3. Material und Methoden
3.1. In vitro Versuche
3.1.7. Motilitäts-Assay
Die verschiedenen Zelllinien wurden passagiert, gezählt und in 12 well-Platten ausgesät.
Tab. 3: Verwendete Zellzahlen/well und Zelllinie im Motilitäts-Assay
Zelllinie Zellzahl/well
BCEC 40.000
F3 25.000
Fibroblasten 25.000
BUVEC 25.000
Die Zellen wurden für 24h bei 37°C und 5%CO2 in FSM bzw. EBM inkubiert und anschließend für 4h in SFM/EBM 1% verbracht. Nach dieser Zeit wurden die Zellen mit 1000µl der unterschiedlichen Lösungen mit Wachstumsfaktoren in SFM/EBM 1%
stimuliert (Tab. 2). Als Bezug dienten auch hier die unstimulierten, daher nur mit SFM/EBM 1% inkubierten, Zellen. Eine Positiv-Kontrolle mit FSM/EBM wurde ebenfalls durchgeführt. Direkt im Anschluss an die Stimulation wurden die Platten in die Inkubationskammer (37°C, 5%CO2) des Mikroskops verbracht. Die Aufnahmen erfolgten mit dem Cell Observer System, Zeiss MicroImaging, Jena, Deutschland. Pro well wurden zwei geeignete Positionen ausgewählt, an denen die folgenden Aufnahmen vorgenommen wurden. Insgesamt wurden über einen Zeitraum von 18h alle 15min Bilder aufgenommen. Die anschließende Auswertung der Bilder erfolgte mit ImageJ® (Schneider et al., 2012). So ermittelte Strecken, von 50 Zellen/well, wurden im Weiteren mit Excel im Hinblick auf Mittelwerte, Standardabweichung und SEM untersucht. Die Versuche wurden jeweils zweimal durchgeführt.
3.1.8. Molekularbiologie
Zur RNA Extraktion wurde das SV Total RNA Isolation System (Promega, USA) entsprechend den Herstellerangaben verwendet. Alle nachfolgenden Schritte wurden, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die m-RNA Extraktion erfolgte aus in PBS gewaschenen und bei -21°C eingefrorenen Zellpellets. Um die Zellen aufzuschließen wurde RNA-Lysis-Buffer mit 10µl ß-Mercapthoenthanol zu den Zellen hinzugegeben und anschließend gevortext, davon wurden ca. 175µl in ein neues Eppendorf Gefäß überführt. Im nächsten Schritt wurden 350µl RNA-Dilution-Buffer dazugegeben, die Probe wurde dann für 3min bei 70°C im Heizblock erhitzt und im Folgenden zentrifugiert (12.000-14.000g für 10min).
Der Überstand wurde mit 200µl 95%igem Ethanol vermischt, auf ein Spin Basket gegeben und zentrifugiert (1min, 12.000-14.000g). Die Membran wurde dann mit 600µl RNA Wash Solution ausgewaschen (12.000-14.000g, 1min). Verbliebene DNA wurde mittels 50µl DNAse Incubation Mix verdaut, nach 15min Inkubation wurde dies mit 200µl DNAse Stop Solution unterbunden. Es folgten zwei Wasch-Schritte mit je 600µl und 250µl RNA Wash Solution (12.000-14.000g, 30s). Die Elution der RNA erfolgte in 100µl Nuklease freiem Wasser.
Die Konzentration und Reinheit der RNA wurde mittels eines Spektrophotometers bei einer 1:50 Verdünnung (E260/E280) gemessen und ein Quotient berechnet, der die Reinheit der RNA wiedergab. Die Menge an enthaltener RNA wurde mit folgender Formel ermittelt: Konzentration [µg/ml]=OD26040µg/ml x Verdünnungsfaktor.
Im folgenden Schritt wurde die gewonnene RNA in cDNA umgeschrieben. Für die Reverse Transkription (RT-reaction) wurde ImPromII reverse transcriptase (Promega) mit dem dazugehörigen Standardprotokoll verwendet.
Es wurden 0,5µg RNA und 1µl Random Primer (0,5µg) zusammen gegeben und mit Nuklease freiem Wasser auf 5µl aufgefüllt. Anschließend erfolgte eine Erhitzung auf 70°C für 5min, um sekundäre Strukturen zu denaturieren. Nach dem Kühlen wurde dann der Reverse Transcription Mix dazugegeben (RT-Mix).
RT-Mix
Nuklease freies Wasser 6,1µl
ImPromII 5x Reaktionspuffer 4,0µl
MgCl2 (25mM) 2,4µl
dNTP (10mM) 1µl
RNasin (2.500 U) Ribonuclease Inhibitor 0,5µl ImPromII Reverse Transkriptase 1,0µl
Die Annealing Temperatur wurde auf 25°C festgelegt und die anschließende Elongation erfolgte bei 42°C für 60min. Mit 70°C für 15min wurde die Reaktion durch Enzym Denaturierung gestoppt.
