Herstellung von DNA-Polymerasen mit veränderten Eigenschaften durch gerichtete Evolution:
Studien zum Substratspektrum von DNA- Polymerasen und Bypass einer DNA-Läsion
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
an der Universität Konstanz
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie
vorgelegt von Nadine Staiger
Tag der mündlichen Prüfung: 03. Februar 2012 1. Referent: Prof. Dr. Andreas Marx
2. Referent: Prof. Dr. Jörg Hartig
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-187347
„Wege entstehen dadurch, dass man sie geht.“
Franz Kafka
Staiger, N. & Marx, A. A DNA polymerase with increased reactivity for ribonucleotides and C5-modified deoxyribonucleotides. Chembiochem 11, 1963-6 (2010)
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I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
1.1 Die DNA ... 1
1.1.1 Aufbau und Funktion der DNA ... 1
1.1.2 Verschiedene Strukturen der DNA... 2
1.2 DNA-Replikation ... 3
1.2.1 DNA-Polymerasen... 3
1.2.1.1 Katalytischer Zyklus von DNA-Polymerasen ... 4
1.2.1.2 Zwei-Metallionen Mechanismus ... 5
1.2.1.3 Einteilung von DNA-Polymerasen in Familien... 6
1.2.1.4 Genauigkeit und Selektivität von DNA-Polymerasen... 7
1.2.2 Die Replikation in Prokaryoten ... 9
1.2.3 Die Replikation in Eukaryoten und Archaeen ... 11
1.3 Transkription ... 12
1.4 Entstehung und Reparatur von DNA-Schäden ... 13
1.5 Bypass von DNA-Schäden ... 14
1.5.1 Dpo4 als Modell-TLS-DNA-Polymerase ... 15
1.6 Biotechnologische Anwendungen von DNA-Polymerasen ... 17
1.6.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 17
1.6.2 Next Generation Sequencing ... 18
1.6.3 Herstellung nicht-natürlicher DNA-Analoga ... 19
1.7 Gerichtete Evolution... 19
1.7.1 Zufällige Mutagenese mittels error-prone PCR... 20
1.7.2 Rekombinations-basierte Mutagenese ... 21
1.7.3 Screening- und Selektionsverfahren ... 21
2 Aufgabenstellung ... 25
II
3 Ergebnisse und Diskussion ...27
3.1 Generierung einer Variante der Therminator DNA-Polymerase mit erweitertem Substratspektrum zur Inkorporation von Ribonukleotiden und Zucker- bzw. Basen-modifizierten Nukleotiden ...27
3.1.1 Einleitung ...27
3.1.2 Ergebnisse ...29
3.1.2.1 Herstellung von rekombinanten Plasmiden für die Expression der Therminator Wildtyp DNA-Polymerase ...29
3.1.2.2 Herstellung einer zufällig randomisierten Therminator- Variantenbibliothek mittels error-prone PCR ...30
3.1.2.3 Heterologe Expression der Therminator DNA-Polymerase...31
3.1.2.4 Proteinexpression der Variantenbibliothek für das Hochdurchsatz- Screening ...32
3.1.2.5 Durchmusterung der Therminator-Variantenbibliothek nach randomisierter Mutagenese ...33
3.1.2.6 Sequenzierungen der Varianten G3, H3 und A5 ...38
3.1.2.7 Vergleich der RNA-Aktivität der Variante L408Q mit kommerziell erhältlichen Therminator DNA-Polymerasen...39
3.1.2.8 Herstellung einer Variantenbibliothek mittels Sättigungsmutagenese ...40
3.1.2.9 Durchmusterung der Variantenbibliothek nach Sättigungsmutagenese ...42
3.1.2.10 Charakterisierung der Variante L408Q ...45
3.1.2.10.1 Steady state kinetische Untersuchungen...45
3.1.2.10.2 Transkription der E. coli tRNAAsn...47
3.1.2.10.3 Herstellung funktionaler RNA-Ribozyme...48
3.1.2.10.4 Einbau von 2´-OH-modifiziertem dCTP ...50
3.1.2.10.5 Einbau von C5-modifiziertem dUTP...52
3.1.3 Diskussion der Ergebnisse...54
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III 3.2 Einfluss kationischer Aminosäuren auf die Bypass-Aktivität der Dpo4 DNA- Polymerase an einer abasischen Stelle... 65
3.2.1 Einleitung... 65 3.2.2 Ergebnisse... 66
3.2.2.1 Auswahl einer kationischen Aminosäure für die ortsgerichtete Mutagenese... 66 3.2.2.2 Herstellung rekombinanter Plasmide der Dpo4 Wildtyp DNA- Polymerase und Dpo4 Varianten ... 67 3.2.2.3 Heterologe Expression und Reinigung der Dpo4 DNA-Polymerase..
... 67 3.2.2.4 Untersuchung der Bypass-Aktivität... 69
3.2.3 Diskussion ... 73 3.3 Einfluss aromatischer Aminosäuren auf die Nukleotidauswahl der 9°N DNA-Polymerase gegenüber einer abasischen Stelle ... 77
3.3.1 Einleitung... 77 3.3.2 Ergebnisse und Disskussion ... 79
3.3.2.1 Auswahl einer aromatischen Aminosäure für die ortsgerichtete Mutagenese... 79 3.3.2.2 Herstellung rekombinanter Plasmide der 9°N Wildtyp DNA-
Polymerase und 9°N Varianten ... 81 3.3.2.3 Heterologe Expression und Reinigung der 9°N DNA-Polymerase 81 3.3.2.4 Einbauverhalten der Varianten Y494A und Y494W gegenüber einer abasischen Stelle... 81 3.3.2.5 Einbauverhalten der Varianten F493A, Y496A, Y497A, Y499A.. 83 3.3.2.6 Einbauverhalten der Varianten F493W, Y496W, Y497W, Y499W ..
