thermostabilen DNA-Polymerase mit erhöhter Akzeptanz für geschädigte DNA
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Sektion der
Universität Konstanz Fachbereich Chemie
Vorgelegt von
Dipl.-Biol. Christian Glöckner aus Bonn,
Juni 2008
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS)
Prüfungsvorsitzender: Prof. Dr. Jörg Hartig 1. Referent: Prof. Dr. Andreas Marx
2. Referent: Prof. Dr. Martin Scheffner
Tag der mündlichen Prüfung: 20. Juni 2008
Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 3115-3117. (Angew. Chem. 2007, 119, 3175-3178.)
C. Gloeckner, K.B.M. Sauter, A. Marx “Evolving a Thermostable DNA-Polymerase That Amplifies f om Highly r Damaged Templates”
weitere Publikationen:
Nat. Protoco sl 2008, 3, 579-587. M. Hafner, E. Vianini, B. Albertoni, L. Marchetti, I. Grüne, C.
Gloeckner, M. Famulok “Displacement o p otein-bound f r aptamers with small molecules screened by fluorescence polarization“
Chemist y Eur. J. r 2007, 13, 6196- 6203.
P. Capek, H. Cahova, R. Pohl, M. Hocek, C. Gloeckner, A. Marx
“An efficient method for the construction of functionalized DNA bearing amino acid groups through c oss-coupling r reactions of nucleoside triphosphates followed by primer extension or PCR“
ChemBioChem 2007, 8, 395-401. M. Strerath, C. Gloeckner, D. Liu, A. Schnur, A. Marx
“Directed DNA polymerase evolution: effects of mutations in motif C on the mismatch-extension selectivi y of the mus t r aquaticus DNA polymerase“
Chemist y Eur. J. r 2007, 13, 3558- 3564.
M. Chandra, S. Keller, C. Gloeckner, B. Bornemann, A. Marx
“New branched DNA constructs“
Free Radic. Biol. Med. 2004, 37, 23-35.
N. Alic, T. Felder, M. D. Temple, C. Gloeckner, V. J. Higgins, P.
Briza, I.W.Dawes “Genome-wide transcriptional responses to a lipid hydroperoxide: adaptation occurs without induction of oxidant defenses“
Ophthalmic Res. 2001, 33, 264- 270.
A. Wegener, H. Laser, M. H. Ahrend, O. Breck, E. Bjerkas, C.
Glockner, P. J. Midtlyng, W. Breipohl “Light scattering in normal and catarac ous lenses of farmed A lantic salmon t t (Salmo salar): a slit lamp and Scheimpflug photographic study“
Mer muss och jünne künne.
(Kölsches Sprichwort)
1 Einleitung ...1
1.1 Biologische Rolle von DNA-Polymerasen ... 1
1.1.1 Aufbau von DNA ... 1
1.1.2 DNA-Polymerasen als Enzyme der Replikation ... 3
1.1.3 DNA-Polymerasen als trans lesion synthesis Enzyme (TLS- Polymerasen)... 7
1.1.4 Experimentelle Bedeutung von DNA-Polymerasen für die Molekularbiologie, Biotechnologie und Diagnostik ... 10
1.2 Die Klentaq DNA-Polymerase ... 12
1.2.1 Entdeckung des thermophilen Bakteriums Thermus aquaticus und erste Beschreibung der Taq DNA-Polymerase... 12
1.2.2 Die Struktur der Klentaq DNA-Polymerase... 14
1.3 Der Reaktionsmechanismus der Polymerisationsreaktion ... 15
1.3.1 Kinetische Parameter während der enzymatischen DNA-Synthese . 15 1.3.2 Der Zwei-Metall-Ionen Mechanismus ... 18
1.4 Gerichtete Evolution... 19
2 Aufgabenstellung...27
3 Ergebnisse und Diskussion...29
3.1 Durchmusterung einer Mutantenbibliothek der N-terminal verkürzten Version der Taq DNA-Polymerase (Klentaq)... 29
3.1.1 Einleitung ... 29
3.1.2 Ergebnisse... 31
3.1.2.1 Konstruktion der randomisierten Klentaq Bibliothek... 31
3.1.2.2 Aufbau des Screening-Systems... 32
3.1.2.3 Auswertung des Screenings... 33
3.1.2.4 Radiometrische Untersuchung der identifizierten Varianten... 35
3.1.2.5 Sequenzierung der positiven Variante... 36
3.1.2.6 Position der mutierten Aminosäure M747 im Enzym K entaq DNA-Polymerase ... 37
l
3.1.2.7 Expression und Reinigung von Klentaq WT und Variante M747K .. 39
3.1.2.8 Untersuchung der Primerextension-Fähigkeit in Abwesenheit verschiedener dNTPs... 40
3.1.2.9 Primerextension-Experimente auf Templaten mit DNA-Schaden.... 42
3.1.2.10 PCR-Amplifikation ausgehend von stark UV-geschädigter Plasmid DNA ... 44
3.1.2.11 Steady sta e kinetische Untersuchungen der Klentaq WT DNA-Polymerase und der Variante M747K ... 48
t 3.1.2.11.1 Einbau- und Fehleinbauverhalten der Polymerasen ... 48
3.1.2.11.2 Verlängerung von kanonisch und nicht-kanonisch eingebauten Nukleotiden... 49
3.1.2.11.3 Einbauverhalten gegenüber einer stabilisierten abasischen Stelle.. ... 50
3.1.2.11.4 Verlängerung von Primern, die gegenüber einer stabilisierten abasischen Stelle enden. ... 52
3.1.2.12 Analyse des Fehlerspektrums der Klentaq WT Polymerase und der Variante M747K ... 53
3.1.3 Diskussion ... 54
3.2 Randomisierung der Aminosäureposition M747 der Klentaq DNA- Polymerase... 58
3.2.1 Einleitung... 58
3.2.2 Ergebnisse ... 59
3.2.2.1 Herstellung der randomisierten Bibliothek Klentaq M747... 59
3.2.2.2 Durchmusterung der Klentaq M747 Bibliothek ... 59
3.2.2.3 Sequenzierung von ausgewählten Varianten der Klentaq M747 Bibliothek... 61
3.2.2.4 Primerextension-Reaktionen auf geschädigten Templaten mit ausgewählten Varianten... 62
3.2.2.5 Untersuchung der Prozessivität ausgewählter Varianten ... 63
3.2.2.6 Titration ausgewählter Varianten der Klentaq M747 Bibliothek im PCR-Experiment... 66
3.2.3 Diskussion ... 68
3.3 Kombination der Varianten M747K und M747R mit der Variante I614K ... 70
3.3.1 Einleitung ... 70
3.3.2 Ergebnisse... 71
3.3.2.1 Generierung und Expression der Klentaq Varianten KTQ I614K, KTQ DM (KK) und KTQ DM (KR) ... 71
3.3.2.2 Untersuchung der spezifischen Aktivität der verschiedenen K entaq Varianten... 72
l l l 3.3.2.3 Untersuchung des DNA-Schaden-Bypass in der Primerextension- Reaktion ... 73
3.3.2.4 Untersuchung der Prozessivität der verschiedenen Klentaq Varianten ... 74
3.3.2.5 Untersuchung der Thermostabilität der verschiedenen K entaq Varianten... 76
3.3.2.6 Titration der DNA-Polymerase Konzentration in der PCR ... 77
3.3.2.7 Titration der Templatkonzentration in der PCR ... 78
3.3.2.8 Bestimmung des Fehlerspektrums der verschiedenen K entaq Varianten... 79
3.3.2.9 Pre-steady state kinetische Untersuchungen auf ungeschädigter DNA ... 80
3.3.2.10 Pre-steady state kinetische Untersuchungen an der stabilisierten abasischen Stelle ... 82
3.3.2.10.1 Einbau von dATP und dGTP gegenüber der stabilisierten abasischen Stelle ... 82
3.3.2.10.2 Verlängerung nach der stabilisierten abasischen Stelle ... 83
3.3.2.11 Sequenz- und Strukturvergleiche der Positionen 614 und 747... 85
3.3.3 Diskussion ... 91
4 Zusammenfassung und Ausblick ...101
5 Material... 105
5.1 Chemikalien ... 105
5.2 Nukleotide und Radiochemikalien ... 106
5.3 Standards und Kits ... 107
5.4 Enzyme und Proteine ... 107
5.5 Bakterienstämme und Plasmide... 108
5.6 Medien und Zellkulturpuffer ... 109
5.7 Elektrophoresepuffer ... 110
5.8 Oligonukleotide ... 111
5.9 Verbrauchsmaterial ... 112
5.10 Geräte ... 113
6 Methoden ... 115
6.1 Molekularbiologische Methoden ... 115
6.1.1 Reinigung und Quantifizierung von DNA... 115
6.1.2 Agarosegelelektrophorese ... 116
6.1.3 DNA Extraktion aus Agarosegelen ... 116
6.1.4 Denaturierende Polyacrylamidgelelektro-phorese (PAGE)... 116
6.1.5 Isolierung von DNA aus Polyacrylamidgelen ... 117
6.1.6 Ethanolpräzipitation... 118
6.1.7 DNA Reinigung nach enzymatischen Reaktionen ... 118
