Einfluss des Insulin-like Growth Factor Systems auf die endokrinologische Antwort nach einer experimentell induzierten Inflammation des Uterus

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Einfluss des Insulin-like Growth Factor Systems auf die endokrinologische Antwort nach einer experimentell induzierten Inflammation des Uterus

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Lars Holzhausen

Hannover

Hannover 2012

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. med. vet. Heinrich Bollwein Klink für Rinder

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. Heinrich Bollwein Klink für Rinder

2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. Hans-Joachim Schuberth Arbeitsgruppe Immunologie

Tag der mündlichen Prüfung:

20. November 2012

Gefördert durch Pfizer Animal Health

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Meiner Familie

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Literatur ... 3

2.1 Transitperiode... 3

2.1.1 Definition ... 3

2.1.2 Metabolische Veränderungen ... 3

2.1.3 Endokrinologie ... 4

2.2 Somatotrope Achse ... 7

2.2.1 Wachstumshormon ... 7

2.2.2 Wachstumshormon Rezeptor ... 8

2.2.3 Insulin-like Growth Factor System ... 9

2.2.4 Besonderheiten der Hochleistungskuh ... 11

2.3 Produktionserkrankungen ... 13

2.3.1 Ketose ... 13

2.3.2 Labmagenverlagerung ... 14

2.3.3 Leberverfettung ... 15

2.3.4 Nachgeburtsverhaltung ... 15

2.3.5 Metritis, Endometritis ... 16

2.4 Angeborene Immunantwort ... 17

2.4.1 Definition ... 17

2.4.2 Besonderheiten der angeborenen Immunantwort in der Transitperiode 19 2.5 Immun-endokrine Netzwerke ... 20

3 Material und Methode ... 23

3.1 Tiere ... 23

3.2 Versuchsaufbau... 23

3.2.1 Antepartaler Zeitraum ... 24

3.2.2 Postpartaler Zeitraum ... 24

3.3 Antepartaler Zeitraum ... 28

3.3.1 Auswahlkriterien der Versuchstiere ... 28

3.3.2 Einstallung ... 28

3.3.3 Blutprobennahme vor der Geburt ... 29

3.4 Geburtsüberwachung ... 29

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3.5 Postpartaler Zeitraum ... 30

3.5.1 Bakterielle Untersuchung ... 30

3.5.2 Durchführung des LPS-Versuchs ... 30

3.6 Laboranalysen ... 31

3.6.1 IGF-I ... 31

3.6.3 Cortisol ... 33

3.6.4 Adrenocorticotropes Hormon ... 33

3.6.5 Thyroxin und Trijodthyronin... 34

3.6.6 Insulin ... 34

3.6.7 17β-Östradiol ... 34

3.6.8 Progesteron ... 35

3.6.9 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α ... 35

3.6.10 Freie Fettsäuren ... 36

3.6.11 Lipopolysaccharide ... 36

3.7 Histologie ... 36

3.8 Statistik ... 37

4 Ergebnisse ... 39

4.1 Tiere ... 39

4.2.1 IGF-I ... 40

4.2.3 Schilddrüsenhormone ... 43

4.2.4 Cortisol ... 45

4.2.5 Progesteron ... 46

4.2.6 17β-Östradiol ... 47

4.2.7 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α ... 48

4.2.8 Insulin ... 49

4.2.9 Freie Fettsäuren ... 50

4.3 Geburt ... 51

4.4 Postpartaler Zeitraum ... 51

4.4.1 Bakterielle Untersuchung ... 51

4.4.2 LPS-Versuch ... 52

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4.5.1 Übersichtsfärbung ... 63

4.5.2 Immunhistochemie ... 64

5 Diskussion ... 67

5.1 Tiere ... 68

5.2.1 Somatotrope Achse ... 71

5.2.3 Cortisol ... 74

5.2.4 Reproduktionshormone ... 76

5.2.5 Insulin und FFS ... 76

5.3 Bakterielle Untersuchung ... 78

5.4 LPS-Versuch ... 79

5.4.1 Somatotrope Achse ... 81

5.4.3 Reproduktionshormone ... 83

5.4.4 Cortisol und ACTH ... 85

5.4.5 Lipopolysaccharide ... 86

5.6 Schlussfolgerungen ... 89

6 Zusammenfassung ... 90

7 Summary ... 93

8 Literatur ... 94

9 Anhang ... 110

9.1 Wachstumshormon ... 110

9.2 PGFM ... 111

9.3 LPS ... 111

9.4 Färbeprotokoll der Histologischen Schnitte ... 112

9.5 Rezepte ... 113

10 Tabellenanhang ... 116

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Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

Neben den allgemein üblichen Abkürzungen wurden folgende spezielle Kurzformen verwendet:

Abb. Abbildung

ACTH Adrenocorticotropes Hormon

ALB Albumin

ALS Acid labile subunit

a.p. ante partum

AST Aspartat-Aminotransferase

BCS Body Condition Score

CK Creatininkinase

cpm counts per minute

DNA Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA Enzym linked Immunosorbant Assay

E2 17β-Östradiol

FFS Freie Fettsäuren

GAP Glutaraldehydprobe

GAS interferon-gamma-activated sites

GB Gesamt Bilirubin

GGT γ-Glutamyltransferase

GH Wachstumshormon (Growth Hormone)

GHIH Wachstumshormon inhibiting Hormone

GHR Wachstumshormon-Rezeptor

GHRH Wachstumshormon releasing Hormone

GLDH Glutamatdehydrogenase

HE Hämatoxylin Eosin

HSD1/HSD2 11β-Hydroxysteroiddehydrogenase Typ 1 / 2

HST Harnstoff

IGF Insulinähnlicher Wachstumsfaktor

IGFBP IGF-Bindungsproteine

IGF-IR IGF-I Rezeptor

IL Interleukin

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IRMA Immunradiometrischer Assay

Jak2 Janus Kinase 2

ln Natürlicher Logarithmus

LPS Lipopolysaccharid

min Minuten

mRNA messenger Ribonukleinsäure

NaCl Natriumchlorid

NTIS Nicht Thyreodales Erkrankungssyndrom

(Non Thyroidal Illness Syndrome)

P Irrtumswahrscheinlichkeit

PAMP Pathogen-assozierte molekulare Struktur

(Pathogen Associated Molecular Pattern)

PBS Phosphat gepufferte Saline

p. insem. post inseminationem

PG Prostaglandin

PGFM Prostaglandin F2α Metabolit

p.p. post partum

P4 Progesteron

RIA Radioimmunoassay

STAT Signal Transducer and Activator of

Transcription

Tab. Tabelle

TH1/TH2 T-Helferzellen Typ1/Typ2

TLR Toll-like Rezeptor

TNF Tumor Nekrose Faktor

TSH Thyroidea Stimulierendes Hormon

T3 Trijodthyronin

T4 Thyroxin

V. Vena

VLDL Very Low Density Lipoprotein

5’D 5’Deiodinase

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1 Einleitung

Als Transitperiode der Milchkühe wird die Zeit um die Abkalbung beschrieben, die mit einer erhöhten Krankheitsinzidenz einhergeht (1, 2). Unter anderem führen bakterielle Infektionen des Uterus in der ersten Woche post partum (p.p.) zu Metritiden und Endometritiden und haben darüber hinaus auch negative Einflüsse auf das weitere Zyklusgeschehen (3). Die finanziellen Einbußen, die uterine Krankheiten allein in der Europäischen Union durch Behandlung, aber auch Milchverluste und Unfruchtbarkeit pro Jahr bedingen, werden von Sheldon et al. (4) auf etwa 1,4 Milliarden Euro geschätzt.

Eine bakterielle Besiedelung des Uterus im Anschluss an die Geburt ist nach Ansicht letztgenannter Autoren bei 80 bis 100% der Tiere nachweisbar, allerdings entwickelt nur gut ein Drittel der Tiere klinische Erkrankungen des Uterus. Damit aus einer zunächst harmlosen bakteriellen Kontamination keine Infektion entsteht, sind vor allem lokale Abwehrmechanismen im Uterus gefordert (5). Dabei wird eine Inflammation des Uterus von einer komplexen hormonellen Regulation begleitet, die auch die Somatotrope Achse mit einschließt (6). Diese Achse beschreibt das hypophysär ausgeschüttete Wachstumshormon (Growth Hormone; GH) und in der Leber gebildete Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (Insulin-like Growth Factors;

IGF). Peripartal kommt es bei Hochleistungsmilchkühen zu einer Entkopplung der Somatotropen Achse, denn durch eine Verminderung der Wachstumshormonrezep- toren (Growth Hormone Receptor, GHR) in der Leber vor der Geburt kommt es zu einer Reduktion der IGF-I-Blutkonzentration. Gleichzeitig steigen die GH- Konzentrationen durch das fehlende negative Feedback von IGF-I an der Hypophyse an (7). Es ist zwar bekannt, dass die Hormone der Somatotropen Achse einen Einfluss auf die Immunantwort haben (8, 9), allerdings weiß man wenig über deren Funktion und Einfluss auf die uterine Immunität während der Transitperiode von Milchkühen.

In Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass trotz vergleichbarer IGF-I-Konzen- trationen um den Geburtszeitpunkt niedrige IGF-I-Konzentrationen vier bis sechs Wochen vor der Geburt auf ein erhöhtes Risiko für postpartale Erkrankungen hin- deuten (10). Die Hormone der Somatotropen Achse beeinflussen dabei nicht nur direkt die Inflammation, sondern haben auch über andere endokrine Achsen wie die Schilddrüsenhormonachse einen möglichen Einfluss (6). Die verschiedenen hormo-

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nellen Regelkreise nehmen Einfluss auf eine Inflammation, aber umgekehrt beeinflusst auch eine Inflammation die verschiedenen hormonellen Regelmechanismen.

Es wird hierbei von einem immunendokrinen Netzwerk gesprochen (6). Die Effek- tivität der Immunantwort wird von diesem immunendokrinen Netzwerk beeinflusst (6).

Viele Regelkreise innerhalb dieses Systems sind allerdings sehr komplex und es gibt zu dieser Thematik bisher nur wenige Informationen in Bezug auf die peripartale Hochleistungsmilchkuh. Aus diesem Grund soll in der vorliegenden Arbeit der Einfluss des Insulin-like Growth Factor Systems auf die endokrinologische Antwort nach einer experimentell induzierten Inflammation des Uterus untersucht werden. Es werden dazu folgende Hypothesen überprüft:

- Niedrige IGF-I-Werte vier bis sechs Wochen ante partum (a.p.) führen aufgrund des fehlenden negativen Feedbacks zu einer erhöhten GH-Serumkon- zentration um den Geburtszeitpunkt.

- Tiere mit unterschiedlich hohen IGF-I-Konzentrationen a.p. zeigen in verschiedenen Geweben Unterschiede in den Wachstumshormon-Rezeptoren.

- Ein uteriner inflammatorischer Reiz post partum hat unterschiedliche Auswirk- ungen auf den Hormonhaushalt bei Tiere mit unterschiedlichen IGF-I-Konzen- trationen 4 bis 6 Wochen vor der Geburt.

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2 Literatur

2.1 Transitperiode 2.1.1 Definition

Die Transitperiode der Milchkühe definiert Grummer (11) als Zeitintervall von drei Wochen vor bis drei Wochen nach der Geburt. Dieser Zeitraum ist in der Literatur für den englischen Begriff „Transition Period“ weithin anerkannt (1, 12). Allerdings be- stehen auch zeitlich kürzere Definitionen, die nur die letzten ein bis zwei Wochen der Trächtigkeit und die ersten zwei Wochen der Laktation mit einschließen. Hierbei wird allerdings betont, dass das zeitliche Intervall für die gesundheitlich besonders anfällige Phase der Milchkühe noch bis zum Zeitpunkt der höchsten Milchleistung in der fünften Woche p.p. anhält (13, 14). Wenngleich die Definition des Zeitraumes variiert, besteht Einigkeit darüber, dass in dieser Zeit die höchste Inzidenz von Krankheiten bei Milchkühen zu beobachten ist (1, 11, 13). Diese Krankheiten werden als Produktionserkrankungen bezeichnet (1) und sind im Folgenden genauer beschrieben.

2.1.2 Metabolische Veränderungen

Hochleistungsmilchkühe sind als „Metabolische Athleten“ bezeichnet worden (15) und gerade die Transitperiode stellt eine Zeit enormer metabolischer Anpassungen dar. Diese Anpassungen sind vor allem nötig, um dem erhöhten Energiebedarf während der späten Trächtigkeit und der beginnenden Laktation gerecht zu werden (11). In den letzten drei Wochen der Trächtigkeit beobachtet man eine Reduzierung der Futteraufnahme der Tiere, die in der letzten Trächtigkeitswoche um bis zu 30%

im Vergleich zur Mitte der Trächtigkeit sinkt (16). Eine Erklärung für diesen Rückgang bei gleichzeitig hohem Energiebedarf bietet zum Teil die Tatsache, dass der Pansen durch die Größenzunahme des Uterus eingeengt und so seine Aufnahmekapazität eingeschränkt wird (16). Allerdings müssen nach Bertics et al. (16) auch weitere Faktoren, die die Autoren nicht näher beschreiben, in Betracht gezogen werden, da bei erzwungener gleichbleibender Futtermenge bis zur Geburt eine Depression der Futteraufnahme nach der Geburt nicht vermieden wird. Zusätzlich ist der Energieverbrauch des Muttertieres durch die benötigte Energie für das Wachstum

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des Fetus zum Ende der Trächtigkeit erhöht (17, 18). Deshalb gelangt der Körper der Milchkuh bereits vor der Geburt in eine katabole Stoffwechsellage, die mit einer negativen Energiebilanz einhergeht (17, 18). Diese hält auch über die Geburt hinaus an. Nach Bauman et al. (19) und Grummer (11) ist der Höhepunkt der negativen En- ergiebilanz in der ersten Woche der Laktation zu beobachten.

Eine große Bedeutung innerhalb dieser Anpassungsreaktionen an eine katabole Stoffwechsellage hat der Fettstoffwechsel. Freie Fettsäuren (FFS) werden aus Adi- pozyten freigesetzt und stehen als Energielieferanten in der Leber zur Verfügung (19, 20). Fütterungsunabhängig steigen die Konzentrationen der FFS im Blut in den letzten drei Wochen vor der Geburt stetig an (11). Für den Abbau der FFS und der damit einhergehenden Bereitstellung von Lipoproteinen ist besonders die Leber zu- ständig (21). Näheres dazu ist im Kapitel 2.3.3 „Leberverfettung“ beschrieben.

Neben dem Fettstoffwechsel ist auch der Glukosestoffwechsel bei der Anpassung an eine negative Energiebilanz von entscheidender Bedeutung. Die Leber synthetisiert 85% der im Körper verbrauchten Glukose (1). Sowohl die späte Trächtigkeit als auch die beginnende Laktation erfordern eine erhöhte Produktion von Glukose, worauf die Leber mit einer erhöhten Aufnahme von endogenen glukoplastischen Substanzen, wie beispielsweise Aminosäuren und Glycerol reagiert (18). Nach Bell et al. (22) führen abnehmende Insulinkonzentrationen in den letzten beiden Wochen vor der Geburt zu einer Hemmung der Proteinsynthese und einer Erhöhung der Proteolyse, um dem erhöhten Verbrauch an Aminosäuren in der einsetzenden Laktogenese gerecht zu werden.

Diese oben beschriebenen Anpassungsreaktionen im Lipid-, Kohlenhydrat- und Proteinstoffwechsel müssen bei Milchkühen adäquat reguliert werden, um die En- ergie für den Fetus und die einsetzende Milchproduktion bereitzustellen. Reguliert werden diese Anpassungen vornehmlich endokrinologisch (1). Die Endokrinologie der Transitperiode wird im Folgenden näher erläutert.

2.1.3 Endokrinologie

Die komplexe endokrinologische Regulation in der Transitperiode ist sowohl an den peripheren Hormonkonzentrationen, als auch den Rezeptorexpressionen, und an Veränderungen nachgeschalteter Signaltransduktionswege zu erkennen (18, 23).

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In diesem Zusammenhang ist bei der Milchkuh der Somatotropen Achse eine besondere Bedeutung zuzuschreiben. Diesem endokrinen Regelkreis ist dementsprechend ein eigenes Kapitel gewidmet (siehe 2.2 Somatotrope Achse).

Die metabolische Adaptation spiegelt sich auch in den Änderungen der Konzen- trationen der Schilddrüsenhormone Thyroxin (T4) und Trijodthyronin (T3) wider. Die Schilddrüsenhormone haben Einfluss auf den Energiehaushalt, da sie vor allem den energetischen Grundumsatz des Körpers regulieren (24). Die T4- und T3-Konzen- trationen sinken während der letzten Wochen vor der Geburt ab und steigen während der Laktation wieder auf die Ausgangswerte von der Mitte der Trächtigkeit an (11).

Dabei sind die T4-Konzentrationen und die Milchleistung zu Beginn der Laktation negativ korreliert (25). Parallel dazu sinken nach Pezzi et al. (25) die 5’Deiodinasen (5’D) in der Leber ab. Diese Enzyme spalten ein Jodatom vom T4 (auch Tetra- jodthyronin genannt) ab, wodurch Trijodthyronin, die aktive Form der Schilddrüsen- hormone entsteht. Durch die verminderte hepatische Deiodinase-Aktivität während der Geburt kommt es zu einem Abfall der T3-Konzentration im Blut. Dagegen steigt die Aktivität der 5’D in der Milchdrüse zum Geburtszeitpunkt an und korreliert positiv mit der Milchleistung, wobei auch höhere T3-Konzentrationen im Gewebe der Milchdrüse und im Kolostrum nachweisbar sind (25).

Aceves et al. (26) bringen Änderungen der Schilddrüsenparameter mit dem Krank- heitsbild des sogenannten Euthyreoten Krankheitssyndroms in Verbindung und führen dies auf den hohen Energieverbrauch der Milchdrüse und der damit einhergehenden negativen Energiebilanz und der hohen metabolischen Belastung zurück. Es kommt dabei zu einem Absinken der Thyroxinkonzentration und damit zu einem verminderten Grundumsatz des Körpers (26). Wie der Name „Euthyreotes Krankheitssyndrom“ besagt, sind solche Veränderungen sonst bei Krankheiten unterschiedlicher Genese zu beobachten (26).