... 84 3.3.2.7 Reinigung der 9°N DNA-Polymerase sowie der Variante Y496A. 85
3.3.2.8 Weitere Untersuchungen der Variante Y496A... 86 3.3.2.8.1 Nukleotidauswahl und Bypass einer abasischen Stelle ... 86 3.3.2.8.2 PCR-Aktivität ... 88
IV
3.3.3 Diskussion ...88
4 Zusammenfassung und Ausblick ...93
5 Material ...99
5.1 Chemikalien...99
5.2 Oligonukleotide ...102
5.3 Nukleotide und Radiochemikalien...102
5.4 Standards und Kits ...103
5.5 Enzyme und Proteine...104
5.6 Bakterienstämme und Plasmide ...105
5.7 Puffer und Lösungen ...106
5.8 Medien ...110
5.9 Verbrauchsmaterial...110
5.10 Geräte...111
6 Methoden...115
6.1 Enzymatische Reaktionen ...115
6.1.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...115
6.1.2 Fehleranfällige PCR (error-prone PCR) ...116
6.1.3 PCR zur Sättigungsmutagenese von Gensequenzen ...118
6.1.4 Ortsgerichtete Mutagenese (site directed mutagenesis) ...120
6.1.5 Kolonie-PCR (colony PCR) ...120
6.1.6 Restriktionsverdau doppelsträngiger DNA (dsDNA) ...121
6.1.7 Dephosphorylierung von dsDNA ...122
6.1.8 Ligation ...123
6.1.9 5´-Phosphorylierung mit [ 32P]-ATP ...123
6.1.10 Sequenzierung von dsDNA ...124
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V
6.2 Auftrennung, Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren ... 124
6.2.1 Auftrennung von dsDNA durch Agarosegelelektrophorese... 124
6.2.2 Isolierung von dsDNA aus Agarosegelen... 125
6.2.3 Auftrennung von Nukleinsäuren durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese ... 125
6.2.4 Isolierung von ssDNA aus PAGE-Gelen... 126
6.2.5 Ethanolfällung ... 126
6.2.6 Isolierung von dsDNA aus Flüssigkulturen... 126
6.2.7 Quantifizierung von DNA ... 127
6.3 Mikrobiologische Methoden ... 127
6.3.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli Bakterien... 127
6.3.2 Elektroporation von E. coli Bakterien ... 128
6.3.3 Plattenkulturen... 128
6.3.4 Flüssigkulturen ... 128
6.3.5 Glycerinkulturen... 129
6.4 Proteinbiochemische Methoden... 129
6.4.1 Expression von DNA-Polymerasen... 129
6.4.2 Herstellung von Bakterienlysaten... 130
6.4.3 Reinigung von DNA-Polymerasen ... 131
6.4.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 131
6.4.5 Quantifizierung von Proteinen... 131
6.5 5´-32P-markierte Primerverlängerungsreaktionen ... 132
6.6 Methoden zu Abschnitt 3.1... 132
6.6.1 Konstruktion rekombinanter Plasmide ... 132
6.6.2 Konstruktion einer randomisierten Variantenbibliothek mittels epPCR .... ... 133
6.6.3 Konstruktion einer Variantenbibliothek mittels Sättigungsmutagenese134 6.6.4 Expression, Lyse und Reinigung der Therminator DNA-Polymerase . 134 6.6.4.1 Expression ... 134
VI
6.6.4.2 Lyse ...135
6.6.4.3 Reinigung ...136
6.6.5 Fluoreszenzbasierte Durchmusterung von Variantenbibliotheken im Microarray-Format (OAEA) ...136
6.6.6 Fluoreszenz-basierte Durchmusterung von Variantenbibliotheken in Lösung ...137
6.6.7 5´-32P-markierte Primerverlängerungsreaktionen mit rNTPs als Substrat .. ...138
6.6.8 Steady state kinetische Untersuchungen ...138
6.6.9 Transkription der E.coli tRNAAsn...140
6.6.10 Transkription von RNA-Ribozymen ...140
6.6.11 Spaltreaktionen mit RNA-Ribozymen ...140
6.6.12 5´-32P-markierte Primerverlängerungsreaktionen mit 2´-modifzierten dCTPs ...141
6.6.13 5´-32P-markierte Primerverlängerungsreaktionen mit C5-modifiziertem dUTP als Substrat...142
6.7 Methoden zu Abschnitt 3.2 ...142
6.7.1 Expression, Lyse und Reinigung der Dpo4 DNA-Polymerase ...142
6.7.1.1 Expression ...142
6.7.1.2 Lyse ...143
6.7.1.3 Reinigung ...143
6.7.2 5´-32P-markierte Primerverlängerungsreaktionen...144
6.7.3 Bestimmung der spezifischen Aktivität...144
6.8 Methoden zu Abschnitt 3.3 ...145
6.8.1 Herstellung der 9°N DNA-Polymerase mittels site directed mutagenesis.. ...145
6.8.2 Expression, Lyse und Reinigung der 9°N DNA-Polymerase...145
6.8.3 5´-32P-markierte Primerverlängerungsreaktionen...146
6.8.4 PCR-Aktivität...146
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VII
7 Anhang... 149
7.1 Oligonukleotidsequenzen zu Abschnitt 6.6 ... 149
7.2 Oligonukleotidsequenzen zu Abschnitt 6.7 ... 152
7.3 Oligonukleotidsequenzen zu Abschnitt 6.8 ... 153
7.4 Gensequenzen von DNA-Polymerasen ... 157
7.5 Vektorkarten und Sequenzen... 164
7.6 Nomenklatur der Aminosäuren... 169
7.7 Abkürzungsverzeichnis ... 170
8 Literaturverzeichnis ... 175
9 Danksagung... 193
10 Eidesstattliche Erklärung ... 194
VIII
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1
1 Einleitung
1.1 Die DNA
“If one way be better than another, that you may be sure is Nature's way”.1 Als Speicherort der genetischen Information eines jeden Organismus bildet die DNA (Deoxyribonucleic acid) die Grundlage für die Optimierung von Organismen.
1.1.1 Aufbau und Funktion der DNA
Die DNA besteht aus vier Grundbausteinen und bildet durch die spezifische Abfolge dieser Bausteine den „Bauplan“ eines jeden Organismus. Die Bausteine der DNA, die Desoxyribonukleotide (dNTPs), bestehen wiederum aus drei Untereinheiten: einer Phosphat- und Riboseeinheit (2´-Desoxyribose) sowie einer Nukleobase (Abb. 1).
Bereits 1953 wurde die räumliche Struktur der DNA von Watson und Crick beschrieben,2 wofür sie 1962 zusammen mit M. Wilkins, der ebenfalls zur Aufklärung der DNA-Struktur beigetragen hatte, den Nobelpreis für Medizin erhielten. Die DNA bildet eine antiparallele rechtsgängige Doppelhelix mit innenliegenden Nukleobasen, wobei die Phosphat (Monophosphat)- und Riboseeinheiten (2´-Desoxyribose) eines DNA-Einzelstranges über Phosphodiesterbindungen verknüpft sind und das Rückgrat der DNA bilden. Die Nukleobasen eines DNA-Stranges sind über Wasserstoffbrücken mit den jeweils gegenüberliegenden Nukleobasen des zweiten Stranges verknüpft. Nach Watson und Crick paart hierbei immer ein Purin mit einem Pyrimidin, wobei die Basenpaarungen festgelegt sind. Es paart Adenin (A) mit Thymin (T) und Guanin (G) mit Cytosin (C) (Abb. 1).2 Die Stabilität der DNA-Doppelhelix hängt hautsächlich von zwei Faktoren ab: den Wasserstoffbrücken zwischen gegenüberliegenden Nukleobasen2, 3 sowie den Basenstapelwechselwirkungen zwischen benachbarten Basen eines DNA-Stranges.3
2
Abb. 1: Aufbau der DNA. (A) Strukturen der vier Nukleobasen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T). (B) Aufbau eines Desoxyribonukleotids. (C) Illustration einer DNA- Doppelhelix. Modifiziert nach Ref.4
1.1.2 Verschiedene Strukturen der DNA
Abhängig von der Basensequenz sowie den Umgebungsbedingungen kann die DNA in verschiedenen Formen vorliegen. Unterschiede zwischen diesen liegen beispielsweise in der Anzahl der Basenpaare pro Windung, der Geometrien der großen und der kleinen Furche oder der Konformation der Riboseeinheit. Die DNA kann außerdem als rechtsgängige oder linksgängige Doppelhelix vorliegen.5-7 Die in der Natur am häufigsten vorkommende Form doppelsträngiger DNA (dsDNA) ist die B-Form.6 In (Abb. 2) sind drei mögliche DNA-Formen dargestellt: die A-Form, die B-Form und die Z-Form.
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3
Abb. 2: Modelle verschiedener DNA-Strukturen. Links: A-Form, Mitte: B-Form, Rechts: Z-Form.
Die A- und B-Formen bilden eine rechtsgängige Doppelhelix aus. Die Z-Form bildet eine linksgängige Doppelhelix aus mit einem Zucker-Phosphat-Rückgrat das im Zickzack-Muster verläuft. Die Nukleotide sind farblich gekennzeichnet: A (rot), C (gelb), G (türkis), T (grün).