6.1.8 Isolation von Plasmid DNA ... 118
6.2 Allgemeine enzymatische Reaktionen ... 119
6.2.1 5'-Phosphorylierung mit [γ32P]-ATP... 119
6.2.2 Restriktionsverdau doppelsträngiger DNA ... 119
6.2.3 Dephosphorylierung des geschnittenen Vektors... 120
6.2.4 Ligation doppelsträngiger DNA ... 120
6.2.5 DNA-Sequenzierung ... 121
6.3 Mikrobiologische Methoden ... 121
6.3.1 Plattenkultur... 121
6.3.2 Flüssigkultur ... 121
6.3.3 Glycerinkultur ... 122
6.3.4 Herstellung elektrokompetenter E. coli BL21 (DE3) Gold Zellen ... 122
6.3.5 Elektroporation ... 123
6.4 Proteinbiochemische Methoden ... 123
6.4.1 Expression im 96-well Format ... 123
6.4.2 Expression und Lysatherstellung im präparativen Maßstab ... 124
6.4.3 Isolierung der Polymerasen... 125
6.4.4 Glycin-SDS-PAGE Gelelektrophorese... 126
6.4.5 Coomassie-Färbung von SDS-PAGE Gelen... 126
6.4.6 Konzentrationsbestimmung von Proteinen nach Bradford... 126
6.5 Enzymkinetische Methoden... 127
6.5.1 Primerextension-Reaktionen mit radiometrischer Produktanalyse 127 6.5.2 Bestimmung der spezifischen Aktivität... 127
6.5.3 Steady state kinetische Untersuchungen mit radiometrischer Produktanalyse... 128
6.5.4 Pre-steady state kinetische Untersuchungen ... 129
7 Abkürzungsverzeichnis...133
8 Experimentalteil ...137
8.1 Screening der Bibliothek mit SYBRgreenI im 384-well Format ... 137
8.2 Primerextension Assay mit Klentaq Lysaten... 137
8.3 Primerextension-Experimente in Abwesenheit verschiedener dNTPs ... 138
8.4 Primerextension-Experimente auf Templaten mit DNA-Schäden ... 138
8.5 PCR-Amplifikation ausgehend von stark UV-geschädigter DNA... 139
8.6 Steady sta et kinetische Messungen ... 140
8.6.1 Einbau und Fehleinbauverhalten... 140
8.6.2 Match- und Mismatch-Verlängerungsverhalten ... 141
8.6.3 Einbau gegenüber der stabilisierten abasischen Stelle... 141
8.6.4 Verlängerung nach der stabilisierten abasischen Stelle... 142
8.7 Analyse des Fehlerspektrums ... 142
8.8 Herstellung der randomisierten Bibliothek Klentaq M747 ... 144
9 Literatur... 145
10 Anhang ... 161
10.1 Nukleinsäuresequenzen... 161
10.1.1 Oligonukleotide ... 161
10.1.2 Klentaq Open Reading Frame... 164
10.2 Vektorkarten... 165
10.3 Danksagung ... 168
10.4 Eidesstattliche Erklärung... 170
1 Einleitung
1.1 Biologische Rolle von DNA-Polymerasen
1.1.1 Aufbau von DNA
Die genomische DNA ist ein Makromolekül, das aus vier verschiedenen Bausteinen, den Desoxyribonukleotiden, aufgebaut ist. 1869 entdeckte Miescher in Zellextrakten aus Eiterzellen (Leukozyten) eine unbekannte, azide Substanz, die sich in ihren Eigenschaften von Proteinen unterschied. Da er diese Substanz den Zellkernen (lat.
nuclei) zuordnete, nannte er sie Nucleinsäure, ein Begriff, der bis heute verwendet wird.1 Die vier in der DNA vorkommenden Desoxyribonukleinsäuren unterscheiden sich durch die Identität ihrer Nukleobase, zeigen jedoch alle ein gleiches Grundgerüst, bestehend aus Phosphat, Zucker (2’-Desoxyribose) und Base (Adenin, Guanin, Cytosin oder Thymin) (Abb. 1).
Abb. 1: Aufbau der 2’-Desoxyribonukleinmonophosphate (dNMPs) als Bausteine der DNA.
Sie sind kovalent über eine 5’-3’-Phosphodiesterbindungen miteinander verbunden und bilden einen DNA-Strang, der mit einem zweiten Strang antiparallel über
Wasserstoffbrückenbindungen in der DNA verknüpft ist. Die räumliche Struktur eines DNA-Doppelstranges (dsDNA) wurde das erste Mal 1953 durch Watson und Crick beschrieben.2 Dieses bis heute gültige Modell beschreibt eine rechtsgängige DNA- Doppelhelix, bei der eine Umwindung aus ca. zehn gepaarten Nukleotiden besteht und eine Länge von 34 Å (= 3,4 nm) ausmacht. Die negativ geladenen Phosphate bilden zusammen mit den Furanosen das Zuckerphosphat-Rückgrat, wobei die Phosphate nach außen gerichtet sind und der DNA ihre negative Ladung verleihen. Die Nukleobasen zeigen ins Innere der Helix und stehen durch Wasserstoffbrückenbindungen in Kontakt, wobei immer ein Adenosin (A) mit einem Thymidin (T) und ein Guanosin (G) mit einem Cytidin (C) paart.2,3 Es entstehen die für DNA typischen AT- und GC-Basenpaare, wovon erstere über zwei, letztere über drei Wasserstoffbrücken verfügen. Dass Adenosin immer mit Thymidin und Guanosin immer mit Cytidin paaren, postulierte der Biochemiker Chargaff bereits in den 1940ern, ohne jedoch zu wissen, wie sie räumlich angeordnet waren.4,5
Abb. 2: Verschiedene Geometrien der DNA.
links: A-Form, mitte: B-Form, rechts: Z-Form (Ref 6).
Durch die antiparallele Laufrichtung der beiden Stränge und die Geometrie der Nukleobasen entsteht in der DNA eine große, offene und eine kleine, geschlossene Furche. Die DNA kommt in ihrer natürlichen Erscheinung meist in der B-Form vor, was eine rechtsgängige Helix mit einer Laufweite von 34 Å pro Windung und einer
großen sowie kleinen Furche beschreibt (Abb. 2). Unter extremen Bedingungen (Dehydrierung, hohe Salzkonzentration) erscheint die DNA-Doppelhelix gedrungener und weiter als in der B-Form. Diese Form wird als A-Form bezeichnet und besitzt ca.11 Basenpaare pro Windung, eine schmalere große Furche und einer weitere kleine Furche, wodurch der Durchmesser von ca. 20 Å auf 26 Å ansteigt. Die A-Form ist ebenfalls rechtsgängig, im Gegensatz zur Z-Form der DNA, die linksgängig ist und sich durch annähernd gleich weite Furchen auszeichnet.6,7
1.1.2 DNA-Polymerasen als Enzyme der Replikation
Die besondere Struktur der DNA als komplementäre Doppelhelix birgt zugleich die Möglichkeit der Vervielfältigung in sich, da jeder Strang als Templat zur Synthese des anderen Stranges dienen kann. Diese Möglichkeit postulierten Watson und Crick bereits bei der Veröffentlichung der räumlichen Struktur, indem sie die Publikation mit dem berühmten Satz beendeten: „It has not e caped our notice that the specific pairing we have postulated immedia ely suggests a possible copying mechanism for the genetic material.“.
s t
r
2 Bis zu diesem Zeitpunkt waren jedoch keine Enzyme bekannt, die dieses Polymer aufbauen konnten und so wurde u.a. über eine autokatalytische Funktion der DNA spekuliert.3 Kornberg et al. konnten 1956 ein Enzym aus Escherichia coli (E. coli) isolieren und die Eigenschaft der DNA-Synthese nachweisen, weshalb sie dieses Enzym als DNA-Polymerase I benannten.8-10 Seither sind in Pro- und Eukaryoten zahlreiche DNA-Polymerasen mit unterschiedlichen Funktionen und Strukturen entdeckt worden.11,12 Sie nehmen an den Prozessen der Replikation, Reparatur und Rekombination der DNA teil.8
Die Replikation in E. coli findet in einem Multienzymkomplex statt, der als Replisom bezeichnet wird.13-15 Dabei werden verschiedene Aufgaben von unterschiedlichen Enzymen und Proteinen übernommen. Es wird angenommen, dass die DNA ausgehend vom oriC (o igin of replication) in einem ATP-abhängigen Schritt von der DnaB- Helikase entwunden wird, so dass die DNA in zwei Einzelsträngen vorliegt und ihre
helikale Struktur verliert. Die Einzelstränge werden durch SSB-Proteine (single strand binding proteins) stabilisiert (Abb. 3).
Abb. 3: Darstellung des Replisoms aus E. coli. Die Grafik wurde aus Ref. (15) entnommen.