Um die Expression von IGF1, IGF2, IGF1R, IGF2R, den IGFBPs 1-7 in den bovinen Zelllinien BCEC, F3, Fibroblasten und BUVEC sowie die Expression von IRS1-4 in BCEC, F3 und Fibroblasten zu erfassen, wurde anschließend eine PCR durchgeführt.
Der Versuch wurde nach einem Promega PCR Protokoll durchgeführt, Reagenzien wurden von Promega verwendet.
Reaction-Mix
5x Green go Taq Reaction Buffer 4µl
MgCl2 (25mM) 1,6µl
dNTP (10mM) 0,4µl
Primer forward (10µm) 1µl
Nuklease freies Wasser 10,9µl
Go Taq Polymerase (5u/µl) 0,1µl
Template (cDNA) 1µl
Als Negativ-Kontrolle wurde cDNA durch Nuklease freies Wasser ersetzt.
Tab. 4: Verwendete PCR Primer
Ta Annealing temperature
Name Sequenz (5’ zu 3’) Amplicon Accession Ta
IGF1 For: CTA CAG TGA AGA TGC CCA TCA CA
Rev: GGT GAA GGC GAG CAA GCA 65bp HQ324244.1 59°C IGF2 For: TGC CTC TAC GAC CGT GCT T
Rev: GAC TGC TTC CAG ATG TCA TAT TGG 80bp NM_174087.3 60°C IGF1R For: GCT CAA CCC AGG GAA CTA CAC A
Rev: GAT CCG TCC ACG ACC CAT T 70bp XM_002696504.1 60°C IGF2R For: CCA GCA CTT CAG TCG CAA A
Rev: GGT CGC CAT CTT GAA CGT 64bp NM_174352.2 56,5°C
IGFBP1 For: CAG TGA GCG CCG GTT CCT GT
Rev: GTG AGT TCC GGG CAG GAG GC 200bp NM_174554.2 64,5°C IGFBP2 For: GAC GGG AAC GTG AAC TTG AT
Rev: ACC TGG TCC AAT TCC TGC T 212bp NM_174555.1 57°C IGFBP3 For: CTG GCA TCT TTC CAC TTT CC
Rev: AGA CGA AGC GCG TCT AAC AT 201bp NM_174557.3 57,3°C IGFBP4 For: CCC AAG TCT GTG GGA GAA GA
Rev: AAG GAC CTG GGG AGG AGT AA 198bp NM_174557.3 59,4°C IGFBP5 For: TCG TGC GGC GTC TAC ACT
Rev: GGG TGA GTA GGT CTC CTC T 207bp NM_001105327.1 59°C IGFBP6 For: GCCCGGGTCTTCAGAAGGCG
Rev: ATGTGAGGCCCCAGGGGTGA 188bp NM_001040495.1 64,5°C IGFBP7 For: GGT GCC CAG GTG TAT TTG AG
Rev: CAG CAC CCA GCC AGT AAC TT 183bp NM_001102300.1 59,4°C
IRS1 For: GAG CGG TAG TGG CAA ACT CT
Rev: GGA ACT TGA GGA AAG GCG GA 228bp XM_002685642.1 59,4°C IRS2 For: AGC CAA GTT CAC TGC CTC CTC
Rev: GCT GGA GCC ATA CTC GTC CAA G 286bp XM_003582887.1 63°C IRS3 For: CTC GCT ATA TTG GGG CCT GG
Rev: AGC CTC CAC CTC TGA TGG AT 201bp XM_002698132.1 60,4°C IRS4 For: CGC AAT GGT GGC AGA GAA TG
Rev: ACA GAA CCT CCT CGT CGG TA 262bp XM_592483.3 59,4°C
RPS9 For: AAA CGT GAG GTC TGG AGG GTC AAA
Rev :GCA ACA GGG CAT TAC TTC GAA CA 117bp NM_001101152 60°C
Während der PCR wurde der Deckel des Cyclers auf 105°C erhitzt, um zu verhindern, dass sich während dieses Vorgangs Flüssigkeit am Deckel sammelt. Die initiale Denaturierung erfolgte bei 95°C für 2min. Daraufhin folgten 37 Zyklen, in denen zuerst bei 94°C die Denaturierung (30s), dann bei 60°C die Primeranlagerung (45s) und abschließend bei 72°C (30s) die Elongation stattfand. Anschließend folgte für 5min eine finale Polymerisation. Für die Primer IGFBP 1-7 und IRS 1-4 wurde ein abweichendes Programm gewählt, das sich dadurch unterschied, dass ein Temperaturgradient von 60°C ± 3.5°C für das Annealing vorhanden war. Die jeweiligen Ta können Tab.4 entnommen werden.