Modifiziert nach Ref.6
1.2 DNA-Replikation
Wie bereits 1953 von Watson und Crick vermutet wurde, eröffnet die spezifische Basenpaarung der DNA die Möglichkeit einen DNA-Strang unter Erhalt seiner genetischen Information zu kopieren. Durch die vorgegebenen Basenpaarungen kann ein Strang als Templat zur Synthese des zweiten Stranges genutzt werden.8
1.2.1 DNA-Polymerasen
DNA-Polymerasen erfüllen zentrale Aufgaben bei der Replikation, Reparatur und Rekombination der DNA.7, 9 Die erste in der Literatur beschriebene DNA-Polymerase ist die DNA-Polymerase I (Pol I) aus Escherichia coli. Sie wurde 1956 von Arthur Kornberg entdeckt,10 wofür er 1959 gemeinsam mit Ochoa den Nobelpreis für Medizin erhielt.
4
1.2.1.1 Katalytischer Zyklus von DNA-Polymerasen
DNA-Polymerasen katalysieren den Einbau von Desoxyribonukleotiden in einen wachsenden DNA-Strang durch Bildung einer Phosphodiesterbindung. Das folgende Modell beschreibt einen katalytischen Zyklus von DNA-Polymerasen (Abb. 3).
Zuerst wird die DNA durch das Enzym gebunden, welches sich in der offenen Konformation befindet (Schritt 1). Durch die Bindung des dNTPs (Schritt 2) wird eine Konformationsänderung ausgelöst, wodurch die DNA-Polymerase in die geschlossene Konformation übergeht (Schritt 3). Dieser Schritt ist essentiell für die korrekte Positionierung des zu verknüpfenden dNTPs, damit der Phosphoryltransfer stattfinden kann (Schritt 4). Fehlgepaarte Nukleotide zerstören die Geometrie im aktiven Zentrum wodurch die Reaktion verhindert wird. Nachdem das Nukleotid kovalent an das wachsende Primerende geknüpft wurde, findet eine weitere Konformationsänderung statt, wodurch das Enzym wieder in die offene Konformation überführt wird (Schritt 5). Anschließend wird das Pyrophosphat freigesetzt (Schritt 6), was vermutlich zur Translokation des Enzyms führt. Die DNA- Polymerase bleibt dann entweder an die DNA gebunden (Schritt 7) oder setzt diese frei und bindet einen anderen Primer/Templat-Komplex (Schritt 8).11
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5
Abb. 3: Katalytischer Zyklus von DNA-Polymerasen. Pol: DNA-Polymerase in der offenen Konformation, Pol´: DNA-Polymerase in der geschlossenen Konformation, P/T: Primer/Templat- Komplex, dNTP: Desoxyribonukleotid, PPi: Pyrophosphat. Modifiziert nach Ref.11
Um die kinetischen Parameter der DNA-Polymerisation zu messen, stehen verschiedene Techniken zur Verfügung. Zur Erfassung der gesamten Polymerisationsreaktion inklusive Bindung und Dissoziation, können steady state kinetische Messungen herangezogen werden. Diese werden mit einem Überschuss an DNA und dNTP im Vergleich zur DNA-Polymerase unter „single-completed-hit“- Bedingungen12, 13 durchgeführt, so dass der Nukleotideinbau durch ein Enzym pro Primer/Templat-Komplex erfolgt. Durch pre-steady state kinetische Messungen unter
„single turnover“ Bedingungen können einzelne Reaktionsschritte des gesamten Polymerisationszykluses bestimmt werden.14 Pre-steady state kinetische Messungen werden mit einem Überschuss an DNA-Polymerase durchgeführt.11 Dadurch kann jeder Primer/Templat-Komplex durch eine DNA-Polymerase gebunden werden.
1.2.1.2 Zwei-Metallionen Mechanismus
Trotz der Vielzahl verschiedener DNA-Polymerasen aus unterschiedlichen Familien unterliegt ihr Reaktionsmechanismus einem allgemeinen Prinzip, dem sogenannten Zwei-Metallionen-Mechanismus.15 Kristallstrukturen verschiedener DNA- und RNA- Polymerasen zeigen übereinstimmende Strukturen der katalytischen Domäne sowie die Komplexierung der zwei Metallionen A und B durch zwei konservierte
6
Aspartatreste im aktiven Zentrum der DNA-Polymerase.15-21 Das freie 3´-OH-Ende eines Primers wird durch Metallion A aktiviert, wodurch der nukleophile Angriff des Sauerstoffatoms am -Phosphat des eintretenden Desoxyribonukleotidtriphosphates (dNTP) ermöglicht wird. Metallion B unterstützt die Abspaltung des Pyrophosphatrestes wobei der angenommene pentakovalente Übergangszustand durch beide Metallionen stabilisiert wird (Abb. 4).15
Abb. 4: Zwei-Metallionen-Mechanismus von Polynukleotid-Polymerasen15 am Beispiel der T7 DNA-Polymerase.20 Die beiden zweiwertigen Metallionen A und B werden im aktiven Zentrum der DNA-Polymerase von den zwei konservierten Aspartatresten D705 sowie D882 komplexiert und ermöglichen den nukleophilen Angriff des 3´-Sauerstoffatoms auf das -Phosphat des eintretenden dNTPs. Die schwarzen Punkte stellen Wassermoleküle dar. Entnommen aus Ref.15
1.2.1.3 Einteilung von DNA-Polymerasen in Familien
DNA-Polymerasen werden entsprechend ihrer Sequenzhomologien in Familien gruppiert. Mittlerweile wurden zahlreiche prokaryotische, eukaryotische sowie archaelle DNA-Polymerasen entdeckt, die den Familien A, B, C, D, E, X, Y und RT zugeordnet wurden.22-26 Trotz unterschiedlicher Funktionen besitzen DNA- Polymerasen übereinstimmende strukturelle Merkmale. Sie ähneln einer rechten
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7
Hand bestehend aus „Finger“, „Handfläche“ und „Daumen“ Domäne,27 wobei DNA- Polymerasen der Y-Familie zusätzlich über eine sogenannte „kleine Finger“ Domäne verfügen.28
1.2.1.4 Genauigkeit und Selektivität von DNA-Polymerasen
Zur Erhaltung der Integrität der DNA ist ein zuverlässiger Kopiermechanismus für eine möglichst fehlerfreie Weitergabe der Erbinformation an nachfolgende Generationen notwendig. Hierbei kommt es jedoch immer wieder zu Mutationen, die einerseits vorteilhaft sein können, wie bei der Adaption an veränderte Umweltbedingungen,29, 30 oder der Reifung des humanen Immunsystems,31-33 andererseits kann aber auch eine Vielzahl von Krankheiten durch Mutationen ausgelöst werden. Einige Beispiele hierfür sind -Thalassämie, cystische Fibrose, Duchenne-Muskeldystrophie oder verschiedene Arten von Krebs.34, 35
Zur Genauigkeit replikativer DNA-Polymerasen tragen verschiedene Faktoren bei.
Zum Einen besitzen diese Enzyme eine hohe Selektivität bei der Auswahl des korrekten dNTP. Außerdem verfügen einige DNA-Polymerasen über eine Korrekturlesefunktion (3´ 5´-Exonukleasefunktion, proofreading) durch die fehlgepaarte Nukleotide aus dem wachsenden DNA-Strang entfernt werden können.