Anschließend wird der DNA-Polymerase III Holoenzym-Komplex an der Replikationsgabel aufgebaut. Dieser besteht aus zehn unterschiedlichen Proteinen, die sich in drei funktionelle Hauptgruppen unterteilen lassen: 1) Pol III Hauptenzym (pol III core), 2) β-Klammer-Untereinheit (β-sliding clamp) und 3) γ-Klammer-Ladeeinheit (clamp loader). Das Holoenzym enthält zwei Pol III Hauptenzyme, die die DNA- Synthese an jeweils einem Strang übernehmen und durch die β-Klammer-Untereinheit am DNA-Strang stabilisiert werden. Die Interaktion zwischen Pol III und β-Klammer- Untereinheit führt zu einer Erhöhung der Prozessivität der Pol III, so dass diese 500-1000 Nukleotide pro Sekunde synthetisieren kann.14 Für den Start der DNA- Synthese durch Pol III ist ein freies 3’OH-Ende an einem kurzen Nukleotidstrang (Primer) notwendig, der als Startpunkt dient. Dieses kurze Oligomer wird von einer spezialisierten RNA-Polymerase, der Primase in Form kurzer RNA Stücke (ca. 12 nt) gebildet.16 Da die Synthese der zwei antiparallelen Tochterstränge gleichzeitig erfolgt
und sich das Replisom entlang der DNA in nur eine Richtung bewegt, kann sie auf einem Strang kontinuierlich (leading strand synthesis), auf dem anderen Strang (Folgestrang) jedoch nur in Bruchstücken diskontinuierlich erfolgen (lagging strand synthesis). Nach der Synthese eines kurzen Stückes auf dem Folgestrang muss die Pol III dissoziieren und wieder im Bereich der DnaB-Helikase einen neu entwundenen Einzelstrangbereich binden. Das Öffnen und Schließen der β-Klammer-Untereinheit als Vorraussetzung für eine Dissoziation und erneute Assoziation an der DNA wird dabei durch die γ-Klammer-Ladeeinheit ermöglicht. Die kurzen DNA-Stücke, die immer wieder an einem neuen RNA Primer beginnen und bis zum vorhergegangenen RNA Primer synthetisiert werden, werden nach ihren Entdeckern Taneko und Reiji Okazaki als Okazaki-Fragmente bezeichnet.17,18 Das Ehepaar schlug 1968 das Modell der diskontinuierlichen DNA-Synthese vor.
Die in der replizierten DNA enthaltenen kurzen RNA Primer werden nach erfolgter Replikation von einer weiteren Polymerase, der DNA-Polymerase I entfernt und durch DNA ersetzt. Dieses Enzym besitzt eine 5’-3’-Exonukleaseaktivität, so dass es an dem 3’-Ende eines Okazaki-Fragmentes ansetzen kann und den RNA Primer des vorangehenden Okazaki-Fragmentes abbaut, während es gleichzeitig die entstehende Lücke auffüllt. Dieser Prozess des Entfernens mit gleichzeitiger Neusynthese wird als nick-translation bezeichnet. Die entstandene DNA enthält danach immer noch nicht verbundene Fragmente, da die DNA-Polymerase I keine Phosphodiesterbindung zum vorangehenden DNA Stück herstellen kann. Diese Bindung wird durch DNA-Ligasen vermittelt.
Bei der eukaryotischen Replikation sind zwei unterschiedliche DNA-Polymerasen an den beiden zu replizierenden Strängen zu finden, namentlich DNA-Polymerase δ (Pol δ) und DNA-Polymerase ε (Pol ε).19 Bisher ist nicht genau bekannt, welche der beiden Polymerasen den Leitstrang und welche den Folgestrang kopiert. Es gibt jedoch experimentelle Hinweise darauf, dass die DNA-Polymerase ε die Synthese des Leitstranges in der Hefe Saccharomyces cerevisiae übernimmt.20Kunkel et al. führten eine Mutation in die Polymerase ein, die zu einer gesteigerten Fehleinbaufunktion für dTMP gegenüber dT im Templat führte, sonst jedoch keine Veränderung der
Selektivität zeigte. Durch Verwendung einer Reporterkassette und anschließender Sequenzierung der in S. cerevisiae replizierten DNA konnte Pol ε anhand des Mutationsspektrums der Leitstrang-Synthese (leading strand) zugeordnet werden.
Demnach wäre Pol δ für die Synthese des Folgestranges verantwortlich. Pol α (alpha) wird dem Primosom zugeordnet und dient der Initiation der Replikation, ähnlich der Primase im prokaryotischen Replikationskomplex. Weitere klassische eukaryotische DNA-Polymerasen sind Pol γ (gamma) und Pol β (beta), wobei Pol γ für die Replikation der mitochondrialen DNA zuständig ist und Pol β das Auffüllen von Lücken übernimmt, die während der Reparatur von DNA-Schäden entstehen (BER, base excision repair).21 Pol γ ist die einzige bekannte Polymerase in Mitochondrien und es wird vermutet, dass diese für die gesamte mitochondriale DNA-Synthese, inkl. der Reparatur, verantwortlich ist.22,23
Neben den klassischen eukaryotischen DNA-Polymerasen α, β, γ, δ, ε sind in den letzten Jahren zahlreiche neue DNA-Polymerasen entdeckt worden, denen eine besondere Rolle bei der Reparatur und dem Überlesen von DNA-Schäden zuteil wird.
Diese werden in der X- und Y-Familie zusammengefasst und beinhalten die Polymerasen ζ (zeta), η (eta), θ (theta), ι (jota), κ (kappa), λ (lambda), μ (my), σ (sigma) und φ (phi).11,21,24 Die Wichtigkeit dieser DNA-Polymerasen wir deutlich, sobald diese Funktionsstörungen zeigen und mit Krankheitsbildern in Verbindung gebracht werden können. So führt z.B. der Ausfall von Pol η zu einer Variante der menschlichen Xeroderma pigmentosum (XP-V), einer Hautkrebserkrankung, bei der die betroffenen Patienten eine extreme Überempfindlichkeit gegenüber Sonnenlicht zeigen. Die UV- Licht induzierten Schäden können nicht mehr repariert werden, so dass diese akkumulieren und zu Melanomen führen.25,26
1.1.3 DNA-Polymerasen als trans lesion synthesis Enzyme (TLS-Polymerasen)
Zelluläre DNA ist ständig Umwelteinflüssen ausgesetzt, die zu Schäden in der DNA führen können. Schätzungen der Häufigkeit von DNA-Schäden variieren stark und liegen in einem Bereich zwischen 104-106 Schäden pro humaner Zelle pro Tag. Bei ca.
1012 Zellen in einem adulten menschlichen Körper entstehen somit zwischen 1016-1018 DNA-Schäden täglich. Da bereits kleine Veränderungen im Genom Krebs induzieren können, ist die Notwendigkeit für effektive Reparaturmechanismen leicht einsehbar.27 Ursachen für DNA-Schäden sind u.a. der ultra-violette Anteil des Sonnenlichts (UV- Strahlung), Röntgen-Strahlung, reaktive Sauerstoffspezies (ROS), chemische Wirkstoffe (synthetisch oder natürlich) und spontane Hydrolyse, wodurch zahlreiche Schäden induziert werden.27 Diese umfassen z. B. Einzel- und Doppelstrangbrüche, Abspaltung der Basen durch Hydrolyse (abasische Stellen), oxidierte Basen und Ribosen, methylierte Basen, lichtinduzierte Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere (CPDs), kovalente Verknüpfung beider DNA-Stränge (interstrand crosslinks, ICL) oder große DNA- Addukte durch Addition reaktiver Moleküle.27-33 Diese Schäden stellen für replikative DNA-Polymerasen eine große Blockade dar und es war lange Zeit nicht klar, wie Zellen mit diesen Schäden umgehen. Mittlerweile sind einige Reparaturmechanismen bekannt, wie das Ausschneiden einer Base (base excision repair, BER)33-37 oder des Nukleotids (Nukleotide excision repair, NER) 38-40, Fehlpaarungsreparatur (misma ch repair, MMR)
t
41,42, Doppelstrangbruch-Reparatur durch entweder homologe
Rekombination (HR)43,44 oder durch Verbinden der nicht-homologen Enden (non- homologous end joining, NHEJ).27
Eine weitere Möglichkeit neben der Reparatur der DNA-Schäden ist das Überlesen dieser Positionen. Dabei wird der blockierte Replikationsapparat von DNA- Polymerasen unterstützt, die zum großen Teil der Y-Familie angehören und unter dem Begriff TLS-Polymerasen (trans lesion synthesis) zusammengefasst werden.11,24,45,46
Abb. 4: Zusammenspiel replikativer und TLS-Polymerasen während der Replikation.
Das Schema zeigt die Blockade einer replikativen DNA-Polymerase (gelb) vor einem DNA-Schaden (rot).
Diese wird durch je nach Art des Schadens verschiedene TLS-Polymerasen (grün, blau) beim Überlesen des Schadens unterstützt und übernimmt anschließend wieder die Synthese. Ref. 45 entnommen.
Sobald die Synthese des Replikationsapparates an einem DNA-Schaden zum Erliegen kommt, wird dieser von TLS-Polymerasen unterstützt. Dabei kommt es zu einer Mono- Ubiquitinierung des Prozessivitätsfaktors PCNA in Eukaryoten, woraufhin TLS- Polymerasen, wie Pol η, Pol ι, Pol κ und Rev1 zur Stelle des DNA-Schadens rekrutiert werden.47 Je nach dem welche Läsion in der Templat-DNA vorliegt, wird diese dann von einer der TLS-Polymerasen überlesen. TLS-Polymerasen sind nur wenig prozessiv und synthetisieren nur einige Basenpaare, bevor sie wieder dissoziieren. Ist der DNA- Schaden überlesen, können die replikativen DNA-Polymerasen mit der normalen Synthese fortfahren (Abb. 4). Der Wechsel von replikativen zu TLS-Polymerasen während der Replikation wird als polymerase switch bezeichnet.47
Beim Überlesen des DNA-Schadens können verschiedene Situationen entstehen (Abb.