Cortisol wird sowohl in der Nebenniere des Fetus als auch des Muttertieres gebildet und als Stresshormon angesehen. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle im Rahmen hormoneller Veränderungen vor der Geburt (27). Die Freisetzung von Cor- tisol induziert in den Eihäuten die Bildung des Enzyms 17α-Hydroxylase. Dieses Enzym bewirkt die Konversion von Progesteron zu Östrogenen (27). Weiterhin induziert fetal gebildetes Cortisol die Synthese von Prostaglandinen, vor allem von Pro- staglandin (PG)F2α. Dieses führt zu einer Luteolyse und dadurch zum Absinken der

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weiter unten beschriebenen Progesteronkonzentrationen und anschließend zu Kon- traktionen der glatten Uterusmuskulatur (27). Während der dadurch ausgelösten Geburt sind die Cortisolkonzentrationen des Muttertieres, bedingt durch die An- strengungen während der Geburt, hoch (28, 29).

Progesteron ist für die Aufrechterhaltung der Gravidität von entscheidender Bedeut- ung (24). Es wird im Corpus luteum und zum geringen Teil auch in der Plazenta und Nebenniere gebildet (30, 31). Stabenfeld et al. (32) beschreiben ein Absinken der Progesteronplasmakonzentration ab dem Tag 250 der Trächtigkeit von durchschnitt- lich 7 auf 4 ng/ml in der Woche vor der Geburt, wobei die individuelle Schwank- ungsbreite relativ hoch sei, und ein schnelles Absinken ca. 24 h vor der Geburt auf einen Wert um 1 ng/ml, bedingt durch die Luteolyse. Der Rückgang ein bis vier Wochen ante partum hängt mit der bereits oben beschriebenen durch Cortisol induzierten Synthese des Enzyms 17α-Hydroxylase zusammen, das eine erhöhte Produktion von Östrogenen durch Umsetzung des Progesterons bedingt (31, 33, 34).

Gegen Ende der Trächtigkeit steigen die Konzentrationen von vornehmlich 17β- Östradiol (E2), aber auch Östron und Östriol stark an (35). Der Hauptsyntheseort dieser Hormone ist die Plazenta. Östrogene induzieren geburtsvorbereitend eine erhöh- te Anzahl an Oxytocinrezeptoren am Uterus, ein verstärktes Wachstum des Myome- triums und eine vermehrte Bildung von Actomyosin, wodurch sich die Kontraktilität des Uterus erhöht (27). Zusammen mit Relaxin bewirken Östrogene auch eine Auf- weichung der Zervix und des Geburtskanals und stimulieren die Freisetzung von PGF2α aus dem Endometrium (27). Direkt nach der Geburt kommt es innerhalb eines Tages zu einem Absinken der Östrogenplasmakonzentrationen auf ein Basalniveau (27, 36). Sie bleiben bis zur Bildung eines ersten dominanten Follikel um den 10. Tag post partum niedrig (37).

Prostaglandin F2α ist nicht nur für die Kontraktionen während der Geburt, sondern auch für die anschließende Uterusinvolution von Bedeutung. Zu früh sinkende Kon- zentrationen von PGF2α sind mit einer verzögerten Uterusinvolution in Zusammen- hang gebracht worden, weshalb PGF2α als ein bedeutender Faktor während der peripartalen Phase angesehen wird (27).

Das endokrine Pankreas synthetisiert unter anderem die beiden Peptidhormone In- sulin und Glukagon, welche beide, neben Catecholaminen und Cortisol, wichtige Re- gulatoren des Blutzuckerspiegels sind (24). Dabei führt Insulin zu einer Senkung des

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Blutzuckerspiegels durch Aufnahme von Glukose in Körperzellen. Glukagon dagegen führt zu einer Freisetzung von Glukose aus Zellen in die Blutbahn (24). Die Glukose- konzentration im Blutplasma fällt in der Woche nach der Geburt deutlich ab (38), wohingegen die Insulinkonzentration bereits in den letzten beiden Wochen vor der Geburt absinkt. Letztere bleibt dann in den ersten drei Wochen nach der Geburt auf einem niedrigen Level (39) und erreicht erst ca. 30 Tage p.p. wieder die Ausgangs- konzentration, die vier Wochen vor der Geburt gemessen wurden (40). Genau entgegengesetzt dazu steigen die zum Insulin antagonistisch wirkenden Glukagon- plasmawerte an und sinken anschließend wieder ab (38). Die niedrigen Insulinwerte führen zu einer vermehrten Aufnahme der Glukose durch die nicht insulinabhängigen Glukosetransporter der Zellen der Milchdrüse. Die Insulinkonzentrationen sind mit der Milchleistung negativ korreliert. Niedrige Insulinkonzentrationen werden deshalb auch als ein Grund für hohe Milchleistungen angesehen (41).

2.2 Somatotrope Achse

Die Somatotrope Achse hat einen bedeutenden Einfluss auf das fetale und post- natale Wachstum des Organismus. Das Wachstumshormon wurde in diesem Zusammenhang bereits 1921 von Evans und Long (42) nachgewiesen und erhielt aufgrund dieser Funktion auch seinen Namen. Erst später erkannte man, dass GH nicht nur direkt, sondern auch über Serumfaktoren wirkt (43). Einige dieser Serumfaktoren wurden von Rinderknecht und Humbel (44) als Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren beschrieben.

Die klassischen Elemente der Somatotropen Achse umschließen das Wachstums- hormon, das Wachstumshormon Bindungsprotein, den Wachstumshormonrezeptor, die Insulin-like Growth Factors I und II, sechs IGF Bindungsproteine (IGFBP) und weitere IGF ähnliche Bindungsproteine (45).

2.2.1 Wachstumshormon

Das im Hypophysenvorderlappen gebildete GH gehört zur Gruppe der Peptidhor- mone, besteht aus 191 Aminosäuren und wird mit einer pulsatilen, circadianen Rhy- thmik in den Blutkreislauf abgegeben (45). Im menschlichen Fetus kann GH bereits in der 6. Woche der Schwangerschaft nachgewiesen werden und besitzt einen

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großen Einfluss auf das Längenwachstum (45). Die pulsatile Ausschüttung des GH wird mit geschlechtsspezifischen Unterschieden durch zwei Neuropeptide gesteuert.

Diese Neuropeptide sind das Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH) und das Growth Hormone Inhibitor Hormone (GHIH). Beide werden im Hypothalamus gebildet und in den Blutkreislauf abgegeben (46).

Die Regulation der Ausschüttung dieser beiden Neuropeptide erfolgt zum einen durch ein negatives Feedback auf den Hypothalamus durch das Wachstumshormon selbst, wodurch die GHRH-Ausschüttung gesenkt und gleichzeitig die Sekretion von GHIH gefördert wird (47). Des Weiteren sind auch andere Hormone beschrieben, die einen Einfluss auf die hypothalamische GHRH- und GHIH-Ausschüttung und somit auch auf das hypophysäre GH-Ausschüttungsmuster haben. Dazu gehören das in der Leber gebildete IGF-I, sowie die gastrointestinalen Peptide Ghrelin, Leptin und Insulin (45). Neben dem Feedback auf den Hypothalamus kommt es aber auch zu einem direkten Feedback auf die Hypophyse, wodurch die GH-Ausschüttung gesenkt werden kann. Dabei besitzen IGF-I und Insulin die größte Bedeutung (48).

Aus der Hypophyse wird GH in den Blutkreislauf abgegeben und an das GH-Bin- dungsprotein gebunden. In vivo konnte von Renaville et al. (49) gezeigt werden, dass das Bindungsprotein die Halbwertszeit verlängert und eine stärkere Wirkung des GH an seinem Rezeptor bedingt.

Neben dem Längenwachstum beeinflusst GH auch den Stoffwechsel (50). Die Wir- kung von GH auf bestimmte Zielgewebe wie Fett, Muskulatur oder auch Leber ist dabei direkt oder wird indirekt durch IGF-I und IGF-II vermittelt. Einen direkten Effekt hat GH beispielsweise auf die Adipozyten. Es wirkt lipolytisch und ein GH-Mangel führt bei Mäusen zu einem vermehrten Fettgehalt des Körpers (51). In der Leber kommt es durch GH zu einer vermehrten Glukoneogenese. Indirekt bewirkt es aber durch die Bildung von IGF-I eine vermehrte Aufnahme von Glukose aus der Blutbahn in die Gewebe. Wachstumshormon und IGF-I sind somit zum Teil Antagonisten und die Regulation auf Zellebene ist komplex gesteuert (50).

2.2.2 Wachstumshormon Rezeptor

Die Wirkung von GH wird über GHR in der Zellmembran vermittelt (52). GHR ist ein transmembranes Glycoprotein, dessen mRNA Expression und dessen Protein in der Leber die höchsten Konzentrationen besitzen. Aber auch in Fettgewebe, Muskel und

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Niere wurden hohe Konzentrationen des GHR nachgewiesen (53). Die Wirkung von Wachstumshormon an seinem Rezeptor wird intrazellulär über die Janus Kinase 2 (Jak2) vermittelt, die mit dem intrazellulären Teil des Rezeptors assoziiert ist. Die Bindung von GH veranlasst eine Konformationsänderung des Rezeptors, der die Jak2 aktiviert. Das intrazelluläre Signaltransduktionsprotein Jak2 phosphoryliert in Folge das DNA Bindungsprotein „signal transducer and activator of transcription 5b“

(STAT5b). Zwei phosphorylierte STAT5b bilden zusammen ein Dimer, das im Zell- kern an spezifische DNA Sequenzen, sogenannte „interferon-gamma-activated sites“

(GAS), bindet. Diese GAS Elemente befinden sich in den Promotern der GH-ab- hängigen Gene, wie beispielsweise dem IGF-I-Gen, die dadurch die Transkription dieser Gene erhöhen (23).