Zusätzlich können post-replikativ Schäden durch die Fehlpaarungsreparatur (MMR, mismatch repair) behoben werden.36 Fehlpaarungen, die nicht bereits während der Replikation durch Proofreading behoben wurden, können post-replikativ über die Fehlpaarungsreparatur aus dem neu synthetisierten DNA-Strang entfernt und die Lücke anschließend wieder aufgefüllt werden. Das Zusammenspiel dieser Einflussfaktoren resultiert in einer in vivo Fehlerrate von ca. 10-9, was weniger als einem Fehler pro einer Milliarde kopierter Basenpaare entspricht (Abb. 5).36
8
Abb. 5: Darstellung der Einflüsse auf die Replikationsgenauigkeit von DNA-Polymerasen.
Dargestellt sind die drei Haupteinflussfaktoren Selektivität, Korrekturlesefunktion und Fehlpaarungsreparatur. Horizontale Blöcke (violett) stellen die Bereiche der Fehlerraten verschiedener DNA-Polymerase-Familien dar. Mögliche Abweichungen der Fehlerraten entsprechen den gebrochenen Blöcken (violett). Modifiziert nach Ref.36
Ursprünglich wurde von Watson und Crick vermutet, dass die hohe Selektivität der DNA-Polymerase bei der Auswahl des eintretenden dNTPs auf die Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basenpaaren zurückgeführt werden kann.2, 37 Mittlerweile wurde jedoch bewiesen, dass die Selektivität einer DNA-Polymerase nicht allein über diese Interaktionen erklärt werden kann. Die Differenz der freien Energien zwischen korrekt und nicht korrekt gepaarten Basenpaaren hätte lediglich eine Fehlerrate von 10-2 zur Folge.36-38 Aufgrund zahlreicher Hinweise wird angenommen, dass die Ursache der hohen Selektivität zum Teil in der Komplementarität des entstehenden Basenpaares zur Nukleotid- Bindungstasche liegt.36, 37, 39-41 Vermutet wird, dass die Festigkeit des aktiven Zentrums (active site tightness) großen Einfluss auf die Auswahl des korrekten dNTPs hat.38, 41-44 Gemäß dieser Hypothese sollen Enzyme mit höherer Genauigkeit das Substrat stärker umschließen und/oder über ein starres aktives Zentrum verfügen, während Enzyme mit geringerer Genauigkeit ein flexibleres aktives Zentrum mit weniger Kontakten zum Substrat aufweisen. Übereinstimmend mit dieser Hypothese konnte in verschiedenen Arbeiten gezeigt werden, dass sterische Effekte wie die
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9
Größe und Form der paarenden Nukleobasen sowie die Rigidität des umgebenden Enzyms einen großen Einfluss auf die Genauigkeit einer DNA-Polymerase haben.41,45 Neben diesen Effekten spielen auch Basenstapelwechselwirkungen des eintretenden dNTPs sowie Wasserstoffbrücken des Enzyms mit der kleinen Furche der DNA eine wichtige Rolle.41, 46 Eine weitere Hypothese, die des induced fit Mechanismus beschäftigt sich mit Konformationsänderungen innerhalb der DNA-Polymerase nachdem das eintretende dNTP gebunden wurde. Dieser für die Knüpfung der Phosphodiesterbindung notwendige Schritt läuft im Falle eines korrekt gepaarten dNTPs wesentlich schneller ab, als im Fallle eines fehlgepaarten Nukleotides, wo möglicherweise sogar keine Konformationsänderung stattfindet.14, 37 Zusätzlich wirkt sich auch die Fähigkeit der DNA-Polymerase zur Verlängerung fehlgepaarter Nukleotide auf ihre Genauigkeit aus, denn nur durch Verlängerung des fehlgepaarten Primer/Templat-Komplexes kommt es zum Basenaustausch. Diese Eigenschaft wird unter anderem durch Interaktionen des Enzyms mit der kleinen Furche der DNA beeinflusst.47, 48
1.2.2 Die Replikation in Prokaryoten
Neben den DNA-Polymerasen sind zahlreiche weitere Enzyme und Proteine an der Replikation beteiligt, wie im Folgenden am Beispiel von E. coli dargestellt wird. Die Initiation der Replikation erfolgt am Replikationsursprung (OriC), wo das Replisom gebildet wird.7 Hierbei handelt es sich um einen Multiprotein-Komplex, der die parentale DNA-Doppelhelix trennt und die beiden Einzelstränge während der Replikation verdoppelt (Abb. 6). Eine Komponente dieses Multiprotein-Komplexes stellt die replikative Helikase (DnaB) dar. Diese besteht aus einem ATP-abhängigen Homohexamer, das den Folgestrang umschließt und die DNA-Doppelhelix in zwei Einzelstränge trennt. Die entstandenen DNA-Einzelstränge werden von Einzelstrang- bindenden Proteinen (SSB) stabilisiert (nicht in der Abbildung gezeigt). Ein weiteres Enzym, die Primase (DnaG), synthetisiert ca. 10-12 nt lange RNA-Primer.49 Bei der Replikation in E. coli werden die beiden elterlichen (parentalen) DNA-Stränge
10
gleichzeitig durch zwei Kopien der DNA-Polymerase III (Pol III) verdoppelt. Diese Enzmye sind mit dem -Proteinkomplex (clamp loader) sowie jeweils einer DNA umschließenden Ringklemme (sliding clamp) verbunden, welche die Prozessivität der DNA-Polymerase stark erhöht.49
Bis auf wenige Ausnahmen, wie beispielsweise Adenovirus oder Bacillus subtilis29, benötigen alle DNA-Polymerasen einen RNA-Primer mit einem freien 3´-OH Ende zur Initiation der DNA-Synthese.50 Im Falle des Bacteriophagen29 wird das benötigte freie 3´-OH Ende von einem terminalen Protein (TP) zur Verfügung gestellt.51 Da DNA-Polymerasen die DNA-Synthese ausschließlich in 5´ 3´-Richtung katalysieren, ist diese nur an einem der beiden parentalen DNA- Stränge, nämlich am Leitstrang, kontinuierlich. Am Folgestrang erfolgt die DNA- Synthese diskontinuierlich. Hier werden lediglich kurze DNA-Fragmente (Okazaki- Fragmente) synthetisiert. Nach Entfernen der RNA-Primer und Auffüllen der fehlenden Desoxyribonukleotide durch die DNA-Polymerase I (Pol I) werden die DNA-Fragmente von einer Ligase kovalent verknüpft.7
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11
Abb. 6: Struktur eines Replisoms am Beispiel von E. coli. Die Helikase (DnaB) umschließt den Folgestrang und trennt die DNA-Doppelhelix in zwei Einzelstränge. Kurze RNA-Primer werden von der Primase (DnaG) synthetisiert. Zwei Pol III DNA-Polymerasen sind über die beiden
-Untereinheiten mit dem -Komplex (clamp loader) verbunden, welche ebenfalls an die Helikase (DnaB) binden. Die beiden Pol III DNA-Polymerasen interagieren mit jeweils einer Ringklemme (sliding clamp), wodurch ihre Prozessivität stark erhöht wird. Die DNA-Synthese am Folgestrang erfolgt aufgrund der antiparallelen Doppelhelix diskontinuierlich. Modifiziert nach Ref.49
1.2.3 Die Replikation in Eukaryoten und Archaeen
Die eukaryotische und archaelle Replikationsmaschinerie unterscheidet sich im Wesentlichen durch die Anzahl der beteiligten Enzyme und Proteine von der in Prokaryoten, wobei die eukaryotische Replikation die größte Komplexizität aufweist.
