Laboranalysen

Die IGF-I-Konzentration wurde mittels eines kommerziellen IGF-I ELISA (Active IGF-I ELISA; Beckman Coulter, CA, USA) bestimmt. Durch eine Proteinfällung mit saurem Ethanol wurde IGF-I aus den Bindungsproteinen freigesetzt. Nach einer 30 minütigen Inkubationszeit mit anschließender Zentrifugation (30 Minuten, 4000 x g, Heraeus Varifuge 3.0R, Kendro, Osterode, Deutschland) wurde der Überstand pH neutralisiert im Assay eingesetzt und das IGF-I mittels eines ELISA auf Basis des sogenannten

„Sandwich-Prinzips“ bestimmt. Hierzu wurden zu bestimmende Proben, Standard-proben und Kontrollen in Kavitäten einer mit einem gegen IGF-I gerichteten Anti-körper beschichteten Mikrotiterplatte pipettiert. Ein zweiter mit Meerrettichperoxi-dase-gekoppelter Antikörper band im Folgenden an IGF-I. Anschließend wurde nach einem Waschschritt Substrat hinzugegeben und nach erfolgtem Farbumschlag die Reaktion mit einer Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte wurde mittels

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Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) bei 450 nm gemessen und mit dem Programm Magellan Software mit Cubic Spline Mode (Magellan 3.11, Dortmund, Germany) ausgewertet. Die Konzentration der Proben wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve ermittelt. Der Messbereich lag zwischen 10 und 450 ng/ml mit einer analytischen Sensitivität von 0,03 ng/ml und die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen 3,5% bzw. 8,5%.

3.6.2 Wachstumshormon

Die GH-Konzentrationen wurden mit einem ELISA, beschrieben von Roh et al. (108) und Kawashima et al. (71), mit folgenden Modifikation bestimmt (Protokoll siehe Anhang 9.1 Wachstumshormon):

Zu einer mit Antikörper gegen Kaninchen-Immunglobulin (Physiologie, Technische Universität München, Weihenstephan, Deutschland) beschichteten 96 Well Mikro-titerplatte (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) wurde der spezifisch gegen ovines GH gerichtete Antikörper (100 µl, 1:20, rabbit anti-oGH-3, Lot# AFP0802210Rb; National Hormone & Peptide Program (NHPP), NIDDK, and Dr. Parlow, Torrance, California, USA) pipettiert und für 24 Stunden bei Raum-temperatur inkubiert. Der Überstand wurde anschließend dekantiert und 1%

Hühnerserum (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), verdünnt in Assaypuffer (100 µl), zu jedem Well hinzugefügt. GH Standard (15 µl; 0,78 – 100 ng/ml, NIDDK-bGH, AFP-10325C), verdünnt in Assaypuffer, bzw. die zu untersuchenden Plasma-proben wurden in den Wells für 24 Stunden inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde an Biotin (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gekoppeltes GH hinzugefügt und für 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde Streptavidin-Peroxidase für 15 Minuten (Steptavidin-POD; Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) und Substrat für 40 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach dem Stoppen der Reaktion mit Schwefelsäure wurde die Optische Dichte bei 450 nm mittels Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) gemessen und die Konzentratio-nen gegen die Standardkurve berechnet (Magellan 3.11, Dortmund, Deutschland).

Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen 9,8% bzw. 12,6% und der untere Messbereich lag bei 2 ng/ml.

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3.6.3 Cortisol

Die Cortisolkonzentrationen wurden mittels Chemilumineszenz-Immunoassay im Analyseautomaten Immulite^® (Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) aus Serumproben bestimmt. Die Messung basierte auf einem kompetitiven Immuno-assay. Dabei konkurrierte Cortisol in der zu messenden Probe mit Cortisol, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, um Antikörperbindungsstellen an einer Kugel im Test-tube, beschichtet mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen Cortisol. Die alka-lische Phosphatase setzte Adamantyl 1,2-dioxetane Arylphosphat durch Abspaltung einer Phosphatgruppe zu Adamantyldioxtan um, dessen Zerfall eine anhaltende, messbare Lichtemission bedingte, die zur Cortisolmenge der zu messenden Probe umgekehrt proportional war. Im Vergleich zu einer Standardkurve wurde an-schließend die Konzentration berechnet. Das verwendete Kit für Cortisol hatte die Katalognummer LKCO1. Der untere Messbereich betrug 2 ng/ml, die analytischen Sensitivität 2 ng/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten lagen zwischen 5,8% und 8,8% bzw. 6,3% und 10,0%.