Es sind drei verschiedene GHR mRNA Transkripte beim Rind beschrieben: GHR 1A, 1B und 1C (52). Lucy et al. (54) konnten die GHR 1A mRNA beim Rind nur in der Le- ber nachweisen. Weiterhin konnte diese Arbeitsgruppe (55) zeigen, dass die Bindung von GH auf mikrosomalen Membranen homogenisierter Hepatozyten um den Ge- burtszeitpunkt beim Rind deutlich verringert ist. Das auf den Hepatozyten gebundene GH korreliert mit der Transkription der GHR 1A mRNA, nicht aber mit der Transkrip- tion der gesamten mRNA der GHR 1A, 1B und 1C. Die Autoren machen deshalb GHR 1A für das Absinken der IGF-I-Konzentrationen vor der Geburt verantwortlich (55).

2.2.3 Insulin-like Growth Factor System

In der Literatur wird übereinstimmend dem IGF-I im Metabolismus, aber auch bei Funktionen der Immunantwort und der Regeneration und Differenzierung von Ge- weben eine besonders wichtige Bedeutung zugesprochen (6, 8, 56). Bereits nam- entlich wird bei Insulin-like Growth Factor auf eine strukturelle Homologie zum Insulin verwiesen, die ca. 50% beträgt (45). Dementsprechend kann IGF-I nicht nur an seinen eigenen Rezeptor, sondern auch an die Rezeptoren der strukturverwandten Hor- mone Insulin und IGF-II binden. Allerdings ist bei dieser Kreuzreaktivität die Bin- dungsaffinität von beispielsweise IGF-I am Insulinrezeptor gegenüber Insulin 100-mal niedriger (8, 45).

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In der fetalen Phase wird vor allem IGF-II gebildet, wobei IGF-I einen ebenso großen Einfluss auf das Wachstum hat (57), so dass beim Rind sowohl IGF-I als auch IGF-II positiv mit dem fetalen Wachstum korrelieren (58). Sowohl im fetalen als auch post- natalen Leben wird die Synthese und Sekretion von IGF-I vor allem durch GH gesteuert. Dabei synthetisiert die Leber den größten Anteil des im Blut zu messenden IGF-I (ca. 75%). Das restliche im Blut zu messende IGF-I wird unter anderem in der Muskulatur sowie im Fett- und Nierengewebe gebildet (59). Das gebildete IGF-I kann sowohl endokrin, als auch parakrin und autokrin wirken (60). Die parakrine Wirkung beschreibt die Wirkung eines Hormons auf die Nachbarzelle, während man unter autokriner Wirkung den Einfluss auf dieselbe Zelle, in der das Hormon gebildet wurde, versteht. Yakar et al. (59) konnten bei Mäusen nachweisen, dass über 2/3 von dem endokrin wirksamen, im Serum zu messenden IGF-I in der Leber synthetisiert werden. Allerdings war ohne dieses in der Leber gebildete IGF-I weder das Wachstum noch die Reproduktion beeinträchtigt.

Das gebildete IGF-I wird im Blut an Bindungsproteine gebunden: Nur ca. 1% liegt un- gebunden, also frei vor. Viele der IGF-I-Aktionen werden durch Bindungsproteine modifiziert und kontrolliert (8, 45, 61). Der Komplex aus IGF-I, IGFBP-3 und Acid labile subunit (ALS) bildet den größten Anteil (80 – 95%) an gebundenem IGF-I (62).

Dieser Bindungskomplex, der eine Halbwertzeit von 15 Stunden hat, wird als Pool für IGF-I angesehen (8). Zusätzlich kommt es zu einer Beeinflussung des IGF-I durch weitere Bindungsproteine. Ist IGF-I beispielsweise an IGFBP-1 gebunden, so er- leichtert dieses Bindungsprotein den Transport von IGF-I durch Membranen (63). Da- rüber hinaus wurde für IGFBP-2 ein bedeutender Einfluss auf die physiologische Fol- likelentwicklung gezeigt. Ein Mangel steht in Zusammenhang mit einer zystischen Entartung von Follikeln (64).

Die weitreichenden Wirkungen von IGF-I auf den Organismus werden durch den IGF-I-Rezeptor (IGF-IR) vermittelt, der nach Frago et al. (45) in allen Geweben, mit Ausnahme von Hepatozyten und ausgereiften B-Zellen vorkommt. Im Gegensatz dazu konnten Gross et al. (65) beim Rind IGF-IR mRNA auch in der Leber nachweisen.

Zu den Wirkungen von IGF-I gehören eine gesteigerte Zellproliferation und Zelldif- ferenzierung (45). Die beiden Wirkungen konnten auch für heranreifende und sich entwickelnde Lymphozyten in primären und sekundären lymphoiden Geweben gezeigt werden (8). Der zugrunde liegende Mechanismus der erhöhten Proliferation ist

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die Beschleunigung des Zellzyklus einschließlich der Mitose (45). Neben der gestei- gerten Proliferation ist bei Immunzellen aber auch die Apoptoserate, d.h. der pro- grammierte Zelltod, herabgesetzt (45).

Des Weiteren konnte in vielen Arbeiten gezeigt werden, dass sich die metabolischen Gegebenheiten auf die systemischen IGF-I-Blutkonzentrationen auswirken (49). Aber auch umgekehrt sind Beeinflussungen von IGF-I auf den Metabolismus beschrieben.

Liegt beispielsweise eine anabole Stoffwechsellage vor, senkt vom Körper gebildetes IGF-I systemisch vorhandene Triglyceride, FFS und Ketonkörper und erhöht die Aminosäureaufnahme in die Muskulatur (66). Weiterhin kann IGF-I durch die insulin- ähnliche Wirkung die Glukoseaufnahme in die Gewebe erhöhen und die Glukagon- und GH-Sekretion senken. Dadurch wirkt es unter anderem auch dem diabetogenem Effekt des GH entgegen (8).

Während einer katabolen Stoffwechsellage kommt es zu einer Resistenz gegenüber GH in den Geweben und damit zu einer verminderten IGF-I-Konzentration. Breier (66) geht davon aus, dass dieser Mechanismus dazu führe, dass freigesetzte Sub- strate wie z. B. Glukose und freie Fettsäuren vorwiegend für die Homöostase und nicht für Zellwachstum und Zellproliferation verwendet werden. Ähnliches gilt für den peripartalen Zeitraum bei Hochleistungsmilchkühen, in dem eine negative Energie- bilanz zu einem Abfall der IGF-I-Werte führt. Butler et al. (48) stellen eine Verbindung zwischen unterernährten Tieren und Tieren am Anfang der Laktation her, da bei beiden Gruppen niedrige IGF-I-Konzentrationen zu messen sind.

2.2.4 Besonderheiten der Hochleistungskuh

Bei den Rassen Holstein und Guernsey, sprich Rassen mit hoher Milchleistung, kommt es zu einem Absinken des GHR in der Leber um den Geburtszeitpunkt (67).

Die geringste GHR-Konzentration ist in der Woche nach der Geburt parallel zu einer niedrigen IGF-I mRNA Transkription und IGF-I-Serumkonzentration gemessen worden (7).

Bei Rindern, die züchterisch auf Fleischproduktion und nicht auf hohe Milchleistung selektioniert worden sind, ist dagegen die Änderung der GHR- und IGF-I-Konzen- trationen nicht zu beobachten (68). Lucy et al. (50) gehen deshalb davon aus, dass dieses Absinken von GHR und IGF-I mit der hohen Milchleistung und der damit

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einhergehenden katabolen Stoffwechselsituation während der Transitperiode in Zu- sammenhang steht.

Bei Hochleistungsmilchkühen kommt es durch die sinkenden IGF-I-Werte im peripartalen Zeitraum zum Anstieg von GH und damit zu einem in der Literatur als Ent- kopplung der Somatotropen Achse beschrieben Phänomen (23).

Dadurch, dass eine erhöhte Milchleistung bei Rindern auch durch eine parenterale Gabe von GH erreicht werden kann (23, 69, 70), schlussfolgern Bell et al. (22) und Lucy et al. (23), dass die vermehrte Ausschüttung von GH die Bereitstellung von Substraten zur Milchbildung erhöht. Es kommt zu einem Anstieg von FFS und zu einer verstärkten Glukoneogenese der Leber (48).

Weiterhin beschreiben Butler et al. (48), dass die Entkopplung der Somatotropen Achse in direktem Zusammenhang mit sinkenden Insulinkonzentrationen steht. Ihnen war es möglich, mittels Insulininfusion und damit steigenden Insulinkonzentrationen in den ersten Wochen nach der Geburt eine Zunahme der GHR 1A mRNA und damit steigende IGF-I- und sinkende GH-Konzentrationen zu erreichen.