5):
1) es wird ein richtig kodierendes Nukleotid gegenüber dem Schaden eingebaut, 2) es wird ein falsch kodierendes Nukleotid eingebaut (Basensubstitution),
3) es wird ein Nukleotid eingebaut, das mit der nächsten Templatbase paaren kann, und es erfolgt eine Verschiebung von Primer zu Templat (-1 frameshift), 4) es werden zwei Nukleotide eingebaut, so dass es ebenfalls zu einer
Verschiebung von Primer und Templat kommt (+1 frameshift).
Abb. 5: Möglichkeiten während der TLS.
Rotes X: DNA-Schaden, 1) Einbau des richtig kodierenden Nukleotids (grün), 2) falsch kodierendes Nukleotid (rot), 3) Basenpaarung mit dem nächsten kodierenden Nukleotid im Templat, DNA-Schaden ist extrahelikal ausgestülpt, 4) Einbau von zwei Nukleotiden gegenüber dem DNA-Schaden.
Die Häufigkeit einer Basensubstitution und eines -1 frame hifts ist relativ groß, während +1 frameshifts nur selten vorkommen.
s
48-50 Die Y-Familie der DNA-
Polymerasen wurde erst 2001 als solche definiert, nachdem immer mehr DNA- Polymerasen mit den gleichen Eigenschaften in verschiedenen Organismen der drei Reiche entdeckt wurden. Zuvor wurde diese als UmuC/DinB/Rev1/Rad30-Superfamilie bezeichnet.51 Obwohl sie untereinander eine signifikante Aminosäuresequenz- Homologie aufweisen, unterscheiden sie sich doch stark von den fünf bisher bekannten Polymerase-Familien (A, B, C, D, X).49,51 Gemeinsam ist ihnen die Fähigkeit, DNA- Schäden zu überlesen sowie eine hohe Fehlerrate bei der Replikation ungeschädigter DNA. 46,52,53 Ihre räumliche Struktur weist mehrere Besonderheiten gegenüber den bisher bekannten DNA-Polymerasen auf. So besitzen alle Y-Familie-Polymerasen neben der üblichen Finger-, Daumen- und Handflächendomäne noch eine weitere, C- terminal gelegene Domäne, die als kleine-Finger-Domäne bezeichnet wird und aus ca. 100 Aminosäuren besteht.54 Sie spielt eine bedeutende Rolle bei der Bindung des DNA Subtrates und weist eine hohe Flexibilität auf.24 Des Weiteren ist das aktive
Zentrum der Y-Familie-Polymerasen wesentlich weiter geöffnet, relativ flexibel und solvenszugänglich, im Gegensatz zu dem der replikativen DNA-Polymerasen. Gerade diese Eigenschaft gibt Y-Familie-Polymerasen die Möglichkeit, große DNA-Addukte aufzunehmen und während der Synthese Templatbasen auszustülpen, so dass ein -1 frameshift entstehen kann. Durch die Weite und Flexibilität des aktiven Zentrums haben sie weniger Möglichkeiten, korrekte gegen falsche Basenpaarung durch sterische Einflüsse zu diskriminieren, wie die Polymerasen der A- und B-Familie, was in einer verringerten Selektivität und katalytischen Effizienz resultiert.55-57 Einige Erkrankungen werden mit Mutationen in den entsprechenden Y-Familie-Polymerasen in Verbindung gebracht z.B.: Xeroderma Pigmentosum Variante (XP-V, Pol η) oder Lungenneoplasie (Pol ι).25,26,58,59
1.1.4 Experimentelle Bedeutung von DNA- Polymerasen für die Molekularbiologie, Biotechnologie und Diagnostik
DNA-Polymerasen zählen mittlerweile zu den wichtigsten Enzymen in der biologischen-, biotechnologischen und biomedizinischen Forschung und Diagnostik.
Die Möglichkeit genetisches Material gezielt durch Verwendung von DNA- Polymerasen zu amplifizieren, zu sequenzieren, auf Einzelbasenvariationen zu untersuchen oder zu markieren, hat den Fortschritt in der Genetik, Molekularbiologie, Biotechnologie und Medizin extrem beschleunigt. Die dabei grundlegende und wichtigste auf DNA-Polymerasen basierende Methode ist die durch Mullis entwickelte polymerase chain reaction (PCR). Diese zunächst mit dem Klenow Fragment (KF) der DNA-Polymerase I aus E. coli entwickelte Methode beruht auf der gezielten in vitro Vervielfältigung eines durch kurze Oligonukleotide (Primer) markierten DNA- Abschnittes durch Verwendung einer DNA-Polymerase und 2’-Desoxyribonukleotiden als Bausteine. Die Verwendung der mesophilen KF DNA-Polymerase erforderte eine Zugabe des Enzyms nach jedem Denaturierungsschritt, da dieses nicht thermostabil
war und inaktiviert wurde. Es wurde eine 2,2 x 105-fache Vervielfältigung der Ausgangs DNA in 20 iterrativen Zyklen erreicht.60,61
Erst durch Einsatz der DNA-Polymerase I aus dem thermophilen Bakterium Thermu aquaticus (Taq) wurde der Schritt der wiederholten Enzymzugabe überflüssig, da diese thermostabil ist.
s
62 Zudem konnte durch Erhöhung der Anlagerungstemperaturen der Primer die Spezifität und Ausbeute für das PCR-Produkt erhöht werden.62 Da die Amplifikation nicht linear, sondern exponentiell erfolgt, können innerhalb weniger Zyklen geringe DNA Mengen stark amplifiziert werden, so dass ausreichend Material für weitere Analysen oder Experimente zur Verfügung steht.
Seit der Einführung der PCR-Methode 1985 sind neben der Taq Polymerase zahlreiche DNA-Polymerasen aus anderen Organismen isoliert worden und finden mittlerweile standardmäßigen Einsatz. Sie unterscheiden sich durch Eigenschaften wie Prozessivität, Korrekturlesefunktion (3’-5’-Exonuklease, proofreading function), Selektivität, Strangentfernung (strand displacement), Strangbruchverschiebung (5’-3’- Exonuklease, nick translation) und Thermostabilität. Zudem sind neben den nativen Enzymen Varianten entwickelt worden, deren Eigenschaften für bestimmte Anwendungen optimiert wurden (z.B. PhusionTMHigh-Fidelity, Hot Start Polymerasen, Einbau von ddNTPs für die Sequenzierung, Akzeptanz von Heparin in Blutproben).63-65 Neben der einfachen Vervielfältigung der DNA findet die PCR-Methode Anwendung bei der Quantifizierung von Fremd-DNA (z.B. aus Pathogenen, Q-PCR)66,67, Identifizierung von Personen in der Forensik (genetischer Fingerabdruck, Vaterschaftstest)68, Diagnostik von Einzelnukleotidvariationen in der medizinisch- genetischen Beratung (SNP-detection)69,70, Herstellung von diversifizierten Mutantenbibliotheken (error-prone PCR, site directed mutagenesis)71, Einführung von Fluoreszenzmarkierungen für Microarray-Anwendungen und Sequenzierung von DNA.72
1.2 Die Klentaq DNA-Polymerase
1.2.1 Entdeckung des thermophilen Bakteriums Thermus aquaticus und erste Beschreibung der Taq DNA-Polymerase
Das thermophile Bakterium Thermus aquaticus wurde das erste Mal 1969 als neue Gattung und Spezies von Brock und Freeze beschrieben.73 Sie arbeiteten mit Isolaten aus heißen Quellen des Yellowstone National Parks und aus anderen heißen Thermalquellen in Kalifornien, USA. Des Weiteren beschrieben sie das Vorkommen in heißen Trinkwasserleitungen, weit entfernt von heißen Quellen.73 Trela e a . isolierten 1976 das erste Mal eine DNA-Polymerase aus dem Organismus und nannten sie Taq DNA-Polymerase.
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74 Sie besitzt eine große Homologie zur DNA-Polymerase I aus E. coli, obwohl ihr die 3’-5’-Exonukleasefunktion (proofreading) fehlt, mit einer Konservierung der Aminosäuresequenz der C-terminalen Polymerasedomänen von 49,6% (Taq 420 - 832, E. coli Pol I 516 - 928).75,76 Die E. coli Pol I lässt sich durch einen Trypsin-Verdau in zwei Untereinheiten spalten, wovon die kleinere Untereinheit die 5’-3’-Exonukleasefunktion trägt und die größere Untereinheit die Polymerase- und 3’-5’-Exonukleasefunktion. Die letztere Untereinheit wird nach ihrem Entdecker Klenow als Klenow Fragment (KF) bezeichnet.77-79 Analog wird hierzu die Taq DNA- Polymerase ohne die 5’-3’-Exonukleasefunktion als Klentaq (Klenow Fragment der Taq Polymerase) benannt.80 Da sie per se keine 3’-5’-Exonukleasefunktion besitzt, zeichnet sich die Klentaq DNA-Polymerase durch die reine Polymerasefunktion aus.
1989 beschrieben Lawyer und Stoffel erstmals die rekombinante Expression von Taq DNA-Polymerase in E. coli als Volllängenenzym und einer verkürzten Version, die sie aus einer Phagenbibliothek isoliert hatten.81 Die verkürzte Version, die eine N- terminale Deletion der ersten 288 Aminosäuren aufwies, wurde als Stoffel Fragment bezeichnet und umfasste ebenfalls nur die reine Polymerasedomäne.81,82Vainshtein et al. versuchten 1996 das Stoffel Fragment weiter zu verkürzen und deletierten N- terminal verschieden lange Aminosäureabschnitte. Dabei konnten sie zeigen, dass eine
Deletion um weitere 12 Aminosäuren (Stof∆12) keinen Einfluss auf Aktivität und Thermostabilität verursachten. Deletierten sie jedoch insgesamt 47 Aminosäuren (Stof∆47), zeigte sich ein dramatischer Verlust von Aktivität und Thermostabilität.
