IRS1 und IRS2 in den peripartalen Umbauvorgängen im Uterus schließen.

Insgesamt betrachtet lassen die Ergebnisse dieser Arbeit den Schluss zu, dass IGF1 und IGF2 während der Trächtigkeit des Rindes für Proliferation und Motilität im Plazentom entscheidend sind und in Wechselwirkung mit EGF stehen. Für diese Vorgänge werden in vitro je nach Zelltyp, in unterschiedlicher Ausprägung, die Signalwege von MAP-Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase genutzt. Die Expression von IRS1 und IRS2 in Plazentom und interkarunkulären Bereichen des Rindes lassen eine Beteiligung an der Vermittlung intrazellulärer Signale nach IGF-Stimulation vermuten. Aufgrund dieser Erkenntnisse bieten sich verschiedene Angriffspunkte für eine Modulation zur Bekämpfung puerperaler Erkrankungen, aber auch mögliche Marker für die Diagnostik. Hierfür müssten weiterführende Untersuchungen vorgenommen werden.

7. Summary

„Characterization of the bovine placental insulin-like growth factor system in vitro and the peripartal expression of IRS1 and IRS2 in the placentome and interplacentomal tissue of dairy cows in vivo.” Lisa Lenz (Helmstedt)

Postpartal uterine dieseases are one of the major problems in the dairy cow herd management today, because they provoke severe economical losses. In this regard, the IGF-system might play a significant role as there is evidence that negative energy balance and deviating IGF level are associated with puerperal diseases in dairy cows (Wathes et al., 2009; Piechotta et al., 2012). After the localization of the members of the IGF-system in the uterus and placentome of cattle (Robinson et al., 2000;

Richterich, 2008; Lütkehus, 2012), the goal of this study was to elucidate the underlying mechanisms of the IGF-system in vitro.

Three bovine, placental cell lines (BCEC, F3, fibroblasts) were stimulated with IGF1 and IGF2 alone or in combination with EGF, and the influence on proliferation and motility was examined. The intracellular signaling after stimulation was analysed by western blots for the activation of MAP Kinase 42/44, Akt-Kinase, and p38 MAP Kinase.

Since the adaptorproteins IRS1 and IRS2 are crucial for downstream signaling after IGF1R activation their expression was examined in the bovine placentome and in interplacentomal areas by immunohistochemistry. The material was taken on day 275 of gestation during a caesarian section or after spontaneous labour. After release of fetal membranes, LPS-instillation and euthanization were conducted. Both groups were further subgrouped into IGF-low and IGF-high animals, according to their blood IGF-levels.

In vitro a significant increase of proliferation after stimulation with IGF1 and IGF1+EGF was seen in BCEC, F3 cells and fibroblasts. On the contrary, IGF2 was capable of significantly increasing the proliferation of F3 cells and fibroblasts. The combination of IGF2+EGF was again able to enhance the proliferation of all three analyzed cell lines,

whereas EGF only enhanced the proliferation of F3 cells. It has to be emphasized that the combination of IGF2+EGF was able to increase the proliferation significantly, while the two growth factors on their own failed to do so. Regarding F3 cells, a contrary result was obtained: IGF2+EGF seemed to have an antagonistic effect. Their combination resulted in a significantly lower proliferation compared to EGF, although a significant increase related to the cells grown in serumfree medium was observed. In BCEC, a significant enhancement of motility was found after each stimulation. IGF1 and IGF2+EGF led to a significant increase of the motility of F3 cells and fibroblasts, just as IGF1+EGF in F3 cells and IGF2 in fibroblasts. The combination of IGF2 and EGF had a synergistic effect on F3 cells; the motility was significantly higher compared to the single stimulations. Considering fibroblasts an antagonistic effect was noticeable after stimulation with IGF1+EGF.

The results of the investigation regarding the intracellular signal cascades were as follows: the MAP-Kinase 42/44 and the Akt Kinase of F3 cells was activated by all analyzed growth factors. The p38 MAPK Kinase was activated by IGF1+EGF, EGF, and IGF2+EGF. Regarding the fibroblasts, an activation of the examined kinases was seen after every stimulation. MAP-Kinase 42/44 and p38 MAP Kinase were activated by IGF1+EGF, EGF, and IGF2+EGF in BCEC, whereas the Akt Kinase was only activated by EGF. Thus it appears that the impact of EGF exceeded that of the other two growth factors in F3 cells and BCEC.