Auch auf das weitere Zyklusgeschehen der Kühe haben IGF-I und GH einen Einfluss. So ist die IGF-I-Konzentration während der letzten vier Wochen vor Geburt bei Tieren, die postpartal in den ersten drei Wochen ovulieren, höher als bei anovulatorischen Kühen. Genau entgegengesetzt verhält es sich mit GH (71). Kawashima et al. (71, 72) konnten zwischen ovulatorischen und anovulatorischen Kühen jedoch keine Unterschiede hinsichtlich der metabolischen Parameter freie Fettsäuren, Cholesterol und Glukose feststellen. Daraus schließen die Autoren, dass der IGF-I- Wert sensitiver zu sein scheint, um metabolische Belastungen darzustellen als beispielsweise freie Fettsäuren. Ähnliche Zusammenhänge konnten Piechotta et al. (10) aufzeigen. Sie beobachteten bereits vor der Geburt bei Tieren mit Produktionser- krankungen niedrigere IGF-I-Konzentrationen als bei Tieren, die postpartal gesund blieben. Ihren Ergebnissen zufolge bestand bei Tieren mit IGF-I-Werten um 100 ng/ml zwischen dem 242. bis 250. Tag post inseminationem (p. insem.) ein höheres Risiko an Produktionserkrankungen zu erkranken, als bei Tieren mit IGF-I- Werten über 130 ng/ml.

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2.3 Produktionserkrankungen

Mulligan und Doherty (1) postulieren, dass häufig die Unfähigkeit einzelner Kühe, die hohen metabolischen Ansprüche zu erfüllen, die Entstehung von Produktionserkran- kungen bedinge. Zu den sogenannten Produktionserkrankungen zählen in der Lite- ratur Ketose, Labmagenverlagerung, Leberverfettung, Hypokalzämie, Nachgeburts- verhaltung, Metritis, Endometritis und Mastitis (73). Diese treten, wie bereits beschrieben, mit erhöhter Inzidenz in der Transitperiode auf und sind ätiologisch eng miteinander verbunden (1). Die Pathogenese der Produktionserkrankungen ist komplex und laut Ingvartsen et al. (2) nicht per se mit einer hohen Milchleistung in Verbindung zu bringen. So sind beispielsweise Labmagenverlagerungen eher auf die Futteraufnahme und betriebliche Fütterungsfehler zurückzuführen (2). Hypokalz- ämien sind ebenso durch Fütterungsfehler bedingt, stehen aber auch mit der Anzahl der Laktationen in Zusammenhang (74). Eine andere Vermutung von Ingvartsen et al. (2) ist, dass „hormonelle Gegebenheiten“ eine Immunsuppression bedingen und es infolgedessen zu einer erhöhten Prävalenz von Erkrankungen komme. So begünstigen vor allem hohe Progesteronspiegel die Entstehung von bakteriellen Uteruserkrankungen, wohingegen erhöhte Östrogenwerte die Resistenz der Tiere gegenüber der Entwicklung von Uteruserkrankungen steigern (75). Die allein durch uterine Krankheiten entstehenden wirtschaftlichen Schäden in der Europäischen Union schätzen Sheldon et al. (5) auf jährlich 1,4 Milliarden Euro. Auch unter dem Aspekt des Tierschutzes sind Krankheiten zu vermeiden und daher Risikofaktoren bereits im Vorfeld von deren Entstehung zu reduzieren (76). Borghetti et al. (6) gehen davon aus, dass ein detailliertes Verständnis der Regelmechanismen der unspezifischen Abwehr und die damit einhergehende mögliche Intervention die Inzidenz von Krankheiten verringern könnte.

2.3.1 Ketose

Liegt ein Energiemangel vor, so kommt es zur Freisetzung freier Fettsäuren aus dem Fettgewebe in die Blutbahn. Diese FFS gelangen in die Leber und werden dort zum großen Teil mittels β-Oxidation zu Acetyl-CoA abgebaut. Das entstehende Acetyl- CoA wird im Zitratzyklus weiter verstoffwechselt und kann somit als Energieträger genutzt werden (77). Durch die laktationsbedingte hohe Belastung der Glukoneo- genese und der hohen Depotfettmobilisierung kommt es in der Leber zu einer Kon-

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kurrenzsituation im Zitratzyklus. Das entstehende Acetyl-CoA wird daher unter Um- gehung des Zitratzyklus teilweise zu Acetacetat und weiter zu den Ketonkörpern β-Hydroxybutyrat und Aceton umgewandelt und von der Leber in den Blutkreislauf abgegeben (77). In der Peripherie können vor allem Herz, Skelettmuskulatur, Niere, Milchdrüse und Gastrointestinaltrakt die Ketonkörper verstoffwechseln (78) und damit zum Teil die benötigte Glucose ersetzen (24). Wenn die Kapazität der Verstoff- wechselung der Ketonkörper in der Peripherie überschritten ist, kommt es zur Ausscheidung dieser über Niere, Milchdrüsen, Haut und Atemluft und bei Über- schreitung der Ausscheidungskapazität zu einer Akkumulation im Plasma. Die erhöhte Konzentration an Ketonkörpern führt zur metabolischen Azidose (24) und darüber hinaus kann es zu nervalen Beeinträchtigungen kommen, die von einer Hypomotilität des Magen-Darm-Traktes bis hin zu nervösen Symptomen reichen können (77).

2.3.2 Labmagenverlagerung

Bei der Labmagenverlagerung handelt es sich um ein multifaktorielles Geschehen, dessen primäre Ursache bis heute unbekannt ist (79). Von den diagnostizierten Lab- magenverlagerungen bei Hochleistungskühen treten bis zu 80% in den ersten vier Wochen post partum auf. Durch eine Dilatation und eine Ansammlung von Gas aus dem Labmageninhalt, steigt der Labmagen zwischen der linken oder rechten Bauchwand und dem Pansen bzw. den anderen inneren Organen auf. Dieses Geschehen wird durch eine Atonie oder eine bereits bestehende Dilatation des Labmagens begünstigt, wobei eine Hypomotilität des Gastrointestinaltraktes durch peripartale Stresszustände, metabolische Imbalancen und andere vorliegende Erkrankungen die Labmagenverlagerung zu fördern scheinen. Daher ist diese Produktionserkrankung häufig mit anderen Krankheiten vergesellschaftet (77). Vor allem sind erhöhte Werte von β-Hydroxybutyrat und FFS sowie niedrige Kalziumkonzentrationen miteinander in Verbindung gebracht worden (80).

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2.3.3 Leberverfettung

Als Leberverfettung bezeichnet man die Akkumulation von Triglyzeriden in der Leber, die zu Beginn der Laktation bei Milchkühen bis zu einem geringen Grad physiologisch ist und zunächst nicht die Leberfunktion beeinträchtigt (21).

Die von der Leber aufgenommenen FFS werden zum einen bei der β-Oxidation zu Actyl-CoA abgebaut, das anschließend, wie beschrieben, in den Zitratzyklus einge- schleust oder zu Ketonkörpern umgewandelt und in die Blutbahn abgegeben wird.

Zum anderen können die Hepatozyten die FFS zu Triglyceriden umwandeln und als Very Low Density Lipoproteine (VLDL) in die Blutbahn abgeben (21). Die Kapazitäten zur Ausschleusung von VLDL und Einschleusung der FFS in die β-Oxidation sind allerdings begrenzt, so dass Triglyceride auch in den Hepatozyten gespeichert werden können, da die Aufnahme freier Fettsäuren keiner Limitation unterliegt (21). Ab einem Verhältnis von gespeicherten Triglyceriden zu Glykogen von 2:1 kommt es zur hepatosteatosebedingten Leberinsuffizienz mit Ketose, verminderter Glukoneoge- nese und mangelnder Harnstoffbildung und dadurch zum verminderten Abbau von Ammoniak. Die Akkumulation von Ammoniak im Körper kann zum puerperalen Leberkoma führen (21, 77). Der Grad der Leberverfettung ist laut Hammon et al. (38) auch für einen erhöhten Quotienten von Glukagon zu Insulin verantwortlich und besitzt damit einen großen Einfluss auf den Metabolismus.

2.3.4 Nachgeburtsverhaltung

Der physiologische Zeitraum für den Abgang der Nachgeburt wird bei vielen Autoren mit 12, teilweise mit bis zu 24 Stunden nach der Geburt angegeben. Kommt es nicht zu einer Ablösung der Nachgeburt innerhalb dieses Zeitraums, wird von einer Nach- geburtsverhaltung gesprochen (81-83). Bei zwei Drittel der Kühe findet der Nachgeburtsabgang in den ersten sechs Stunden post partum statt (82). Der Anteil der spontanen Nachgeburtsverhaltungen der Rinder ohne prädisponierende Fak- toren wird von Sheldon et al. (4) mit 2 – 5% angegeben. Die Inzidenz in Herden beträgt 4 – 12% und wird vor allem von Managementfaktoren wie Hygiene und geburtshilflichen Maßnahmen beeinflusst (83). Es werden verschiedene Risiko- faktoren für die Entstehung von Nachgeburtsverhaltungen beschrieben (82, 83).

Hierzu zählen eine hormonelle Geburtseinleitung, eine verkürzte Graviditätsdauer, Aborte, Zwillingsträchtigkeiten, Dystokien, Fetotomien, Kaiserschnitte, eine Unter-

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versorgung mit Vitamin E und Selen, eine Immunsuppression und infektiöse Agenzien wie Bovines Virus Diarrhoe Virus (82). Heuwieser et al. (84) konnten zudem bei Nachgeburtsverhaltungen eine reduzierte Chemotaxis der neutrophilen Granulozyten nachweisen.