Interessant war nun, dass durch Zugabe eines synthetischen 33 Aminosäure langen Peptides, das wie der deletierte Bereich ein β-Faltblatt bildete, die Aktivität und Thermostabilität der Stof∆47 Mutante wieder hergestellt werden konnte.83
Die in dieser Arbeit verwendete Version der Taq Polymerase ist N-terminal um vier Aminosäuren gegenüber dem Stoffel Fragment verkürzt und umfasst die Aminosäuren 293-832 (Nummerierung nach Taq Volllängenenzym), was eine Gesamtlänge von 540 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von 61 kDa ergibt. Die Klentaq Polymerase zeichnet sich durch eine etwa doppelt so hohe Thermostabilität im Vergleich zum Volllängenenzym Taq aus und weist zudem eine mit 5 x 10-5 halb so hohe Fehlerrate auf.75,80,82
1.2.2 Die Struktur der Klentaq DNA-Polymerase
Die Struktur der Klentaq DNA-Polymerase wurde 1998 von Li et al. als binärer und ternärer Komplex gelöst.84 Drei Jahre zuvor beschrieben Kim et al. bereits die apo-Form des Volllängenenzyms Taq DNA-Polymerase.85 Beide Veröffentlichungen zeigen eine für DNA-Polymerasen typische Struktur, die einer rechten Hand ähnelt und in der die drei Bereiche Finger-, Handflächen- und Daumendomäne unterschieden werden.
Abb. 6: Ribbon-Darstellung des geschlossenen ternären Komplexes der Klentaq DNA-Polymerase (3KTQ).
Gezeigt ist die Struktur der Polymerase mit Primer/Templat und ddCTP in der geschlossenen Konformation. Finger- (grün), Daumen- (blau) und Handflächendomäne (magenta) formen eine handähnliche Struktur. Die O-Helix der Fingerdomäne ist rot dargstellt, gelb ist der N-terminale Bereich.
Primer: grau, Templat: hellblau. Entnommen aus Ref. 84.
Li et al. konnten durch die Struktur der beiden ternären Komplexe (Polymerase, Primer/Templat und ddCTP) eine Bewegung der Fingerdomäne um einen Winkel von 46° nachweisen. Sie beschreiben eine offene und geschlossene Konformation (pdb- Dateien: 2KTQ bzw. 3KTQ). Demnach bindet die DNA-Polymerase zunächst in einer offenen Konformation an den Primer/Templat-Komplex (binärer Status), gefolgt vom
Eintritt des Nukleosidtriphosphates (ternärer Status). Anschließend erfolgt die Bewegung der Fingerdomäne zum geschlossenen Komplex, woraufhin die Bindung des Nukleotides an das 3’-OH-Endes erfolgt.84 Eine nachfolgende Öffnung der Polymerasedomäne führt zum Freisetzen des Pyrophosphates und der Translokation entlang der DNA.
1.3 Der Reaktionsmechanismus der Polymerisationsreaktion
1.3.1 Kinetische Parameter während der enzymatischen DNA-Synthese
Die DNA-Synthese durch DNA-Polymerasen ist ein mehrschrittiger, komplexer Vorgang. Abb. 7 zeigt ein Reaktionsschema der enzymatischen DNA-Synthese.
Abb. 7: Reaktionsschema der enzymatischen DNA Synthese.
E-DNA: Enzym an DNA gebunden, E-DNA-dNTP: E-DNA mit gebundenem dNTP, E*: Enzym in veränderter Konformation, PPi: Pyrophosphat
Zunächst bindet die DNA-Polymerase an einen Primer/Templat-Komplex, so dass für das Anknüpfen eines Nukleotides ein freies 3’-OH-Ende zur Verfügung steht (E-DNA), woraufhin ein 2’-Desoxyribonukleotid (dNTP) in die Bindungstasche der DNA- Polymerase eintreten kann (Schritt 1) und der ternäre Komplex aus Polymerase, Primer/Templat und dNTP entsteht. Hier findet der erste Schritt der Diskriminierung zwischen einem kanonisch paarenden und einem fehlpaarenden Nukleotid statt. Nun erfolgt eine Änderung der Polymerasekonformation (E→E*), so dass eine zum gebildeten Watson-Crick-Basenpaar formkomplementäre Bindungstasche ensteht (Schritt 2, induced fit mechanism), wodurch eine weitere Selektion des korrekt paarenden dNTP erfolgt. Die Konformationsänderung bewirkt eine Ausrichtung des dNTP und der für die folgende Katalyse wichtigen Aminosäurereste zum freien 3’-OH- Ende des Primers. Bei der Entstehung der neuen Phosphodiesterbindung zwischen Primer und dNTP wird ein Pyrophosphat freigesetzt (PPi, Schritt 3), das den Polymerase-DNA-Komplex verlässt (Schritt 4). Anschließend ergeben sich für die Polymerase drei Reaktionswege: 1) Translokation der Polymerase und Einbau weiterer Nukleotide (knext), 2) Dissoziation der Polymerase vom Substrat (koff) und 3) Entfernen des zuletzt eingebauten Nukleotides (kexo), falls die Polymerase eine 3’-5’- Exonukleasefunktion besitzt (proofreading).
Welchen Reaktionsweg eine Polymerase dabei einschlägt, hängt im Allgemeinen vom gebundenen Substrat ab. Ist ein korrekt paarendes dNTP gebunden, so läuft der Reaktionsweg knext wesentlich schneller ab als koff oder kexo. Bei einer Fehlpaarung ist kexo gegenüber knext bevorzugt, so dass auf diesem Weg eine Selektion des korrekt paarenden Nukleotides erfolgen kann.86,87 Dadurch erfolgt eine kinetische Selektion.
Auch bei der Bindung des dNTP wird bereits diskriminiert. So bindet ein kanonisch paarendes Nukleotid im Allgemeinen mit einer höheren Affinität als ein nicht kanonisches.
Zur Untersuchung der Reaktionsmechanismen bei Polymerasen stehen grundsätzlich zwei verschiedene Reaktionstypen zur Verfügung. Der erste Reaktionstyp sind steady state kinetische Messungen, der zweite sind pre-steady state kinetische Methoden.
Steady state Messungen geben Aufschluß über die kinetischen Parameter KM (Michaelis-Menten Konstante) und Vmax (maximale Reaktionsgeschwinigkeit) bzw. kcat
(kcat=Vmax/c(Enzym)). Diese Methode mittelt allerdings über den gesamten Reaktionsweg aus Abb. 7, von Bindung des Primer/Templat-Komplexes bis zur erfolgten Umsetzung des Nukleotides. Sie muss unter single completed hit Bedingungen stattfinden, so dass davon ausgegangen werden kann, dass jeder Primer/Templat-Komplex maximal ein Mal von einer Polymerase getroffen wird und die erhaltenen Daten nur durch den Umsatz eines Enzyms verursacht werden und nicht durch den Umsatz mehrerer Enzyme an einem Templat. In der Praxis wird dies durch einen großen Überschuss an Substrat im Verhältnis zum Enzym erreicht und einer maximalen Umsatzrate des Primers von 20%.88,89 Bei pre eady state kinetischen Methoden (stopped flow oder quench flow) werden single turnover Bedingungen erzeugt, so dass Einflüsse der Assoziation und Dissoziation nicht auf die kinetischen Parameter einwirken. Hierbei wird ein Überschuss des Enzyms in Bezug auf das Substrat eingesetzt, so dass davon ausgegangen werden kann, dass jeder Primer/Templat-Komplex mit einer Polymerase besetzt ist. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe des dNTP gestartet und innerhalb kürzester Reaktionzeit gestoppt (rapid quench flow) oder durch Fluoreszenzmethoden während der Reaktion beobachtet (stopped flow). Dadurch werden die kinetischen Parameter der Affinität des dNTP zum Polymerase-DNA-Komplex (K
-st
D) und die maximale Umsatzrate kpol ermittelt.87,90 Im Rahmen dieser Dissertation fanden beide kinetische Methoden, steady state als auch pre-steady state Messungen, Anwendung.
1.3.2 Der Zwei-Metall-Ionen Mechanismus
Die enzymatische Bindung eines dNTP katalysiert durch DNA-Polymerasen an das 3’-OH-Ende eines Primers läuft unter Freisetzung eines Pyrophosphates ab.
O P O O
O O C
O
O O T
HO P
O O G
O
P O O
O P O O O O A
O
P O O O
P O O
O O
O O O
O O O O
O
H OH
dNTP Primer
Te
Mg2+
Mg2+
mplat
Abb. 8: Schema des SN2-typischen Übergangszustandes der Phosphoryltransferreaktion.
Die beiden Magnesiumionen werden von Carboxylatresten im aktiven Zentrum der Polymerase stabilisiert und führen zu einer Erhöhung der Nukleophilie der 3’-Hydroxyfunktion des Primerterminus für einen Angriff auf das α-Phosphat des dNTP.