3.6.4

Die Konzentration des ACTH wurde mittels Chemilumineszenz-Immunoassay im Analyseautomaten Immulite^® (Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) aus Serumproben bestimmt. Das Testprinzip basiert auf einem Sandwich ELISA. Die im Testtube vorhandene Kugel war mit monoklonalen Maus-Antikörpern gegen ACTH beschichtet. Die zu messende Probe wurde dazugegeben und ACTH band an die Antikörper. Im zweiten Schritt wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase gegen ACTH, dazugegeben und reagierte mit dem gebundenen ACTH. Im dritten Schritt setzte die vorhandene alkalische Phospatase Adamantyl 1,2-dioxetane Arylphosphat durch Abspaltung einer Phos-phatgruppe zu Adamantyldioxtan um, dessen Zerfall eine anhaltende, messbare Lichtemission bedingte. Die Lichtemission war zum ACTH der Probe proportional und wurde im Vergleich zu einer Standardkurve berechnet. Das verwendete Kit für ACTH hatte die Katalognummer LKAC1. Der untere Messbereich betrug 5 pg/ml und die analytische Sensitivität 9 pg/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten lagen zwischen 3,1% und 9,6% bzw. 5,1% und 9,4%.

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3.6.5 Thyroxin und Trijodthyronin

Thyroxin und Trijodthyronin wurden im Blutserum mittels Chemilumineszenz-Immunoassay im Analyseautomaten Immulite^® (Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) gemessen. Das Prinzip ist ein kompetitiver Immunoassay, wie unter 3.6.3 beschrieben. Die verwendeten Teste hatten die Katalognummern LKCT1 für T4

und LKT31 für T3. Der untere Messbereich betrug für T4 und für T3 0,5 µg/dl bzw. 40 ng/dl. Die analytische Sensitivität lag bei 0,12 µg/dl für T4 bzw. 35 ng/ml für T3. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen für T4 10,8% bzw. 13,8% und für T3 13,2% bzw. 15,6%.

3.6.6 Insulin

Die Insulinkonzentration im Serum wurde mit einem Immunoradiometrischen Assay (IRMA; Insuline IRMA KIT, Beckman Coulter, California, USA) bestimmt. Der IRMA beruht auf dem Sandwich Prinzip. Die Proben sowie die Standardproben und Kon-trollen wurden in einem Röhrchen mit an der Wandung festsitzenden monoklonalen Mausantikörpern gegen Insulin zusammen mit I¹²⁵-markierten Mausantikörpern ge-gen Insulin für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die counts per minute (cpm) mit einem Gamma-Counter (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA) gemessen. Die cpm waren proportional zur Menge des Insulins in der Probe und wurden im Vergleich zu einer Standardkurve berechnet. Der untere Messbereich lag bei 3 µIU/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen 7,6% bzw. 10,7%.

3.6.7 17β-Östradiol

17β-Östradiol wurde mittels eines Festphasen Radioimmunoassays (RIA) (Coat-a-count Estradiol, TKE21, Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) aus Serum-proben bestimmt. Dafür wurden mit einem Kaninchen-Antikörper gegen E2 beschich-tete Röhrchen verwendet. Die zu messende Probe wurde mit 200 µl I¹²⁵-markiertem E2 im Röhrchen inkubiert. An der Röhrchenwandung konkurrierte natives E2 mit I¹²⁵ -markiertem E2 um Antikörperbindungsstellen. Der Überstand wurde dekantiert und die cpm gemessen, die umgekehrt proportional zur Konzentration waren. Die Mes-sung fand mit einem Gamma-Counter (Perkin Elmar, Waltham Massachusetts, USA)

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statt und wurde im Vergleich zu einer Standardkurve berechnet. Der untere Mess-bereich für E2 betrug 20 pg/ml, die analytische Sensitivität lag bei 8 pg/ml und die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten differierten zwischen 4,0% und 7,0%

bzw. 6,7% und 9,4%.