In der Literatur wird übereinstimmend berichtet, dass eine Nachgeburtsverhaltung zu einer erhöhten Prädisposition für andere Produktionserkrankungen führt und negative Einflüsse sowohl auf die uterine Involution und das weitere Reproduktions- geschehen hat (82). Die Rast- und Güstzeiten verlängern sich, die Trächtigkeitsrate nimmt ab und die Anzahl der Besamungen pro Tier zu (82).

2.3.5 Metritis und Endometritis

Eine Metritis tritt in den ersten 21 Tagen nach der Geburt auf und ist nach Sheldon et al. (5) gekennzeichnet durch eine Vergrößerung des Uterus mit einem flüssigen rot- braunen bis viskösen weißlichen purulenten Ausfluss.

Bei einer bakteriellen Infektion sind die am häufigsten nachgewiesenen Bakterien Arcanobacterium pyogenes, Fusobacterium necrophorum, Escherichia coli und Pre- votella species (5, 85, 86). Nachgeburtsverhaltung, Dystokie, Zwillingsgeburt und Totgeburt bedingen ein vermehrtes Auftreten von Metritiden (86) und werden nach Sheldon et al. (5) in drei Grade eingeteilt:

Der Grad 1 beschreibt eine Vergrößerung des Uterus in den ersten 21 Tagen nach der Geburt mit purulentem Vaginalausfluss ohne eine akute systemische Erkrank- ung. Beim Grad 2 einer Metritis liegt eine akute systemische Erkrankung vor, die auf eine Infektion des Uterus mit Bakterien zurückzuführen ist und durch stinkenden, rot- braunen, flüssigen Uterusausfluss sowie Fieber, reduzierte Milchleistung und Abge- schlagenheit gekennzeichnet ist. Bei zusätzlichen Anzeichen einer Toxämie mit Inap- petenz und Schocksymptomatik wird die Metritis als Grad 3 gewertet.

Nach Sheldon et al. (4) können bei 80 – 100% der Kühe postpartal Bakterien im Uterus nachgewiesen werden. Der Anteil der Metritiden liegt bei ca. 40% der Tiere in der ersten Woche nach der Geburt; bei etwa 15 – 20% der Tiere entwickelt sich daraus eine klinische Endometritis. Weitere 30% der Tiere weisen subklinische Endo- metritiden auf (4, 5).

Eine Endometritis ist histopathologisch als eine Entzündung des Endometriums definiert, wobei die Entzündungszeichen nicht über das Stratum spongiosum hinaus-

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reichen (86). Bei der klinischen Endometritis ist nach mehr als 21 Tagen p.p.

purulenter bzw. nach über 26 Tagen mukopurulenter vaginaler Ausfluss nachweisbar. Dabei liegen allerdings keine Anzeichen einer systemischen Erkrankung vor (86). Nach Sheldon et al. (5) liegt eine subklinische Endometritis vor, wenn der Anteil neutrophiler Granulozyten in vom Uterus genommen Zytologieproben über 5,5 – 10%

liegt. Diese Erkrankung führt zu keinen klinischen Symptomen, aber zu einer niedrigeren Trächtigkeitsrate und zu einem erhöhten Abgangsrisiko bei den be- troffenen Tieren (86). Kaufmann et al. (87) stellen einen Zusammenhang zwischen dem Metabolismus, insbesondere den FFS im Blutplasma am Tag vor der Geburt und der Häufigkeit des Auftretens von klinischen und subklinischen Endometritiden fest. Dabei besitzen die FFS zwar eine geringe Sensitivität (35 – 38%), allerdings eine hohe Spezifität (87 – 89 %) hinsichtlich der Prognostizierbarkeit von klinischen bzw. subklinischen Endometritiden.

2.4 Angeborene Immunantwort 2.4.1 Definition

Nach Tizard et al. (88) versteht man unter angeborener Immunantwort bereits vorhandene und schnell reagierende chemische und zelluläre Abwehrmechanismen.

Für die Erregererkennung ist von entscheidender Bedeutung, dass sich diese von körpereigenen Bestandteilen unterscheiden, d.h. Pathogen-assoziierte molekulare Strukturen (PAMPs) besitzen. Es gibt Enzyme und Bindungsproteine, die die Zell- wände von Erregern zerstören oder für eine schnellere Erkennung und Zerstörung markieren können und Immunzellen, die PAMPs erkennen. Die Immunzellen lösen dann eine Entzündung durch die Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen aus.

Dies fördert die gerichtete Aktion gegen Pathogene, so dass es zu einer Akkumulation von Entzündungszellen im betroffenem Gewebe kommt (88).

Beispiele für PAMPs sind bakterienspezifische, hoch konservierte Proteine und andere Strukturen. Dazu zählen unter anderem Proteine der Bakterienzellwand oder Bestandteile der bakteriellen DNA (88). Ein besonders weitverbreitetes dieser PAMPs ist das Lipopolysaccharid (LPS), eine Zellwandstruktur gram-negativer Bakterien (88).

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Rezeptoren zur Erkennung der PAMPs und damit auch von LPS sind u.a. Toll-like Rezeptoren, die auf verschiedenen Zellen des Immunsystems (88) und auf epithelialen Zellen, unter anderem des Uterus, nachgewiesen worden sind (89). Die Aktivierung des TLR4 durch LPS und die damit einhergehende Ausschüttung von Zytokinen durch Immunzellen können zu einer toxischen Reaktion führen, wodurch der Name Endotoxin für LPS begründet ist (5, 85, 90).

Dabei vermitteln die Zytokine eine pyrogene Wirkung, erhöhen die kapillare Perme- abilität und bedingen dadurch eine erhöhte prokoagulatorische Aktivität der Zellwän- de. Durch eine zu hohe Stimulation dieser Mechanismen durch die ausgeschütteten Zytokine kann es bis hin zum Schock durch Volumenmangel und einer disseminier- ten intravasalen Gerinnung kommen (88, 91). Die Toxizität wird dementsprechend nicht durch die direkten Wirkungen von LPS auf die Zellen erzielt, sondern durch die überschießende Freisetzung von Zytokinen aus den Entzündungszellen (88). Dies zeigten Hoshino et al. (90) bei Mäusen, die den LPS-spezifischen Rezeptor TLR-4 nicht besaßen und dadurch nur eine sehr geringe Reaktion auf LPS zeigten.

Durch die physiologisch ausgelöste Entzündungsreaktion mit Dolor (Schmerz), Tu- mor (Schwellung), Rubor (Rötung) und Calor (Erwärmung), aber auch durch bakterielle Produkte (z.B. LPS), Faktoren des Komplementsystems, Moleküle beschädig- ter Zellen und sezernierte Chemokine werden Monozyten, die sich zu Makrophagen im Gewebe entwickeln, und neutrophile Granulozyten an den Ort der Entzündung

„gelockt“ und aktiviert. Dabei steigt die Zahl der Makrophagen erst Stunden nach derjenigen der neutrophilen Granulozyten an (9).

Makrophagen schütten Interleukine, inflammatorische Lipide und PGE2, sowie auch antiinflammatorische Zytokine aus (88, 92). Dazu wird die Aktivität der Makrophagen durch bakterielle Endotoxine, Östrogene und einfache Lipide gesteigert, wogegen Steroide wie Cortisol und Progesteron die Makrophagenaktivität hemmen (88).

Immunzellen fördern die Freisetzung von Zytokinen, wie diejenige des Tumor Nekrose Faktors (TNF)-α, den Proteinkatabolismus in Muskelzellen. Weiterhin bedingt TNF-α eine höhere Verfügbarkeit von Lipiden im Organismus, zum einen durch eine gesenkte Aufnahme und zum anderen durch eine erhöhte Bereitstellung durch Adipozyten (88).

Nach Tizard et al. (88) besitzt das angeborene Immunsystem im Gegensatz zu der erworbenen Immunität keinen „Memory Effekt“ und die Entzündung fällt dadurch auf einen Entzündungsreiz immer gleich stark aus. Dagegen konnte die Studie von

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Elsasser et al. (9) zeigten in einer Studie, dass die Immunantwort durch ein Zusammenspiel mit dem Endokrinium moduliert und kontrolliert werden kann. GH bewirkte bei Rindern eine deutlich verminderte Cortisol- und TNF-α-Ausschüttung.

Deshalb gehen die Autoren davon aus, dass die Somatotrope Achse gerade in der frühen Phase der Infektion die ablaufende angeborene Immunantwort und damit die weitere Pathologie beeinflussen kann. Dem stehen Untersuchungen von Sartin et al.

(93) entgegen, die mit GH einen infektionsbedingten Rückgang der IGF-I-Konzen- trationen nicht beeinflussen konnten. Borghetti et al. (6) gehen in ihrem Review davon aus, dass die Immunantwort durch eine komplexe neuroendokrine homöo- statische Antwort moduliert und in ihrer Effektivität beeinflusst werden kann und die widersprüchlichen Aussagen durch eine zeitlich unterschiedliche Verabreichung von GH zustande kamen.