Dabei werden zwei Magnesiumionen von Carboxylatresten im aktiven Zentrum der Polymerase stabilisiert und so koordiniert, dass sie sich in räumlicher Nähe zum 3’- OH-Ende des Primers befinden. Die Hydroxyfunktion wird dabei in ihrer Nukleophilie erhöht, so dass ein Angriff auf das α-Phosphat des dNTP erfolgen kann. Dabei nimmt das α-Phosphat einen SN2-artigen, trigonal bipyramidalen Übergangszustand an.91-94
Abb. 9 A zeigt deutlich die Koordination der zwei Metallionen durch die essenziellen Aspartate im aktiven Zentrum, hier am Beispiel einer Kristallstruktur der DNA- Polymerase λ.92 Durch die Aufnahme und Überlagerung eines prä- und eines postkatalytischen Komplexes kann auf den Übergangszustand am α-Phosphat in Abb. 9 B geschlossen werden.
Abb. 9: Kristallstruktur von Pol λ gebunden mit DNA und dTTP.
A zeigt das eintretende dNTP sowie die Stabilisierung der Metallionen durch die drei essenziellen Aspartate. B zeigt die Überlagerung eines prä- und eines postkatalytischen Zustandes während der Phosphoryltransferreaktion. präkatalytisch: gelb, postkatalytisch: grau, postuliertes Intermediat: rosa.
Entnommen aus Ref. 92.
1.4 Gerichtete Evolution
Die Bedeutung von DNA-Polymerasen für zahlreiche Anwendung in der Biologie, Biotechnologie und Medizin wurde bereits im Abschnitt 1.1.4 dieser Arbeit erläutert.
Neben der Verwendung der diversen, natürlich vorkommenden DNA-Polymerasen verschiedener Organismen versucht man diese Enzyme zu verändern, um z.B. das Substratspektrum zu erweitern oder Eigenschaften wie pH-Optimum, Thermostabilität, Resistenz gegen Inhibitoren oder Selektivität zu optimieren.63-65,95-102
Neben der Gewinnung neuer Werkzeuge für biotechnologische Anwendungen erhofft man sich auch, aus veränderten Varianten zusammen mit deren Kristallstruktur zu
lernen, welche Aminosäuren und Proteinmotive für die veränderten Eigenschaften verantwortlich sind und so Grundlagen für ein rationales Proteindesign zu entwickeln.103,104
Die Methoden, die bei der gerichteten Evolution Anwendung finden, sind zahlreich, lassen sich jedoch in zwei große Gruppen und grundlegende Überlegungen einteilen.
Das kodierende Gen eines Enzyms ist dabei das Ausgangsmaterial für die Erstellung einer diversifizierten Bibliothek von Enzymvarianten, wobei zwischen rationalem und zufälligem Design einer Bibliothek unterschieden werden muss. Sind bereits einzelne Aminosäurepositionen oder kurze Motivabschnitte als interessant für die Herstellung einer Variantenbibliothek identifiziert worden, so lassen sich rationale Bibliotheken planen, bei denen entsprechend nur eine oder wenige Aminosäuren variiert werden. Je nach gewünschter Diversität der gewählten Positionen, ob alle 20 natürlichen Aminosäuren oder nur eine Auswahl derer eingesetzt werden soll, wird die Bibliothek geplant, wobei der Umfang der zu untersuchenden Mutanten eher klein bleibt. Eine wichtige Vorraussetzung für die Planung einer rationalen Bibliothek sind Kenntnisse über räumliche Struktur und Interaktionen der ausgewählten Aminosäuren und deren Einfluss in dem zu verändernden Kontext. So konnten Rudinger et al. ausgehend von bereits beschriebenen Aminosäuresubstitutionen einer Familie A DNA-Polymerase, diese Erkenntnisse auf das Design einer Familie B DNA-Polymerase für erhöhte Selektivität anwenden.95,97,105 Allerdings bleibt zu bemerken, dass oftmals Veränderungen durch weit vom aktiven Zentrum entfernte Aminosäuren auch einen Einfluss auf das Verhalten der Enzyme haben (remote effec st ).103,106-108 Ist bei der Durchmusterung einer rational geplanten Bibliothek eine interessante Variante gefunden worden, so kann diese als Grundlage für eine weitere Diversifizierung eingesetzt werden.
Beim Erstellen einer zufällig mutierten Variantenbibliothek wird oft auf die error- prone PCR zurückgegriffen. Bei dieser Methode werden durch den Einsatz von Mangan und/oder unterschiedlichen Mischungsverhältnissen der dNTPs während der Amplifikation der zu mutierenden DNA an nicht vorrauszusagenden Positionen
Mutationen eingeführt, die zu Aminosäuresubstitutionen führen können. 109,110 Die Anzahl und Art der Substitutionen lässt sich nur schwer steuern und die Dimension der möglichen Aminosäurekombinationen ist extrem hoch.111 Dennoch lassen sich aus solchen Bibliotheken erfolgreiche Enzymvarianten isolieren.98,102,112,113 Weitere Möglichkeiten zur Kombination erfolgreicher Varianten bieten dann Methoden wie DNA shuffling oder staggered extension process (StEP). 114-116
Abb. 10: Schema der gerichteten Evolution.
Es werden iterativ die Prozesse von Diversifikation und Selektion durchlaufen. Entnommen aus Ref. 117.
Eine wichtige Vorraussetzung für die Identifikation erfolgreicher Varianten ist die Verknüpfung zwischen diversifizierten Genotypen und Phänotypen. Zu diesem Zweck sind zahlreiche Methoden entwickelt worden, die entweder auf der direkten, kovalenten Verknüpfung von Gen und Protein (mRNA peptide fusion), auf der nicht- kovalenten Verknüpfung (ribosome-, phage-, cell surface display), dem Einschluss in einem gemeinsamen Kompartiment (Zelle, in-vitro compartmentalization IVC) oder der räumlichen Adressierung (Mikrotiterplatte, Protein-Chips) beruhen.117,118 Dabei werden die Varianten in vivo oder in vitro transkribiert und translatiert, um anschließend einem Screening oder einer Selektion unterzogen zu werden. Werden erfolgreiche Varianten identifiziert, so kann direkt die kodierende DNA isoliert und
analysiert werden oder sie wird einer weiteren Diversifikation und einem Screening-/Selektionszyklus unterworfen.
Bei dem Verfahren einer Selektion wird das Überleben des Expressionssystems an eine erfolgreiche, neue Enzym-/Proteinvariante geknüpft. Im Allgemeinen kann dies z.B.
durch die Verwendung eines Resistenzmarkers gegen ein Antibiotikum erfolgen oder durch die Verwendung von thermolabilen Bakterienstämmen. Oftmals werden auch Bindeproteine generiert, die in einer Selektion an einen immobilisierten Liganden binden. Nicht erfolgreiche Binder werden zusammen mit ihrem Genotyp in einem Waschschritt entfernt, erfolgreiche Binder verbleiben an der Matrix und können analysiert werden. Die Stringenz des Waschschrittes spielt dabei eine besondere Rolle.
Bei der Selektion können extrem umfangreiche Bibliotheken untersucht werden, so dass je nach Verfahren Bibliotheksgrößen von 1012-1015 Mitgliedern generiert werden (ribosome display, mRNA peptide fusion). Dabei handelt es sich jedoch meist um kleinere Peptide oder Bindeproteine.117 Im phage display, welches u.a. von Romesberg et al. für die Selektion von Polymerasen mit neuen Eigenschaften angewendet wurde, konnten Bibliotheken von 105-108 Varianten untersucht werden.119,120 Die Selektion von DNA-Polymerasen ist besonders schwierig, da jedes Expressionssystem per se bereits DNA-Polymerasen beinhaltet und das Substrat für beide DNA darstellt. Zudem muss bei display Bibliotheken das Substrat (DNA) ebenfalls auf der Oberfläche des Expressionssystems immobilisiert werden, um zugänglich für die an der Oberfläche exprimierte, gebundene Polymerase zu sein (Abb. 11). Nach erfolgreicher Prozessierung des Substrates muss anschließend eine Diskriminierungsmöglichkeit zum nicht-prozessierten Substrat ermöglicht werden (z.B. Einbau von biotinylierten dNTPs und Bindung an Streptavidin Matrix).119,120
Abb. 11: Schema des Phage D splayi .
Die Polymerase (SF - Stoffel Fragment) wird an der Oberfläche des Phagen präsentiert. In einem zweiten Schritt erfolgt die Kopplung des Substrates durch Interaktion eines sauren und basischen Peptides an die Oberfläche. Erfolgreiche Polymerasevarianten bauen selektiv ein biotinyliertes dUTP ein, so dass sie über eine Streptavidin modifizierte Matrix angereichert werden können. Entnommen aus Ref. 119.