Die spezifischen PCR-Produkte wurden dann auf ein 2%iges Agarose-Gel, welches Ethidiumbromid enthielt, aufgetragen und eine Elektrophorese bei 80mV in TBE-Puffer durchgeführt.
Die Visualisierung erfolgte unter UV Licht mit der Vision-Capt Software (Vilber Lourmat) und die Auswertung mittels Bio-1D.
3.1.9. Proteinbiochemie
Die Zellen wurden für diesen Versuch in Zellkulturschälchen ausgesät (40x11mm) und für drei Tage in den Inkubator (37°C, 5%CO2) verbracht, um ein möglichst konfluentes Wachstum zu erreichen. In die Zellkulturschälchen wurden jeweils 1,5ml FSM gegeben. BUVEC wurden von diesen Versuchen ausgeschlossen, da in den vorangehenden Untersuchungen zu Proliferation und Motilität keine signifikanten Änderungen im Bezug zu FSM oder SFM beobachtet werden konnten.
Tab. 5: Verwendete Zellzahl/dish und Zelllinie für Western Blotting
Zelllinie Zellzahl/dish
BCEC 250.000
F3 150.000
Fibroblasten 150.000
War nach drei Tagen die Konfluenz erreicht, wurde das vorhandene FSM abgenommen und für vier Stunden durch SFM ersetzt. Die Stimulation mit den verschiedenen Faktoren erfolgte anschließend für 15min bzw. 7,5min im Inkubator.
Die eingesetzten Konzentrationen sind Tab. 6 zu entnehmen.
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Tab. 6: Konzentrationen der untersuchten Wachstumsfaktoren im Western Blotting
Zelllinie
Wachstumsfaktor
IGF1 IGF1+EGF EGF IGF2 IGF2+EGF
BCEC 100ng/ml 100+20ng/ml 20ng/ml 50ng/ml 50+20ng/ml
F3 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml
Fibroblasten 50ng/ml 50+20ng/ml 20ng/ml 100ng/ml 100+20ng/ml
Nach Ablauf der Zeit wurde die Reaktion gestoppt, in dem die Schälchen auf Eis gestellt wurden, das Medium unverzüglich abgesaugt und zweimal mit kaltem PBS gespült wurde. Daraufhin wurden 75µl Boehringer Lyse-Puffer pro Zellkulturschälchen dazugegeben, dieser enthielt AEBSF (1mM), Pepstatin (1µM), Leupeptin (1µg/ml) sowie Phospahatase-Inhibitoren. Zur Zelllyse wurde auch weiterhin auf Eis gearbeitet und die Zellen mit einem Policeman-Schaber abgelöst, das gewonnene Zelllysat wurde in Eppendorfgefäße überführt und zentrifugiert (17.000g, 5min, 4°C). Im so gewonnen Überstand ist das Protein nun enthalten.
Im Folgenden wurde die enthaltene Proteinmenge bestimmt, dazu wurde ein auf der Proteinbestimmung nach Lowry basierendes DC Protein Assay Kit™ verwendet (Bio-Rad, München). Grundlage dieses Verfahrens ist die Biuret-Reaktion, bei der durch die Bindung von Cu2+O mit Peptidbindungen ein gefärbter Komplex entsteht. Wird die Absorption dieses Komplexes nun bei 690nm im ELISA Reader Thermo Multiskan (ThermoFischer Scientific Inc, USA) gemessen, kann durch den linearen Zusammenhang mit der Proteinkonzentration, die Menge des enthaltenen Proteins in der Probe bestimmt werden. Als Vergleichsprotein wurde Bovines Serum Albumin verwendet.
Mithilfe der Geradengleichung wurde die benötigte Menge an Probe ermittelt (10µg/15µg Protein/Probe). Die Differenz zwischen Füllmenge (20µl) der Taschen und der benötigten Menge Probe, sowie 5µl 4xLämmli-Puffer mit ß-Mercaptoenthanol wurde mit Boehringer-Lyse-Puffer aufgefüllt. Anschließend erfolgte eine kurze Zentrifugation, danach wurden die Proteine auf dem Heizblock denaturiert (5min, 95°C). Es folgte nach dem Abstellen auf Eis ein abermaliges Zentrifugieren (2min, 17.000g).