3.6.8 Progesteron

Die Progesteronkonzentrationen aus dem antepartalen Zeitraum wurden mit dem Analyseautomaten Immulite^® (Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) bestimmt, um die Messergebnisse taggleich zu erhalten. Das Messprinzip entspricht dem unter 3.6.4 für ACTH beschriebenen Verfahren. Die verwendete KIT Nummer war LKPG1. Der untere Messbereich betrug 0,1 ng/ml mit einer analytischen Sensitivität von 0,2 ng/ml und Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten von 6,3%

– 16% bzw. 5,8% – 16%.

Die Progesteronkonzentrationen der Blutprobe Geburt und des postpartalen Zeitraumes wurden mittels Festphasen RIA (Coat-a-count Progesterone, TKPG1, Siemens Healthcare Diagnostics, Los Angeles, USA) und mit einem Gamma-Counter (Perkin Elmer, Waltham Massachusetts, USA) gemessen. Das Messprinzip entspricht dem unter 3.6.7 für E2 beschriebenen. Der untere Messbereich für Progesteron lag bei 0,02 ng/ml mit einer analytischen Sensitivität von 0,02 ng/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen 4,0% bzw. 7,6%.

3.6.9 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α

Die Konzentration an 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α (PGFM) wurde mittels eines kompetitiven Enzym Immunoassay, beschrieben von Guven et al. (109) und Mishra et al. (110), bestimmt (Protokoll siehe Anhang 9.2 PGFM). Das PGFM-Meerrettich-peroxidase Konjugat und Antiserum wurden von Herrn Prof. Meyer (Physiologie Weihstephan, Technische Universität München, Freisingen, Deutschland) bezogen.

Für die Standardkurve wurde PGFM von Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) verwendet. Das benutze Antiserum hatte eine minimale Kreuzreaktion mit den anderen verwandten Prostaglandinen (PGE2, PGEM, PGA2, PGAM und PGF2α

jeweils <0,01%). Der untere Messbereich betrug 50 pg/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizient lagen bei 3,5% bzw. 11,4%.

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3.6.10 Freie Fettsäuren

Die FFS wurden mit einem automatisierten Analysegerät für klinische Chemie (ABX Pentra 400, Horiba, Montpellier, Frankreich) im Klinischen Labor der Klinik für Rinder bestimmt. Die Messung erfolgt durch eine colorimetrische enzymatische Reaktion mit den FFS-Konzentrationen (Intra-Assay Variationskoeffizient 6,2%).

3.6.11 Lipopolysaccharide

Für den Nachweis aus Lithium-Heparin-Plasma der ersten 5 Tiere aus der LPS-Gruppe wurde der kommerzielle limulus amebocyte lysate endochrome™ Assay (Charles River, Charleston, USA; Protokoll im Anhang 9.3 LPS) genutzt. Die Plasmaproben wurden mit LPS-freiem Wasser (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 1:10 verdünnt und für 5 Minuten auf 80°C erhitzt, um negative Einflüsse von Plasmabestandteilen auf die Agglutinationseigenschaften zu verhindern. Das bakterielle Endotoxin LPS initiiert eine Aktivierung eines Proenzyms, das in An-wesenheit eines farblosen Substrates die Spaltung eines Chromophors bewirkt und gelbes para-Nitroanilin freisetzt. Die Färbung wurde bei 405 nm im Photometer Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) gemessen und gegen eine Standardreihe mit dem Programm Magellan Software mit (Cubic Spline Mode, Magellan 3.11, Dortmund, Deutschland) ausgewertet. Der untere Messbereich lag bei 38 pg/ml und die Wiederfindungsrate bei 63%.