Neben zahlreichen weiteren Enzymen und Proteinen sind hier mindestens drei DNA- Polymerasen beteiligt: Pol α (Primase), Pol δ und Pol ε.9 Es wird vemutet, dass die Pol δ für die Synthese des Folgestranges und die Pol ε für die Synthese des Leitstranges verantwortlich ist,52, 53 während die Pol γ die Synthese, Reparatur und Rekombination mitochondrialer DNA übernimmt.54, 55
Aufgrund zahlreicher Gemeinsamkeiten mit dem eukaryotischen Replikationsapparat, können archaelle Proteine als Modelle zur Studie der eukaryotischen Replikation herangezogen werden.56-59
12 1.3 Transkription
Die Transkription von DNA in RNA (Ribonukleinsäure) wird in vivo von RNA- Polymerasen übernommen. Die Initiation der Transkripton erfolgt an Promotoren. In Prokaryoten besteht ein Promoter aus zwei Sequenzen, welche -10 bzw. -35 Nukleotide in 5´-Richtung (upstream) vor dem Transkriptionsstart liegen. Die Promotersequenz wird von der -Untereinheit des RNA-Polymerase Holoenzyms (´) erkannt und nach Entwindung der DNA findet die RNA- Synthese komplementär zum DNA-Templatstrang statt (Abb. 7).60 Für eine effiziente Initiation der Transkription benötigen RNA-Polymerasen eine purin-reiche Sequenz am 5´-Ende des Transkriptes.61-63
Abb. 7: Transkription von DNA in Prokaryoten. (A) Strukturen der vier Nukleobasen Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Uracil (U). (B) Aufbau eines Ribonukleotides. (C) Schematische Darstellung der Transkription von DNA in Prokaryoten. Die Bereiche -10 bzw. -35 liegen in 5´-Richtung (upstream) vor dem Transkriptionsstart und bilden den Promoter. Das erste zu transkribierende Nukleotid wird mit +1 gekennzeichnet. Nach Bindung der RNA-Polymerase werden Ribonukleotide (rNTPs) durch das Enzym zum RNA-Transkript umgesetzt. Modifiziert nach Ref.60
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13
Während der Initiationsphase, in der das Enzym an den Promoter gebunden bleibt, werden ca. 7 bis 10 nt synthetisiert. Erst nach einer Konformationsänderung erfolgt die Freisetzung des Promoters. In der darauf folgenden Elongationsphase wird dann das vollständige RNA-Transkript hergestellt.64 Die Termination der Transkription kann über verschiedene Wege erfolgen. Bei der Rho-unabhängigen, intrinsischen Termination wird eine Haarnadelschleife durch die naszierende RNA ausgebildet, welche gefolgt von mehreren Uridin-Resten den Stopp der RNA-Synthese sowie die Dissoziation des Elongationskomplexes zur Folge hat.65 In vitro wird die Transkription von DNA standardmäßig mit rekombinanten RNA-Polymerasen der Bakteriophagen SP6, T7 und T3 durchgeführt.66
1.4 Entstehung und Reparatur von DNA-Schäden
UV-Strahlung, reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS), alkylierende Agenzien oder spontane Hydrolyse sind einige Beispiele exogener und endogener Einflüsse, die zu verschiedensten Schädigungen der DNA führen können. Dazu zählen oxidierte, deaminierte oder alkylierte Nukleobasen, Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere (CPDs), Einzelstrangbrüche (SSBs) oder Doppelstrangbrüche (DSBs) sowie DNA- Addukte.35,67 Schätzungen zu Folge entstehen in einer humanen Zelle 104 bis 106 DNA-Schäden pro Tag.67, 68
Ist die Last an DNA-Schäden zu groß, kann der programmierte Zelltod (Apoptose) eingeleitet werden.67, 69 Um dies zu verhindern, verfügt die Zelle über verschiedene DNA-Reparatursysteme. Im Einzelnen sind dies die direkte Reparatur (direct repair, DR) beispielsweise über die O6-Alkylguanin-Transferase (AGT), die Basenexzisionsreparatur (base excision repair, BER), die Nukleotidexzisionsreparatur (nucleotide excision repair, NER), die Homologe Rekombination (homologous recombination, HR), das Verknüpfen nicht-homologer Enden (non-homologous end joining, NHEJ) oder aber die Fehlpaarungsreparatur (MMR, siehe 1.2.1.4) (Abb. 8). Die Reparaturprozesse unterschieden sich stark
14
hinsichtlich ihrer Komplexität, wobei bis zu mehr als 30 Proteine beteiligt sein können.67
Abb. 8: Ursachen und Reparaturwege häufig vorkommender DNA-Schäden. Modifiziert nach Ref.67
1.5 Bypass von DNA-Schäden
Obwohl ein Großteil der DNA-Schäden durch zelluläre Reparaturmechanismen wieder behoben werden kann (siehe 1.4), bleibt ein biologisch signifikanter Teil bestehen. Dieser führt zum Stopp der replikativen DNA-Polymerase,70 woraufhin spezialisierte TLS (translesion synthesis)-DNA-Polymerasen zum Einsatz kommen, mit deren Hilfe eine Vielzahl von DNA-Schäden überlesen werden können (Abb. 9).
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15
Abb. 9: Darstellung verschiedener DNA-Schäden und die spezifischen TLS-DNA-Polymerasen.
a) Fehleinbau von G gegenüber dem 3´-T eines TT (6-4) Photoproduktes durch die E. coli pol V;
b) Effiziente Verlängerung eines fehlgepaarten Primer/Templat-Komplexes durch die E. coli DNA-Polymerase IV führt zur Verschiebung des Leserasters (frameshift); c) Fehrerbehafteter Einbau von dCMP gegenüber einer abasischen Stelle (X) durch die dCMP-Transferaseaktivität des Rev1 Proteins; d) Fehlerfreier Bypass eines TT (6-4) Photoproduktes durch die DNA- Polymerase und das Rev1 Protein; e) Fehlerfreier Bypass eines TT cis-syn Photodimers durch die DNA-Polymerase ; f) Fehleinbau von dGMP gegenüber T beim Auffülen einer Lücke durch die DNA-Polymerase ; g) Deletion einer Läsion (X) durch die DNA-Polymerase . Modifiziert nach Ref.71
1.5.1 Dpo4 als Modell-TLS-DNA-Polymerase
Mit einer Häufigkeit von ca. 10 000 Schäden in einer Zelle pro Tag72 sind abasische Stellen die am häufigsten unter physiologischen Bedingungen auftretende Läsion der DNA.73 Sie entstehen durch hydrolytische Spaltung der glykosidischen Bindung zwischen der Nukleobase und der Desoxyriboseeinheit (Abb. 10).74
16
Abb. 10: Strukturen einer natürlichen (A) und einer stabilisierten (B) abasischen Stelle.
Ein klassisches Modellenzym für Studien von abasischen Stellen ist die Dpo4 TLS- DNA-Polymerase, die eine Homologie zur humanen DNA-Polymerase aufweist.57 Die Dpo4 DNA-Polymerase dient häufig als Modellenzym für TLS-DNA- Polymerasen, da erst kürzlich Kristallstrukturen der DNA-Polymerase von Biertümpfel et al.75 gelöst werden konnten. Diese thermostabile distributive TLS- DNA-Polymerase aus Sulfolobus solfataricus P2 wird der Y-Familie zugeordnet und verfügt über Mechanismen zum Bypass (Überlesen) verschiedener DNA-Läsionen.