Es wurde für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ein diskontinuierliches Gel, bestehend aus Sammelgel, Trenngel und Stopfgel verwendet. Bei einer SDS-PAGE werden die Proteine durch das negative geladene SDS (Natriumdodecylsulfat) denaturiert und mit einer identischen Ladungsdichte ausgestattet. So werden sie, ladungsunabhängig, nach Größe aufgetrennt. Außerdem werden Wechselwirkungen unter den Proteinen verhindert. Durch Verwendung eines diskontinuierlichen Gels wird eine bessere Auftrennung der Proteine erreicht. Für die isolierten Proteine wurden jeweils 12%ige Trenngele verwendet. Die Gele wurden in die Apparatur eingespannt und SDS-Laufpuffer eingefüllt, damit wurden auch die Geltaschen vor der Befüllung gespült. Die Taschen wurden jeweils mit 20µl Probe, bzw. 5µl SDS-Marker (Sigma Aldrich, SDS7B) befüllt. Bei einer Spannung von 100V wurde gewartet, bis sich eine Lauffront gebildet hatte. Anschließend wurde die Spannung auf 150V erhöht und die Proben benötigten ca. 1h, um das Gel zu durchlaufen.
Um die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran zu überführen, wurde nun das Western Blotting durchgeführt. Angewendet wurde das
Wet-Blot System. Die verwendeten Geräte zur Gelherstellung sowie die Western-Blot-Apparatur stammten von Bio-Rad (München). Die eingespannten Pakete aus Schwämmchen, Filterpapieren (6x1mm), Nitrocellulosemembran und Gel wurden in die Blot-Apparatur überführt und diese mit Blot-Puffer aufgefüllt. Unter Rühren und Kühlung lief der Blot für 1h bei 100V. Die nun auf der Membran gebundenen Proteine konnten im Folgenden für die Immunodetektion genutzt werden.
Die freien Bindungsstellen auf der Membran konnten mit Milchpulverlösung (5%
Magermilchpulver in TBS-T) blockiert werden, um unspezifische Bindungen zu verhindern. Die Inkubation mit dem Erst-Antikörper erfolgte über Nacht bei 4°C auf dem Rüttler, der entsprechende Antikörper wurde mit 5ml Magermilchpulver in TBS-T und 5ml TBS1x zuvor vermischt. Es wurden folgende Antikörper verwendet:
Tab. 7: Im Western Blotting verwendete Antikörper mit jeweiliger Verdünnung
Antikörper Verdünnung
Phospho-MAP Kinase 42/44 (Sigma Aldrich) 1:10000 Phospho-Akt (Ser 473) (Cell Signaling) 1:4000 Phospho-p38-MAP Kinase (Cell Signaling) 1:4000
Am folgenden Tag wurde diese Lösung entfernt und die Membran 3x mit TBS-T gewaschen (alle Waschschritte wurden auf dem Schüttler bei Raumtemperatur durchgeführt). Der Zweit-Antikörper IgG-HRP wurde mit einer Verdünnung von 1:4000 (in TBS1x) für 1h dazugegeben. Für die pMAPK 42/44 wurde ein goat anti-mouse IgG-HRP (sc-2005, Santa Cruz), für pAkt (Ser 473) und p38 MAPK wurden ein goat-anti-rabbit IgG-HRP Zweit-Antikörper verwendet. Es folgte abermals 3x Waschen für je 10min.
Die Detektion erfolgte mit einer Fusion SL Chemilumineszenz-Detektionseinheit mit entsprechender Fusion Software. Zuvor wurde die Membran mit Luminol und
Enhancer (SuperSignal® West Dura, Thermo Scientific) behandelt, um die Chemilumineszenz zu ermöglichen.
Zur Normierung der Ergebnisse und internen Kontrolle folgte die Redetektion mit ß-Aktin. Die Membran wurde 3x10min in TBS-T gewaschen und anschließend für 30min im Stripping Buffer inkubiert, um die vorherigen Antikörper wieder zu lösen. Es folgte nochmaliges Waschen mit TBS1x (3x10min). Auch in diesem Fall wurde die unspezifische Bindung mittels Blocken durch Magermilchpulver verhindert (5%
Magermilchpulver in TBS-T), bevor der Antikörper ß-Aktin (C4) (sc-47778, Santa Cruz), mit einer Verdünnung von 1:6000 für 1h bei Raumtemperatur einwirken konnte.
Danach wurde abermals für 3x10min mit TBS-T gewaschen und anschließend der Zweitantikörper goat anti-mouse IgG-HRP (sc-2005, Santa Cruz) in einer Verdünnung von 1:4000 aufgetragen, bei einer Einwirkzeit von 1h. Nach 3x10min Waschen wurde die Redetektion durchgeführt, entsprechend der vorherigen Detektionsbeschreibung.
Im Anschluss an die Versuche wurden die Ergebnisse der Chemilumineszenz mit Hilfe des Programms BIO-1D quantitativ analysiert und abschließend mit Excel ausgewertet.