2.4.2 Besonderheiten der angeborenen Immunantwort in der Transitperiode

Das endokrine System führt, wie bereits beschrieben, in der Transitperiode zu einer Stoffwechselumstellung von einer anabolen hin zu einer katabolen Stoffwechselkon- stellation. Ingvartsen et al. (2) gehen davon aus, dass es durch diese peripartalen Veränderungen der Hormone und Metaboliten direkt oder indirekt zu einer Beeinflus- sung der Immunantwort kommt. Auch Sheldon et al. (4) vertreten die Meinung, dass unter anderem die Immunabwehr durch die endokrinen Gegebenheiten negativ beeinflusst werden könnte, auch wenn die genauen Mechanismen weiterhin größten- teils unbekannt seien (4). Sowohl Mehrzad et al. (94) als auch Hoeben et al. (95) konnten zeigen, dass nach der Geburt die Anzahl neutrophiler Granulozyten im Blut abnimmt. Viele Autoren gehen deshalb von einer Immunsuppression in dieser Phase aus (1, 94, 96), wohingegen Sander et al. (97) keine verminderte Phagozytose- leistung der neutrophilen Granulozyten beobachteten konnten.

Nach der Geburt geht die physiologische Involution des Uterus mit einer Nekrose und dem Ablösen der Karunkeln einher. Diese Vorgänge bieten günstige Voraussetz- ungen für das Wachstum von aeroben und anaeroben Bakterien im Uteruslumen und müssen dementsprechend durch uterine Abwehrmechanismen, das heißt lokale Im- munitätsmechanismen bekämpft werden (4). Gerade bei Hochleistungsmilchkühen ist die Inzidenzrate der uterinen Erkrankungen, verglichen mit anderen domestizier-

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ten Tierarten, hoch (4). So kommt es bei über 80% der Tiere zu einer nachweisbaren bakteriellen Besiedelung des Uterus in den ersten zwei Wochen nach der Geburt (5).

Es ist dabei aber klar zwischen einer Besiedelung und einer Infektion zu trennen.

Während bei der Besiedelung lediglich Bakterien nachweisbar sind, kommt es bei einer uterinen Infektion zur Erkrankung entweder durch Adhärenz an die Mucosa mit einer Kolonisation und Penetration des Epitheliums oder durch die Ausschüttung von Toxinen (86). Sheldon et al. (86) postulieren, dass der Übergang von einer Besiede- lung zu einer Infektion während der Transitperiode durch die Einwirkungen endokrin- er Faktoren auf das Immunsystem beeinflusst wird. Bei der Maus wurde gezeigt, dass in diesem Zusammenhang gerade das Verhältnis von Progesteron und Östro- gen eine bedeutende Rolle für die Entzündung des Uterus spielt. Östrogene fördern und Progesteron hemmt die Entzündung des Uterus und die anschließende Aus- heilung (98).

Bei den Rindern wird vor allem Progesteron eine besondere Rolle zugeschrieben, da gerade während der lutealen Phase die Inzidenz von uterinen Erkrankungen erhöht ist und die iatrogene Luteolyse eine der effektivsten Behandlungsansätze uteriner Erkrankungen darstellt (99-101). LeBlanc (15) geht davon aus, dass metabolische Faktoren, insbesondere eine Ketose und erhöhte FFS, für die Entstehung von uterinen Erkrankungen wichtig seien.

2.5 Immun-endokrine Netzwerke

In einem Review von Borghetti et al. (6) wird ausführlich beschrieben, dass die beidseitige Kommunikation zwischen dem Immun- und dem Neuroendokrinen Sys- tem eine bedeutende Rolle in der metabolischen, produktiven und verhaltenstech- nischen Homöostase spielt und dadurch die Effizienz der Immunantwort gegenüber infektiösen Agenzien und somit die Aufrechterhaltung der Gesundheit beeinflusst.

Bestehende Ungleichgewichte auf hormoneller Ebene können zu einer erhöhten Empfänglichkeit für Erkrankungen und einem schweren Verlauf infektiöser Erkran- kungen führen (102). Die enge Vernetzung von Nerven-, Immun- und Endokrinem System wird dadurch deutlich, dass zum Teil dieselben Proteine synthetisiert werden und die verschiedenen Systeme auch auf die gleichen Proteine reagieren können (6). Im Nervensystem reagiert der Hypothalamus auf höhere IGF-I-Konzentrationen mit einer erhöhten Ausschüttung von GHIH und einer verminderten GHRH-

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Ausschüttung. Aber auch im Cerebellum, Hippocampus und Bulbus olfactorius sind hohe IGF-I-Konzentrationen nachweisbar (45). Im Immunsystem besitzen fast alle Zellen einen IGF-I-Rezeptor und in vitro reagieren selbst ausgereifte Leukozyten auf eine Stimulation mit IGF-I mit einer erhöhten Aktivität beispielsweise bei der Zytokinproduktion (8).

Nach einer Stimulation mit IGF-I kommt es bei neutrophilen Granulozyten und Ma- krophagen zu einer Aktivitätssteigerung in Form einer erhöhten Ausschüttung von Zytokinen und einer erhöhten Bakterienzerstörungskapazität durch reaktive Sauer- stoffspezies (6). Ferner wurde bei Mäusen nach Behandlung mit IGF-I und GH eine vermehrten Ansammlung von Immunzellen bei einer iatrogen erzeugten Peritonitis beobachtet (8). Speziell GH ist bei Rindern in der Lage, die TNF-α-Ausschüttung auf einen inflammatorischen Reiz hin zu senken (9). Somit sind in der Literatur viele Hinweise vorhanden, dass die Immunantwort sowohl auf humoraler als auch zellulärer Ebene durch GH und IGF-I moduliert wird (6, 8, 103).

Aber nicht nur Hormone regulieren die Immunantwort, sondern GH produzierende Zellen der Hypophyse reagieren auch auf Produkte der Immunzellen wie beispielsweise das Zytokin Interleukin-1 (IL-1) (104). Bei Rindern ist beschrieben worden, dass es, vermittelt durch TNF-α, IL-1 und vermutlich PAMPs wie LPS, zur Reduktion der GH-Ausschüttung kommt (6, 56). Allerdings ist nach Carroll et al. (56) die Reaktion der Somatotropen Achse auf inflammatorische Zytokine und Produkte bei verschiedenen Spezies nicht einheitlich. So weisen Schweine und Schafe im Gegen- satz zu Rindern während einer Infektion eine Entkopplung der GH-IGF-I-Achse auf, die mit hohen GH- und niedrigen IGF-I-Konzentrationen einhergeht. Dies geschieht, wie beschrieben, auch bei Milchkühen in der Transitperiode (23). Bei entzündlichen Erkrankungen kommt es allerdings nach Whitlock et al. (92) bei Rindern zu einer Depression der GH-Ausschüttung und nicht zu einer vermehrten Freisetzung.

Der Einfluss von GH auf die Immunantwort wird jedoch kontrovers diskutiert. Zum einen zeigen GH knock out Mäuse, dass GH nicht für die Aufrechterhaltung der Im- munfunktion notwendig ist, zum anderen scheint aber GH die immunsuppressiven Effekte von Glukokortikoiden in Stresssituationen zu kontrollieren (102, 105).

Vor allem die durch eine GH-Resistenz und Entkopplung der Somatotropen Achse resultierenden reduzierten IGF-I-Konzentrationen verschieben nach Ansicht ver- schiedener Autoren (6, 56) die metabolischen und nutritiven Gegebenheiten hin zu einer Unterstützung der Immunantwort.

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Nicht nur die Somatotrope Achse ist im Rahmen der immun-endokrinen Netzwerke zu erwähnen. Auch die Schilddrüse ist in Krankheitsgeschehen involviert und es kommt bei Säugetieren zu einem in der Literatur als Euthyreotes Krankheitssyndrom oder auch Nicht-Thyreodales-Erkrankungs-Syndrom (NTIS) beschriebenen Phänom- en, bei dem die T4- und T3-Konzentrationen unter den Normalbereich absinken.

Freies T4 und Thyreoidea stimulierendes Hormon (TSH) bleiben dagegen im Normalbereich (106). Dieses Euthyreote Krankheitssyndrom mit erniedrigten T4- Konzentrationen und normalen TSH-Werten konnte auch in Zusammenhang mit erhöhten Werten von FFS, der vermehrten Freisetzung von Zytokinen und auch der exogenen Verabreichung von Glukokortikoiden gezeigt werden. Ob es sich bei dem Euthyreoten Krankheitssyndrom um einen protektiven Mechanismus oder eine Störung handelt, wird diskutiert (106).

Borghetti et al. (6) gehen davon aus, dass die bidirektionale Kommunikation über Zytokine, Hormone, Neurotransmitter und Neuropeptide es ermöglicht, die angeborene Immunantwort zu potenzieren, mögliche überschießende und damit schadhafte Effekte zu kontrollieren und die Immunantwort unterstützende, metabolische und nu- tritive Veränderungen zu aktivieren. Dabei betonen sie auch, dass bestehende Un- gleichgewichte in den hormonellen Regelmechanismen zu einer erhöhten Infektions- anfälligkeit und einem schwereren Verlauf der Erkrankung führen können. Die Auto- ren (6) gehen davon aus, dass gerade das Verständnis der Änderungen der Somatotropen Achse neue Ansätze für eine therapeutische Unterstützung einer effi- zienteren Immunantwort geben könnte.