Neben abasischen Stellen können auch Läsionen wie cis-syn Cyclobutan-Thymin- Thymin-Dimere (CPDs) oder Cisplatin-DNA-Addukte überlesen werden.70, 76, 77 Eine Besonderheit dieser TLS-DNA-Polymerase ist die Eigenschaft, dass sie über unterschiedliche Mechanismen zum Bypass von Läsionen verfügt. Wie von Fiala und Suo78 gezeigt werden konnte, kommen beim Überlesen von abasischen Stellen im Templat, hauptsächlich zwei Mechanismen zum Einsatz, die in Konkurrenz zu einander stehen. Einerseits ein Mechanismus entsprechend der „A-rule“, nach der bevorzugt ein Adenin gegenüber einer abasischen Stelle inkorporiert wird,79-82 alternativ dazu kann die Läsion im Templat auch durch einen sogenannten "Lesion loop-out“ Mechanismus („5´-rule“) überlesen werden. Bei diesem wird die abasische Stelle extrahelikal in einer Lücke zwischen dem kleinen Finger, einer zusätzlichen Domäne bei DNA-Polymerasen der Y-Familie, und der Fingerdomäne aufgenommen.
Die in 5´-Richtung folgende Base dient dabei als Templat zur Auswahl des nächsten dNTPs. Bleibt die Läsion extrahelikal, so entsteht ein -1 frameshift. Im Falle eines
„Realignments“ kann es zu Mutationen kommen (Abb. 11).70, 78, 83 Die Präferenz,
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welcher der beiden Wege genutzt wird, hängt sowohl vom Sequenzkontext des DNA- Templates als auch von der Reaktionstemperatur ab.70, 78
Abb. 11: Mögliche Mechanismen der Dpo4 DNA-Polymerase beim Überlesen von abasischen Stellen. Weg 1: Inkorporation von dATP gegenüber der Läsion entsprechend der „A-rule“; Weg 2:
„Lesion loop-out“ Mechanismus. Hier wird die Läsion extrahelikal aufgenommen und die in 5´-Richtung folgende Base als Templatbase zur Auswahl des eintretenden dNTPs verwendet.
Bleibt die Läsion extrahelikal bestehen, entsteht ein -1 frameshift; durch „Realignment“ wird dies verhindert. Modifiziert nach Ref.78
1.6 Biotechnologische Anwendungen von DNA-Polymerasen
1.6.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die wohl bekannteste Anwendung von DNA-Polymerasen ist der Einsatz in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) nach Kary Mullis.84 Mittlerweile wurde die klassische Methode der exponentiellen DNA-Amplifikation mittels zweier Primeroligonukleotide für verschiedenste Anwendungen weiterentwickelt. Beispielsweise kann die Produktbildung durch die Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffes SYBRGreen I in Echtzeit verfolgt werden.85 Aus dem breiten Spektrum der Anwendungen der PCR86 sei hier ein wichtiges Beispiel genannt. Die Detektion sogenannter SNPs (Einzelnukleotidpolymorphismen, single nucleotide polymorphisms). Bei diesen handelt es sich um einzelne Nukleotide, die innerhalb
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eines kodierenden Gens oder aber einer nicht-kodierenden Region des Genoms ausgetauscht sind. Kommt diese Variation mit einer Häufigkeit von mindestens 1%
innerhalb der Bevölkerung vor, so spricht man von SNPs.87 Es wird vermutet, dass SNPs die Prädisposition für bestimmte Krankheiten beeinflussen, wie im Falle der Faktor-V-Leiden-Mutation oder des Einzelnukleotidaustausches im Apolipoprotein- E-Gen, welche für das Auftreten von Venenthrombose bzw. der Alzheimer Krankheit verantwortlich gemacht werden.88-90 Außerdem sollen durch die Erforschung von SNPs zukünftig wichtige Informationen über die Ursachen individueller Reaktionen auf Medikamente (pharmacogenomics) gewonnen werden können.91, 92 Verschiedene PCR-basierte Methoden wie die allelspezifische PCR, die Invader PCR oder der TaqMan-Assay können zur Detektion von SNPs eingesetzt werden.90, 93-96
1.6.2 Next Generation Sequencing
DNA-Polymerasen finden ebenfalls Anwendung im next generation sequencing. Seit Einführung dieser relativ neuen Sequenzierungstechnologien im Jahr 200497 wurden mehrere hundert Publikationen zum Thema veröffentlicht, was den hohen Stellenwert dieser Technologien in der aktuellen Forschung wieder spiegelt. Das Spektrum der Anwendungen reicht von zahlreichen Sequenzierungsprojekten zur Entschlüsselung kompletter Genome über Transkriptomanalysen97, 98 bis hin zur Sequenzierung von Metagenomen.97, 99, 100 Bei den am häufigsten genutzten Systemen 454 FLX (Roche Applied Sciences), Solexa 1G (Illumina) und SOLiD (Applied Biosystems) erfolgt im ersten Schritt eine Amplifikation der zu sequenzierenden Probe mittels DNA- Polymerasen. Entweder in einer Emulsions-PCR (Roche Applied Sciences, Applied Biosystems) oder über Brückenamplifikation (bridge amplification) (Illumina). Die nachfolgenden Sequenzierungsschritte unterscheiden sich je nach Anbieter und beeinhalten eine Pyrosequenzierung (Roche Applied Sciences) oder die Seqenzierung aufgrund Nukleotid-abhängiger Fluoreszenzsignale (Illumina, Applied Biosystems).97,98
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19
1.6.3 Herstellung nicht-natürlicher DNA-Analoga
Auch bei der enzymatischen Synthese von nicht-natürlichen DNA-Analoga durch den Einbau modifizierter Nukleotide werden DNA-Polymerasen genutzt.101, 102 Die Polymerisation von 2´-O,4´-C-verknüpften LNA (locked nucleic acid)- Nukleotiden103, 104 sowie threosyl- oder glyceryl-modifizierten Nukleotiden führt zu DNA-Analoga wie LNA, TNA oder GNA.105-108 Zur Umsetzung von nicht- natürlichen Substraten sind häufig maßgeschneiderte Enzymvarianten erforderlich, die durch Methoden der gerichteten Evolution erhalten werden können (siehe 1.7).86,
109-115
1.7 Gerichtete Evolution
Obwohl die kommerzielle Verfügbarkeit verschiedener DNA- und RNA-Polymerasen die Biotechnologie revolutioniert hat, sind die Anwendungen der Wildtyp-Enzyme aufgrund ihres eingeschränkten Substratspektrums oder der geringen Thermostabilität limitiert.116 Eine weit verbreitete Methode zur Generierung von Enzymen mit veränderten Eigenschaften stellt die gerichtete Evolution (directed evolution) dar. Bei den Methoden der gerichteten Evolution werden einzelne Sequenzabschnitte oder auch die gesamte Gensequenz des Zielproteins zufällig verändert, wodurch Varianten mit veränderter Aminosäuresequenz entstehen. Häufig hat dies eine Veränderung der Eigenschaften des Zielproteins zur Folge. Der Vorteil dieser Methode gegenüber dem rationalen Design (rational design),117-122 bei dem gezielt Aminosäuren ausgetauscht werden, besteht vor allem darin, dass keine detaillierten Kenntnisse über die Struktur des Enzyms erforderlich sind. Ziele bei der Generierung von DNA-Polymerase- Varianten mit veränderten Eigenschaften sind häufig ein erweitertes Substratspektrum,109-112, 115, 116, 123-125 die Erhöhung der Thermostabilität116, 126 oder eine erhöhte Genauigkeit.47, 122, 127
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1.7.1 Zufällige Mutagenese mittels error-prone PCR
Eine klassische Methode der gerichteten Evolution zur Generierung einer Mutantenbibliothek stellt die error-prone PCR (epPCR) dar. Bei dieser fehleranfälligen PCR wird die Mutationshäufigkeit im Wesentlichen durch drei Einflussfaktoren bestimmt: die Genauigkeit der DNA-Polymerase, die Länge des mutierten Gens sowie die Anzahl der PCR-Zyklen.128 Aufgrund ihrer vergleichsweise geringen Genauigkeit wurde ursprünglich die Taq DNA-Polymerase für die in vitro Mutagenese verwendet.128, 129 Mittlerweile sind noch weitere fehleranfällige DNA- Polymerasen kommerziell verfügbar.130, 131 Zur weiteren Verringerung der Genauigkeit der Enzyme können Mn2+ sowie unterschiedliche Mengen dNTPs in der PCR eingesetzt werden.128, 129 Mit dieser Methode wurden randomisierte Variantenbibliotheken erhalten, aus denen DNA-Polymerasen mit verschiedensten Eigenschaften hervorgingen.125, 132-135 Die Vorgehensweise zur Herstellung und Durchmusterung solcher Bibliotheken ist beispielhaft in Abb. 12 dargestellt.