Loeb et al. wendeten eine Selektion an, bei der ein E. coli Stamm mit einer thermolabilen DNA-Polymerase I genutzt wurde. Dieser Stamm wächst bei 30°C normal, wird die Temperatur jedoch auf 37°C erhöht, so fällt die Funktion der DNA- Polymerase I aus. Beeinhaltet die in diesen Stamm transformierte Polymerasen- Bibliothek aktive DNA-Polymerasen, so wachsen die Kolonien unter beiden Bedingungen und können identifiziert werden. Dieser erste Schritt diente dem Auffinden der aktiven Varianten und wird als Komplementationsexperiment bezeichnet.121-126 Die Selektion verringerte die Bibliotheksgröße von 2 x 105 auf 8 x 103 aktive Mitglieder, die anschließend einem Screening unterzogen wurden.124 Die Selektion muss nicht, wie bei Loeb et al. in einem lebenden System (E. coli) stattfinden, sondern kann auch in artifiziellen Kompartimenten erfolgen. Dazu werden Wasser-in-
Öl-Emulsionen (Mikroemulsionen) hergestellt, so dass kleine Tröpfchen entstehen, die einen in vitro Transkriptions- und Translationsmix enthalten (in vitro compartmentalizat on IVCi ).127-129 In diesen künstlichen Reaktionsräumen können als Expressionssystem jedoch auch E. coli Zellen verwendet werden, wie Holliger et al. in dem von ihnen als CSR (compartmentalized self-replication) bezeichneten Verfahren beschreiben.63,100,130 Hierbei replizieren erfolgreiche Varianten ihr eigenes Gen (self- replication) und reichern somit ihre eigene Sequenz im Genpool an.
Abb. 12: Schema des CSRAssays.
Die Polymerasebibliothek wird in ein Plasmid kloniert und in E. colitransformiert (1). Anschließend werden die Bakterien zusammen mit Primern und dNTPs in einer Emulsion in ein Tröpfchen eingeschlossen. Nach erfolgter Lyse der Bakterien werden die exprimierten Polymerasevarianten im Tröpfchen freigesetzt. Im Fall einer erfolgreichen Variante repliziert diese ihr eigenes Gen und reichert so die Sequenz an (3). Entnommen aus Ref. 130.
Screening-Methoden sind wesentlich arbeitsintensiver als Selektionsverfahren. Da eine Selektion jedoch nicht bei allen Fragestellungen angewendet werden kann, wird häufig eine Screening-Methode entwickelt, wobei ein schnell zu erzeugendes und stabiles Signal zur Erkennung einer positiven Variante notwendig ist.117 Dazu werden alle Bibliotheksmitglieder räumlich voneinander getrennt, sei es auf Mikrotiterplatten oder Proteinchips, und einer Reaktion unterzogen, die ein Signal erzeugt. Häufig werden dabei Fluoreszenzsignale verwendet, da diese schnell ausgelesen werden können.
Durch die kompliziertere, aufwendigere Handhabung und die damit verbundenen
höheren Kosten sind Screeningbibliotheken auf eine Größe von 106-107 beschränkt.131 Interessant ist jedoch die Verwendung der IVC-Methode und dem schnellen Sortieren der Mikroemulsionen durch ein FACS-Gerät (fluorescence activated cell sorting). 131,132 Hierbei werden Mikroemulsionen als Reaktionskompartiment benutzt, in denen ein fluoreszenzbasiertes Signal erzeugt wird. 50 µl einer Mikroemulsion können dabei
>1010 einzelne Reaktionsräume enthalten, so dass in einem geringen Volumen eine Vielzahl von Reaktionen parallel durchgeführt werden können. Die Sortierung der einzelnen Kompartimente durch ein FACS Gerät lässt heutzutage einen Durchsatz von bis zu 107 pro Stunde zu.131,132
2 Aufgabenstellung
Ziel dieser Dissertation war es neue Erkenntnisse über die biochemischen, strukturellen und biophysikalischen Vorrausetzungen von DNA-Polymerasen im Hinblick auf das Überlesen von DNA-Schäden zu erlangen. Als Ausgangsenzym sollte eine DNA-Polymerase verwendet werden, die DNA-Schäden nicht prozessieren konnte, so dass im Anschluss Vergleiche mit den gewonnen Mutanten Einblicke in die mechanistischen Unterschiede ermöglichen sollten.
Die dadurch erhaltenen Einblicke sollten Grundlage für die weitere Entwicklung von DNA-Polymerasen sein, die eine verbesserte Überlesefunktion für DNA-Schäden aufweisen. Hauptziel war es dabei, die gefundenen Varianten mit bereits in der Literatur beschriebenen Enzymvarianten zu kombinieren, so dass das Zusammenspiel verschiedener bereits charakterisierter Einzelmutationen untersucht werden konnte.
Dazu sollte zunächst eine bereits bestehende Bibliothek von Mutanten der Klentaq DNA-Polymerase durchmustert werden und biochemisch charakterisiert werden. Die so erhaltenen Varianten sollten dann als Grundlage für die Generierung weiterer Mutantenbibliotheken sein.
3 Ergebnisse und Diskussion
3.1 Durchmusterung einer Mutantenbibliothek der N-terminal verkürzten Version der Taq DNA-Polymerase ( Klentaq )
3.1.1 Einleitung
Die DNA-Polymerase I aus dem thermophilen Bakterium The mus aquaticus (Taq) ist eng verwandt mit der DNA-Polymerase I aus Escherichia coli (E.coli).
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75,76 Der Vergleich der C-terminalen Polymerasedomänen (Taq 420-832, E. coli PolI 516-928) der beiden Enzyme zeigt eine Konservierung der Aminosäuresequenz von 49,6% auf.76 Beide Enzyme besitzen eine 5’-3’ Polymerasedomäne und eine 5’-3’-Exonukleasefunktion. Die E.coli DNA-Polymerase I weist zusätzlich eine Korrekturlesefunktion in Form einer 3’-5’-Exonuklease auf. Die Polymerasedomäne der E.coli PolI zusammen mit ihrer 3’-5’-Exonukleasefunktion wird nach ihrem Entdecker Klenow als Klenow-Fragment (KF) bezeichnet und bildet die größere der beiden Untereinheiten der DNA-Polymerase I.77,78 Analog dazu wird die Polymerasedomäne der Taq DNA-Polymerase I ohne die 5’-3’-Exonukleaseuntereinheit als K entaq bezeichnet.80 Sie besitzt die reine 5’-3’-DNA-Synthese-Funktion der Taq DNA-Polymerase und weist zudem eine höhere Thermostabilität und eine höhere Selektivität als das Volllängenenzym auf.75,80,82
Ziel des Screenings war es, ausgehend von einer DNA-Polymerase, die keine natürliche Überlesefunktion von DNA-Schäden aufwies, eine Variante zu generieren, die diese Funktion erfüllte. Durch anschließende biochemische und strukturelle Vergleiche mit dem Ausgangsenzym sollte ein Beitrag zum Verständnis des Überlesens von DNA- Schäden erlangt werden. Die Idee, die dem angewendeten Screening zugrunde lag, basierte auf der Annahme, dass ein DNA-Schaden eine sterische Veränderung DNA-
Doppelhelix verursacht, die man im Screening nachstellte.133 Durch Auslassen eines der vier natürlichen dNTPs bei einer Primerextension-Reaktion, entstand für die DNA- Polymerase zwangsläufig die Situation eines Fehleinbaus, wenn im Templat die Position des nach Watson und Crick kanonisch paarenden Partners des ausgelassenen Nukleotides erreicht wurde. Eine erfolgreiche DNA-Polymerasen Variante sollte trotzdessen ein Nukleotid einbauen und dieses auch verlängern. Die dabei entstehende Fehlkonformation der DNA sollte keine Hinderung mehr für die weitere Prozessierung durch die DNA-Polymerase Variante darstellen und zu einem Volllängenprodukt führen, das sich leicht durch Zugabe eines Fluoreszenzfarbstoffes (SYBRgreenI) nachweisen lassen sollte.
Natürlich vorkommende DNA-Reparatur-Polymerasen weisen eine niedrige Selektivität und eine hohe Fehlerrate auf.11,21,24,134 Loeb e al. wendeten diese Art des Screening-Assays bereits erfolgreich bei der Taq DNA-Polymerase an und konnten so eine Variante des Volllängenenzyms generieren, dass über DNA-Schäden, wie eine abasische Stelle oder etheno-dA hinwegsynthetisiert.
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125 Ihr Screening war jedoch radioaktiv-basiert, was eine zeitaufwendige Analyse durch eine denaturierende PAGE nach sich zog. Der hier verwendete Assay basierte auf der Detektion doppelsträngiger DNA (dsDNA) durch SYBRgreenI, einem Farbstoff, der sich unspezifisch an doppelsträngige DNA anlagert und nach Anregung bei 485 nm ein fluoreszierendes Signal bei 520 nm erzeugt. Eine Trennung von Edukt und Produkt war dabei nicht notwendig und das Signal konnte schnell in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät ausgelesen werden.
3.1.2 Ergebnisse
3.1.2.1 Konstruktion der randomisierten
Klentaq
Bibliothek Die verwendete Bibliothek der Klentaq DNA-Polymerase wurde von Katharina B.M.Sauter während ihrer Dissertation im Arbeitskreis von Prof. Dr. A. Marx angefertigt.98,135 Sie randomisierte dabei den gesamten open reading ame (ORF) des Enzyms durch error-prone PCR (epPCR) mit Hilfe der Taq DNA-Polymerase in Anwesenheit von Mangan-Ionen (Mn
fr
2+). Es wurde eine Mn2+-Konzentration von 50 µM gewählt und die PCR für 14 Zyklen durchlaufen. Die verwendeten Primer enthielten Schnittstellen für BsmBI, einer Typ II S Restriktionsendonuklease, die außerhalb ihrer Erkennungssequenz schneidet, wodurch im Anschluss eine gerichtete Klonierung möglich war. Das verdaute PCR-Produkt wurde über BsaI Schnittstellen in den Expressionsvektor pASK-IBA37plus kloniert und in E.coli BL21(DE3) Gold Zellen durch Elektroporation transformiert. Anschließend wurden einzelne Kolonien gepickt und in LB-Medium enthaltende 384-well Platten überführt. Diese 384-well Platten bildeten die Ausgangsbibliothek für den ersten Screening-Schritt auf PCR-Aktivität.