In the immunohistochemical stainings of the placentomes it is obvious that IRS1 and IRS2 are mainly located in the mononuclear trophoblasts. IRS2 is as prominent in the fetal mesenchyme. Concerning the maternal part, there was a variation from a weak to no expression, except for the arteries, which were positive. In the interplacentomal samples IRS1 and IRS2 were located in the uterine glands. In the luminal epithelium the staining of both adaptor proteins varied from negative to positive. Remarkable was the intense staining of the apical membrane for IRS1. Again, only the arteries, but not the venes were positive. The intense of staining of immune cells was variable in interplacentomal areas and in the placentome and for both antibodies.

In conclusion, there seem to be cell-specific functions of both adaptorproteins IRS1 and IRS2 in the ongoing remodeling processes during the peripartal time.

In summary, the results of this work led to the conclusion that IGF1 and IGF2 during gestation are crucial for proliferation and motility in the bovine placentome and interact with EGF. Depending on the cell type, these processes in vitro are differentially regulated by MAP-Kinase 42/44, Akt Kinase, and p38 MAP Kinase. The expression of IRS1 and IRS2 in the placentome and intercaruncular tissue led to the assumption that they take part in the intracellular signaling after IGF stimulation. Based on these findings, new various targets for modulation as well as some potential novel markers for diagnostics could be developed to combat puerperal diseases. However, further investigations are needed.

8. Literaturverzeichnis

Anai, M., Ono, H., Funaki, M., Fukushima, Y., Inukai, K., Ogihara, T., Sakoda, H., Onishi, Y., Yazaki, Y., Kikuchi, M., Oka, Y. and Asano T. (1998). “Different subcellular distribution and regulation of expression of insulin receptor substrate (IRS)-3 from those of IRS-1 and IRS-2.” J Biol Chem 273(45):29686-92.

Angervo, M., Koistinen, R. and Seppälä, M. (1992). „Epidermal growth factor stimulates production of insulin-like growth factor-binding protein-1 in human granulosa-luteal cells.“ J Endocrinol 134(1):127-31.

Archbald, L. F., Schultz, R. H., Fahning, M. L., Kurtz, H. J. and Zemjanis, R. (1972). „A sequential histological study of the post-partum bovine uterus.“ J Reprod Fertil 29(1):133-136.

Baker, J., Liu, J. P., Robertson, E. J. and Efstratiadis, A. (1993). “Role of insulin-like growth factors in embryonic and postnatal growth.” Cell 75:73-82.

Barnea, E. R., Feldman, D., Kaplan, M. and Morrish, D. W. (1990). “The dual effect of epidermal growth factor upon human chorionic gonadotropin secretion by the first trimester placenta in vitro.” J Clin Endocrinol Metab 71(4):923-8.

Bass, K. E., Morrish, D., Roth, I., Bhardwaj, D., Taylor, R., Zhou, Y. and Fisher, S. J.

(1994). “Human cytotrophoblast invasion is up-regulated by epidermal growth factor: evidence that paracrine factors modify this process.” Dev Biol 164(2):550-61.

Belfiore, A., Frasca, F., Pandini, G., Sciacca, L. and Vigneri, R. (2009). “Insulin receptor isoforms and insulin receptor/insulin-like growth factor receptor hybrids in physiology and disease.” Endocr Rev 30(6):586-623.

Bilby, C. R., Bader, J. F., Salfen, B. E., Youngquist, R. S., Murphy, C. N., Garverick, H. A., Crooker, B. A. and Lucy, M. C. (1999). “Plasma GH, IGF-I and conception rate in cattle treted with low doses of recombinant bovine GH.” Theriogenology 51:1285-1296.

Bitar, M. S. (1997). „Insulin-like growth factor-1 reverses diabetes-induced wound healing impairment in rats.“ Horm Metab Res 29(8):383-386.

Björkmann, N. (1954). “Morphological and histochemical studies on the bovine placenta.” Acta Anat (Basel) 22:1-91.

Björkmann, N. and Bloom G. (1957). “On the fine structure of the foetal-maternal junction in the bovine placentome.” Zellforsch Mikrosk Anat 45(6):649-659.

Björkmann, N. H. (1969). „ Light and electron microscopic studies on cellular alterations in the normal bovine placentome.“ Anat Rec 163(1):17-29.

Björkmann, N.H. and Sollen, P. (1960). „Morphology of bovine placenta at normal delivery.“ Acta Vet Scand 1:157-177.

Boller, S., Joblin, B. A., Xu, L., Item, F., Trüb, T., Boschetti, N., Spinas, G.A. and Niessen, M. (2012). “Frm signal transduction to signal interpretation: An alternative model for the molecular function of insulin receptor substrates.” Arch

Boller, S., Joblin, B. A., Xu, L., Item, F., Trüb, T., Boschetti, N., Spinas, G.A. and Niessen, M. (2012). “Frm signal transduction to signal interpretation: An alternative model for the molecular function of insulin receptor substrates.” Arch