Abb. 12: Prinzip der Herstellung und Durchmusterung einer mittels error-prone PCR randomisierten Variantenbibliothek. Randomisierte Gene werden in einen Expressionsvektor eingebracht und ein Wirtsstamm mit den rekombinanten Vektoren transformiert. Nach Vereinzelung und Expression der erhaltenen Klone können die Enzyme auf die gewünschte Aktivität hin durchmustert werden. Bei Bedarf können weitere Randomisierungsrunden folgen.
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21 1.7.2 Rekombinations-basierte Mutagenese
Durch Rekombinations-basierte Methoden wie die Rekombination mehrerer Gene (gene shuffling oder staggered extension process, StEP)136-138 können ebenfalls Bibliotheken von Enzymvarianten erhalten werden. Auch durch die Vermehrung des Zielgens in einem Wirtsstamm mit fehlerhaften DNA-Reparaturmechanismen (mutator strains) können Mutationen eingebracht werden.116, 139 Ein neuer Ansatz ist die von Schwaneberg und Mitarbeitern entwickelte SeSaM-Methode (sequence saturation mutagenesis) durch die ein hoher Grad der Randomisierung einer Zielsequenz ermöglicht wird.140
1.7.3 Screening- und Selektionsverfahren
Zur Identifizierung neuer Varianten stehen zahlreiche Screening- und Selektionsverfahren zur Verfügung, die in abhängig von der gewünschten Eigenschaft angewandt werden können. Wichtig zur Identifizierung von Enzymvarianten mit neuen Eigenschaften ist die Verknüpfung des erzeugten Genotyps mit dem daraus resultierenden Phänotyp.141, 142
Beispielsweise kann die natürliche Aktivität von DNA-Polymerasen bei der in vivo Selektion von DNA-Polymerasen mit geringer Genauigkeit genutzt werden. Der Bakterienstamm E. coli trpE65 ist nicht in der Lage Tryptophan zu synthetisieren und wächst deshalb nicht ohne Zugabe von Tryptophan. Selektiert werden Bakterien, die nach der Transformation mit Plasmiden, welche rekombinante DNA-Polymerasen enthalten, ohne Zugabe von Tryptophan wachsen können. Aufgrund der höheren Fehleranfälligkeit der auf dem Plasmid codierten DNA-Polymerase sind reverse Mutation im Gen trpE65 entstanden, die für das Wachstum der Bakterien verantwortlich sind.116, 143
Die von Holliger und Mitarbeitern entwickelte CSR (compartmentalized self- replication)132 ist besonders für die Selektion von DNA- und RNA-Polymerasen geeignet und basiert auf dem Prinzip der Wasser-in-Öl-Kompartimentierung von
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Tawfik und Griffiths.141 Beispielsweise konnten durch CSR DNA-Polymerasen mit erhöhter Thermostabilität und erhöhter Resistenz gegen Heparin selektiert werden.132 Diese Methode nutzt die natürliche Aktivität der DNA-Polymerase, um ihr eigenes randomisiertes Gen zu replizieren (Abb. 13). Im ersten Schritt werden rekombinante Plasmide mit randomisierten Gensequenzen in einen E. coli Expressionsstamm eingebracht und exprimiert. Die Bakterien werden einzeln in einer Wasser-Öl- Emulsion, welche Reaktionspuffer, Primer und dNTPs enthält, kompartimentalisiert und anschließend durch einen Hitzedenaturierungsschritt lysiert. Die exprimierte DNA-Polymerase sowie das randomisierte Gen-Templat gelangen so in das Kompartiment mit Primern und dNTPs. In der darauf folgenden PCR werden die Template in Kompartimenten mit PCR-aktiven DNA-Polymerasen amplifiziert. Diese Gene können anschließend für eine weitere CSR-Runde verwendet werden.132
Abb. 13: CSR (compartmentalized self-replication) zur in vitro Selektion von DNA-Polymerase- Varianten. 1.: Klonierung und Expression randomisierter Gene. 2.: Kompartimentalisierung der Bakterien in einer Wasser-Öl-Emulsion unter Zugabe von Primern und dNTPs. 3.: CSR nach Freisetzung der DNA-Polymerase. In Kompartimenten mit aktiven DNA-Polymerasen (Kugeln) erfolgt eine Amplifikation der Zielgene. In Kompartimenten mit inaktiven DNA-Polymerasen (Hexagon) erfolgt keine Amplifikation. Amplifizierte Gene können für weitere CSR-Runden eingesetzt werden. Modifiziert nach Ref.132
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Ein von Summerer und Marx für das Hochdurchsatz-Screening (HTS, high throughput screening) von DNA-Polymerasen entwickelter Ansatz nutzt die Eigenschaft des Fluoreszenzfarbstoffs SYBRGreen I zur Detektion von doppelsträngiger DNA (dsDNA).144 Die geringe Eigenfluoreszenz des Farbstoffs wird nach Bindung an die kleine Furche von dsDNA stark erhöht. Die Fluoreszenz wird bei einer Wellenlänge von 485 nm angeregt, die Emmision erfolgt bei 520 nm und kann im Multiwell-Format bestimmt werden. Die Verwendung von SYBRGreen I sowohl in Primerverlängerungsreaktionen als auch beim PCR-basierten Screening ermöglicht einen vielfältigen Einsatz dieser einfachen Methode. Die Messung kann als Endpunktbestimmung erfolgen oder aber die Produktbildung in Echtzeit verfolgt werden (Abb. 14).
Abb. 14: Fluoreszenz-basiertes in vitro Aktivitäts-Screening von DNA-Polymerasen. Die geringe Eigenfluoreszenz des Farbstoffes SYBRGreen I wird nach Bindung an dsDNA stark erhöht.
Aktive DNA-Polymerasen können durch Detektion der Fluoreszenz (ex=485 nm, em=520 nm) von nicht aktiven unterschieden werden. Pol: DNA-Polymerase. Modifiziert nach Ref.144
Mit Hilfe dieser fluoreszenz-basierten Methode wurden DNA-Polymerase-Varianten mit verschiedenen neuen Eigenschaften erfolgreich identifiziert. Einige Beispiele sind DNA-Polymerasen mit einer erhöhten Genauigkeit,47, 127 einer Reversen Transkriptase (RT)-Aktivität,133 der Fähigkeit ausgehend von stark geschädigter DNA zu amplifizieren134 oder auch das Überlesen abasischer Stellen.135
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2 Aufgabenstellung
Ziel dieser Arbeit war die Evolvierung einer DNA-Polymerase mit erweitertem Substratspektrum. Es sollte eine DNA-Polymerase erhalten werden, welche über eine effiziente RNA-Polymerase-Aktivität zur Inkorporation von Ribonukleotiden verfügte. Durch eine DNA-Polymerase, die in der Lage ist Ribonukleotide effizient als Substrat umzusetzen, sollte die Möglichkeit zur promoter-unabhängigen Transkription von beispielsweise durch RNA-Polymerasen schwer zugänglichen Sequenzen geschaffen werden. Zum Erhalt einer DNA-Polymerase mit erhöhter RNA-Polymerase-Aktivität sollten Methoden der gerichteten Evolution eingesetzt werden. Ausgehend von der Gensequenz der Therminator DNA-Polymerase, welche über eine gewisse Akzeptanz für Ribonukleotide verfügte, sollte zuerst eine randomisierte Mutagenese der gesamten Gensequenz durchgeführt werden. Nach Identifizierung einer geeigneten Variante, sollte deren Gensequenz als Ausgangssequenz für eine weitere Mutagenese eingesetzt werden, um eine weitere Verbesserung der gewünschten Eigenschaft zu erreichen. Zur Durchführung dieser Arbeiten sollte vorab ein geeigneter Assay für die Durchmusterung im Hochdurchsatz nach Varianten mit einer erhöhten RNA-Polymerase-Aktivität gefunden und optimiert werden.