Abb. 13: Schema der Konstruktion der Klentaq (KTQ) DNA-Polymerasen Bibliothek.
Zunächst wurde ausgehend von Plasmid DNA (pASK-IBA37plus::KTQwt) eine error-prone PCR in Anwesenheit von 50 µM MnCl2 für 14 Zyklen mit TaqPolymerase durchgeführt. Anschließend wurde das PCR Produkt gereinigt und mit BsmBI verdaut, bevor es in den mit BsaI geschnittenen und dephosphorylierten Vektor pASK-IBA37plus kloniert wurde. Das Ligationsprodukt wurde dann in E. coli BL21 (DE3) Gold Zellen transformiert und Einzelkolonien wurden manuell in 384-well Platten überführt.
Anschließende Expression und Reinigung erfolgte in 96-deep well Platten; die Lysate wurden für eine PCR Aktivitätsbestimmung eingesetzt. Die aktiven Varianten wurden auf 384-well Platten vereinigt und bildeten die Ausgangsbibliothek für ein Screening.
Durch Verwendung der epPCR über die gesamte Länge des ORF und die gewählte Konzentration der Mn2+-Ionen, war ein Teil der generierten Enzymvarianten ohne Aktivität, so dass die aktiven in einem ersten Screening ermittelt werden mussten. Ca.
40 % der gepickten Varianten wiesen eine PCR-Aktivität auf.98,135 Die aktiven Varianten wurden auf neuen 384-well Platten vereinigt und wurden zum Screening wie oben geschildert eingesetzt.
3.1.2.2 Aufbau des Screening-Systems
Als Assay-Format wurde eine Primerextension-Reaktion im 384-well Format gewählt, bei der der Primer (F20H) an das Templat (F90A) annealt wurde. Der Reaktionsmix enthielt drei Nukleosid-Triphosphate: dGTP, dCTP und dTTP, jedoch kein dATP. Als ausgelassenes Nukleotid wurde dATP gewählt, da über den einzelsträngigen Bereich des Templates acht dT Nukleoside verteilt waren, diese jedoch nicht direkt aufeinander folgten. Dadurch sollten mehrere Fehleinbau und –verlängerungssituationen entstehen, die jedoch nicht zu eng beieinander liegen sollten (vgl. Abb. 21), damit nicht mehrere Fehlkonformationen direkt hintereinander eine direkte Dissoziation der DNA-Polymerase bewirkten.
Die Reaktionen fanden in einem Volumen von 20 µl bei 72°C für 15 min statt, welche 5 µl Lysat mit Klen aq t DNA-Polymerase enthielten. Gestoppt wurden die Reaktionen
Abb. 14: Schema des Screening-Assays.
Primer und Templat wurde annealt und mit Polymerasen aus E.coli Lysaten (5 µl) sowie 200 µM dGTP, dCTP und dTTP für 15 min bei 72°C in 384-well Platten inkubiert. Anschließend wurde SYBRgreenI (final 3,4x) zu den Reaktion gegeben und diese in einem Plattenlesegerät bei 485 nm Wellenlänge angeregt. Erfolgreich verlängerte Primer führten zu dsDNA, an die der Farbstoff band und ein Signal bei 520 nm erzeugte. So konnte zwischen positiver und negativer Variante unterschieden werden.
durch Zugabe von 30 µl SYBR-Stopp-Lösung, die mit 3,4x SYBRgreenI, EDTA (20 mM) und Formamid (80 %) versetzt war. Dadurch war nach Anregung mit Licht der Wellenlänge 485 nm eine Detektion des an dsDNA angelagerten SYBRgreenI bei 520 nm möglich.
3.1.2.3 Auswertung des Screenings
Die Expression der Bibliothek und Herstellung der Lysate fand in 96-deep-well Platten statt. Dabei enthielt jede 96-deep-well Platte vier Wells mit Klentaq WT Lysaten für Kontrollreaktionen. Der Primerextension-Assay fand in einer 384-well Platte statt, welche vier 96-well Expressionsplatten entsprach, was bei der Auswertung berücksichtigt wurde, da Unterschiede in der Expressionsstärke zwischen den einzelnen Platten auftreten konnten und diese sich dann auf das Ergebnis der Primerextension-Reaktion auswirken konnte.
Als positive Variante wurde dabei ein Enzym gewertet, welches einen definierten Schwellenwert einer relativen-Fluoreszenz-Einheit (RFU) überschritten hatte. Der Fluoreszenzschwellenwert (FS) wurde aus zwei Kontrollexperimenten definiert: das erste Kontrollexperiment war eine Reaktion mit Klentaq WT Lysat und allen vier dNTPs, das zweite Kontrollexperiment enthielt Klentaq WT Lysat und nur drei dNTPs.
Diese Reaktionen wurden als zwei Parallelbestimmungen durchgeführt, so dass ein Mittelwert für jede Reaktion die jeweiligen Fluoreszenzwerte ergab (FWT(4dNTPs), FWT(3dNTPs)). Durch Subtraktion von FWT(3dNTPs) von FWT(4dNTPs) wurde ∆F erhalten, was der maximal möglichen Fluoreszenzänderung entsprach. Als Schwellenwert FS wurde nun die Hälfte von ∆F + FWT(3dNTPs) definiert (FS = FWT(3dNTPs) + ∆F/2). FS wurde für jeden der vier 96er Abschnitte einer 384-well Platte neu errechnet und die getesten Lysate zugehörig ausgewertet.
Abb. 15: Auswertung des Screenings in unterschiedlichen Formaten.
Die Graphen zeigen Auswertungen in zwei unterschiedlichen Formaten. Aufgetragen sind die relativen Fluoreszenzwerte (RFU) der Kontrollreaktionen mit Klentaq WT-Lysaten mit drei dNTPs (orange) und mit vier dNTPs (grün). Die rot gestrichelte Linie zeigt den festgesetzten Fluoreszenzschwellenwert (FS), der zur Unterscheidung zwischen einer positiven und negativen Variante eingeführt wurde.
Abb. 15 zeigt zwei unterschiedliche Auswertungsmöglichkeiten und die daraus resultierenden FS-Werte. Die dargestellten Säulen entsprechen den Daten der Kontrollexperimente mit Klentaq WT-Lysaten aus zwei gemessenen 384er Platten (rechts), was acht verschiedenen Expressionsplatten (links) entspricht. Die 96er Platten 1-4 ergeben dabei die 384er Platte 1 und 96er Platten 5-8 ergeben die 384er Platte 2. Es fällt auf, dass die FS-Werte bei Auswertung der einzelnen 96er Platten sehr stark voneinander abweichen. Als positive Variante wurden im Screening nur diese gewertet, die den FS-Wert überschritten. Betrachtet man nun den RFU-Wert einer positiven Variante auf Platte 1 der 96er Auswertung, so musste dieser über ca. 24000 RFU liegen. Wäre die Auswertung allerdings im 384er Format durchgeführt worden, so hätten die positiven Varianten einen FS-Wert von ca. 30000 RFU übersteigen müssen, was selbst die Positivkontrollen der ersten 96er Platte nicht erreicht hätten. Diese positiven Varianten wären demnach nicht gewertet worden. Diese Darstellung unterstreicht die Bedeutung der Art der Auswertung der Screening-Daten.
Nach dem Durchmustern von zwei 384-well Platten der PCR aktiven Klentaq DNA- Polymerasenbibliothek konnten 53 Varianten bestimmt werden, die ein positives
Signal in der fluoreszenzbasierten Primerextensionreaktion mit nur drei dNTPs zeigten. Dies entsprach einem positiven Anteil von ca. 7,2% der getesten Varianten.
3.1.2.4 Radiometrische Untersuchung der identifizierten Varianten
Nachdem in der Durchmusterung der fluoreszenzbasierten Primerextension-Reaktion 53 Varianten ein positives Signal ergaben, sollte dies in einem radiometrischen Experiment bestätigt werden. Um eine gute Auftrennung der einzelnen Banden im denaturierenden PAGE zu erreichen, wurde ein 5’-terminal verkürztes Templat (F42A, Abb. 21) aus dem gleichen Sequenzkontext gewählt und die Reaktionen mit 5’
radioaktiv markiertem Primer (F20H) wiederholt. Dabei wurde für jede Variante eine Reaktion mit nur drei dNTPs (ohne dATP) und eine Kontrollreaktion mit vier dNTPs durchgeführt.
Abb. 16: Ausschnitt aus einem PAGE der radiometrischen Untersuchung der identifizierten Varianten.
Die Reaktionen enthielten 150 nM Primer/Templat, 200 µM dNTPs, 5 µl Lysat und wurden für 1h bei 72°C inkubiert. Aufgetragen sind für jede Variante eine Reaktion mit nur drei dNTPs (-) und eine mit vier dNTPs (+). Auffällig ist die Variante 1,E6, die den Primer in der (-) Reaktion bis zur Volllänge verlängern konnte. Links ist die Templatsequenz dargestellt, rot die kanonischen dTs zum ausgelassenen dATP in der (-) Reaktion.