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3 Material und Methode

3.1 Tiere

Die für diesen Versuch verwendeten Tiere waren pluripare schwarzbunte Kühe der Rasse Holstein Friesian. Die Kühe wurden alle aus dem Großbetrieb der Agrar- gesellschaft mbH Siedenlangenbeck, Kuhfelde ausgewählt. Auf dem Betrieb wurden die Tiere in einem Boxenlaufstall gehalten und erhielten eine Totale Mischration (Tab. 1, 2, 3 und 4 im Tabellenanhang). Der Tierversuch wurde in Absprache mit dem Tierschutzbeauftragten der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover beim LAVES Oldenburg genehmigt (Aktenzeichen: 33.9-42502-04-09/1696).

3.2 Versuchsaufbau

Der im Folgenden beschriebene Versuch gliederte sich in zwei Phasen:

Die erste Phase (Antepartaler Zeitraum 3.2.1) begann am Tag der Probenahme (Auswahlprobe) auf dem Betrieb (240. bis 254. Tag p. insem.) bis hin zu einer in der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover stattgefundenen Spontangeburt. Diesem Versuchsabschnitt lag die Fragestellung zugrunde, ob sich die Kühe in bestimmten hormonellen und metabolischen Parametern unterscheiden, die anhand der IGF-I-Konzentrationen in der Auswahlblutprobe selektioniert wurden.

Maximal zwei Tiere wurden gleichzeitig vor dem 266. Tag p. insem. in die Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebracht und aufgestallt. Bei allen Tieren wurde bis zum 266. Tag p. insem. eine Klauenpflege durchgeführt. Ab dem 263. bis 266. Tag p. insem. wurde täglich morgens zwischen 7.30 und 8.30 Uhr Blut aus der Vena (V.) coccygea genommen. Die Geburt wurde als Zeitpunkt 0 definiert und die Proben retrospektiv zu diesem Zeitpunkt zugeordnet. Die Probe -1 wurde als die zuletzt genommene Probe an dem der Spontangeburt vorangegangen Morgen definiert.

In der zweiten Phase des Versuches, der 30 Minuten nach dem spontanen Abgang der Nachgeburt begann, wurden die beiden ausgesuchten IGF-I-Gruppen hinsichtlich unterschiedlicher hormoneller und immunologischer Parameter als Reaktionen auf eine experimentell induzierte uterine Inflammation untersucht. Dieser Versuchsteil

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bezieht sich auf einen Zeitraum bis 15 Stunden nach der Geburt und wird im Weiteren als „Postpartaler Zeitraum“ beschrieben (3.2.2; Abb. 1).

3.2.1 Antepartaler Zeitraum

Die Versuchstiere wurden zwischen dem 240. und 254. Tag p. insem. auf Grundlage der Betriebsdaten und einer klinischen Untersuchung im Betrieb für die Entnahme der Auswahlprobe selektioniert.

Die Tiere befanden sich in der zweiten bis vierten Trächtigkeit und in der vorherigen Laktation wurde eine durchschnittliche Milchleistung von 6000 bis 9500kg erbracht.

Kühe mit einer Milchleistung von über 9.500kg wurden aus betriebswirtschaftlichen Gründen nicht beprobt.

Die Tiere wurden, wie bereits beschrieben, klinisch untersucht (Habitus, Haltung, Bewegung, Fellveränderungen, Ekzeme, Bursitiden, palpatorische Euterkontrolle und Fruchtgegenstoß) und bei mittel- bis hochgradigen pathologischen Befunden, wie einer Lahmheit vom Grad ≥ 2, nicht beprobt. Zudem wurde darauf geachtet, dass sich die Tiere einheitlich in Bezug auf den Body Condition Score (BCS) darstellten.

Es wurde eine Blutprobe aus der V. coccygea entnommen und in ein Serumröhrchen und ein mit EDTA als Antikoagulanz beschichtetes Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt. Für die Glutaraldehydprobe (GAP) wurden 3 ml Blut in ein mit Glutardialdehyd und EDTA vorbereitetes Röhrchen (Klinisches Labor, Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Deutschland) gegeben und alle 30 Sekunden geschwenkt, um eine Koagulation in den ersten drei Minuten beurteilen zu können. Die GAP galt als positiv, wenn eine Koagulation in den ersten drei Minuten auftrat. Tiere mit einer positiven GAP (≤ 3 Minuten) wurden vom weiteren Versuch ausgeschlossen.

Die Selektion der Versuchstiere, die in die Klinik für Rinder verbracht wurden, erfolgte im Weiteren auf Grundlage der am nachfolgenden Tag bestimmten IGF-I- Konzentration wie unter 3.3.1. beschrieben.

3.2.2 Postpartaler Zeitraum

Nach dem spontanen Abgang der Nachgeburt wurde der postpartale Entzündungs- versuch mit intrauteriner LPS- oder Natrium Chlorid (NaCl)-Infusion durchgeführt

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(Abb. 1). Hierfür wurde eine 39°C warme LPS-Lösung in den Uterus infundiert. Un- mittelbar vor der LPS-Infusion und in 30 minütigen Abständen nach der LPS-Infusion wurde Blut aus der V. jugularis entnommen. Die Tiere wurden 180 Minuten nach der LPS-Infusion euthanasiert und Gewebeproben zur Auswertung entnommen. Die Blut- proben wurden mit den Zeitpunkten relativ zur Uterusinfusion zum Zeitpunkt 0 Minuten gekennzeichnet.

In den LPS-Versuch wurden lediglich Tiere einbezogen, die bis zum Zeitpunkt der Spontangeburt klinisch gesund waren und bei denen während der Geburt nur eine geringgradige Haltungskorrektur und/oder leichte Zughilfe durchgeführt werden musste. Zudem war Bedingung für die Aufnahme in die Auswertung, dass die Nachgeburt innerhalb von 12 Stunden nach der Entwicklung des Kalbes aus- gestoßen wurde.

Die Tiere, bei denen die Einschlusskriterien zum Versuch nicht erfüllt waren, wurden als „Kontrolltiere“ zu den Tieren mit einer LPS-Infusion verwendet. In diesem Fall wurde lediglich geprüft ob sich statistische Unterschiede innerhalb ausgewählter Blutparameter (IGF-I, GH, Cortisol, Adrenocorticotropes Hormon (ACTH), T4, T3, Progesteron (P4), E2, Prostaglandin F2α Metabolit (PGFM) und Insulin) zwischen Tieren, die eine LPS-Infusion bzw. eine NaCl-Infusion erhielten, bestanden. Weil die Tiere nicht die Einschlusskriterien für die LPS-Gruppe erfüllten, handelt es sich um keine tatsächliche Kontrollgruppe und sie werden im Folgenden als NaCl-Gruppe bezeichnet. Die NaCl-Gruppe erhielt 12 Stunden nach der Geburt einen Liter auf 39°C erwärmte physiologische Natriumchloridlösung (0,9% NaCl, Braun, Melsungen, Deutschland) nach dem Protokoll des LPS-Versuches in den Uterus infundiert.

Anschließend wurden im gleichen Zeitintervall wie beim LPS-Versuch Blutproben genommen. Zudem wurde bei allen Tieren des postpartalen Versuches die Körper- innentemperatur, Atem- und Herzfrequenz bestimmt, um bei der späteren Aus- wertung einen Effekt der LPS-Infusion gegenüber einer NaCl-Infusion beurteilen zu können. Die Tiere der NaCl-Gruppe wurden nach dem Versuch nicht euthanasiert.

Die IGF-I-, GH-, Cortisol-, P4- und PGFM-Konzentration wurde aus allen genom- menen Proben gemessen (Abb. 2). Insulin, E2, T4, T3 und ACTH wurde nur in aus- gewählten Proben bestimmt (siehe Abb. 2). In der Auswahlprobe vom Betrieb, der ersten Blutprobe zwischen dem 263. bis 266. Tag p. insem. und der Blutprobe am Tag der Geburt wurden die freien Fettsäuren bestimmt.

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Blutprobenentnahme auf dem Betrieb zwischen den Tagen 240 bis 254 Tag post inseminationem (p. insem.)

IGF-I-Bestimmung

Abb. 1: Versuchsablauf während des antepartalen und postpartalen Zeitraums. LPS:

Lipopolysaccharid; IGF-I: Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor; NaCl: Natriumchlorid

<125ng/ml >175ng/ml

Blutproben nach 0, 30, 60, 90, 120, 150

und 180 Minuten

Blutproben nach 0, 30, 60, 90, 120, 150

und 180 Minuten

Blutproben nach 0, 30, 60, 90, 120, 150

und 180 Minuten Euthanasie und

Gewebeentnahme nach 180 Minuten

Euthanasie und Gewebeentnahme

nach 180 Minuten LPS-Infusion

IGF-I niedrige Gruppe

LPS-Infusion IGF-I hohe Gruppe NaCl-Infusion

Postpartaler Zeitraum

Geburtshilfe durch maximal eine Person, Tier

gesund und Abgang der Nachgeburt innerhalb von

12 Stunden

Geburtshilfe durch maximal eine Person, Tier

gesund und Abgang der Nachgeburt innerhalb von

12 Stunden Geburtshilfe durch zwei

Personen, Tier vorher erkrankt oder Nachgeburtsverhaltung

IGF-I niedrige Gruppe (n=10) IGF-I hohe Gruppe (n=10)

Transport in die Klinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zwischen den Tagen 250 bis 265 p. insem.

Tägliche Blutprobenentnahme ab dem 263. bis 266. Tag p. insem. bis zur Geburt

Geburt

Antepartaler Zeitraum