Desweiteren sollte die evolvierte DNA-Polymerase eine erhöhte Akzeptanz für 2´-OH-modifizierte Ribonukleotide sowie C5-modifizierte Desoxyribonukleotide aufweisen, um zusätzlich die enzymatische Synthese modifzierter RNA- bzw. DNA- Analoga durch diese DNA-Polymerase zu ermöglichen. Durch den Einbau spin- funktionalisierter Desoxyribonukleotide, die unter anderem für die Anwendung in der EPR-Spektroskopie (Elektronenspinresonanz, electron paramagnetic resonance) entwickelt wurden145 sollten DNA-Analoga mit radikalischen Eigenschaften erhalten werden.
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In einem weiteren Teil der Arbeit sollte der Einfluss elektrostatischer Wechselwirkungen einer TLS (translesion)-DNA-Polymerase beim Überlesen einer abasischen Stelle untersucht werden. Es sollte untersucht werden, ob die Fähigkeit zum Bypass einer abasischen Stelle durch das Eliminieren von kationischen Interaktionen der DNA-Polymerase mit dem Rückgrat der DNA bzw. mit anderen Aminosäureresten im Enzym beeinflusst werden kann. Dies sollte mit der Dpo4 TLS- DNA-Polymerase erfolgen. Zuerst sollte anhand von Kristallstrukturen der Dpo4 DNA-Polymerase eine geeignete kationische Aminosäure identifiziert und diese mittels ortsgerichteter Mutagenese durch eine ungeladene Aminosäure mit ähnlichem sterischen Anspruch substituiert werden. Im Anschluss daran sollte die Fähigkeit zum Bypass der Läsion ermittelt und durch die Bestimmung der spezifischen Aktivität quantifiziert werden.
Im letzten Teil der Arbeit sollten Erkenntnisse zum Mechanismus der Nukleotidauswahl gegenüber einer abasischen Stelle in einer DNA-Polymerase der B-Familie erhalten werden. Es sollte überprüft werden, ob es sich bei dem für die KlenTaq DNA-Polymerase (A-Familie) formulierten amino acid templating Mechanismus82 (siehe 3.3.1) um einen allgemein gültigen Mechanismus handelt, der in verschiedenen DNA-Polymerase-Familien Anwendung findet. Anhand von Kristallstrukturen sollte eine aromatische Aminosäure identifiziert werden, welche die Aufgabe des Tyr671 analog zur KlenTaq DNA-Polymerase übernehmen könnte, ausgewählt werden. Durch ortsgerichtete Mutagenese sollte diese Aminosäure durch Alanin bzw. Tryptophan ersetzt und der Einfluss auf die Nukleotidauswahl sowie die Bypass-Aktivität der Varianten getestet werden. Die Tryptophan-Substitution sollte der eigentlichen Überprüfung des Mechanismus dienen. Durch die Alanin- Substitution sollten zusätzlich die Auswirkungen durch eine stark verkürzte nicht aromatische Seitenkette untersucht werden.
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3 Ergebnisse und Diskussion
3.1 Generierung einer Variante der Therminator DNA-Polymerase mit erweitertem Substratspektrum zur Inkorporation von Ribonukleotiden und Zucker- bzw. Basen-modifizierten Nukleotiden
3.1.1 Einleitung
DNA-Polymerasen werden bereits vielfältig für biotechnologische Zwecke eingesetzt (siehe 1.6).86, 116 Aktuelle Beispiele hierfür sind Anwendungen wie das Next-Generation Sequencing,146 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)147-149 oder die DNA-Nanotechnologie.150-152 Allerdings könnten die Anwendungsmöglichkeiten von DNA-Polymerasen durch die Erweiterung des Substratspektrums noch ausgedehnt werden.
Interessant ist der Ansatz eine DNA-Polymerase mit erhöhter Akzeptanz von Ribonukleotiden (RNA-Polymerase-Aktivität) zu generieren. Dadurch könnte eine Möglichkeit zur promoter-unabhängigen Synthese von RNA geschaffen werden.
Bisher werden standardmäßig promoter-abhängige RNA-Polymerasen in der in vitro Transkription eingesetzt. Diese benötigen jedoch für eine effiziente Initiation der RNA-Synthese eine purin-reiche Sequenz am 5´-Ende des Transkriptes (siehe 1.3).61-63 Somit beginnen die erhaltenen Transkripte mit einem bis mehreren Purinen. Eine Möglichkeit dies zu umgehen besteht darin, sich selbst schneidende RNA-Sequenzen, sogenannte Ribozyme, vor und nach der Zielsequenz einzubringen, so dass die Zielsequenz nach erfolgreicher Transkription durch die Ribozyme heraus geschnitten werden kann.61 Eine weitaus einfachere Methode um die Variabilität der transkribierten RNA-Sequenzen zu erhöhen, wäre jedoch die promoter-unabhängige Transkription durch eine DNA-Polymerase, die lediglich ein Primeroligonukleotid mit einem freien 3´-OH-Ende benötigt. In mehreren Arbeitsgruppen wurde bereits
28
versucht DNA-Polymerasen mit einer erhöhten Akzeptanz für Ribonukleotide zu evolvieren. Zwar waren die erhaltenen Varianten in der Lage rNTPs effizient zu inkorporieren, die RNA-Synthese wurde aber schon nach wenigen Einbauten abgebrochen.113, 117, 119, 123, 124, 153
Eine weitere interessante Einsatzmöglichkeit einer DNA-Polymerase mit erweitertem Substratspektrum stellt die enzymatische Synthese modifizierter DNA- oder RNA- Analoga mit veränderten Eigenschaften dar. Desoxyribonukleotide, die Modifikationen an der Nukleobase tragen, bilden die Grundlage aktueller biotechnologischer Anwendungen. Ein bekanntes Beispiel hierfür ist das next generation sequencing. Hier werden Fluoreszenz-markierte Nukleotide verwendet, die eine Modifikation an der Nukleobase tragen.146 Die Vielfalt modifizierter Nukleotide wird künftig noch zunehmen, was die Entwicklung von DNA- Polymerasen, die solche Nukleotide als Substrate verwerten können, erforderlich macht. Handelt es sich um Pyrimidine, sind diese Modifikationen fast ausschließlich an der C5-Position zu finden. Dadurch soll die Fähigkeit zur Watson-Crick- Basenpaarung aufrecht erhalten werden.154 Der Einbau von C5-funktionalisierten Nukleotiden ermöglicht beispielsweise die enzymatische Synthese von DNA-Analoga mit radikalischen Eigenschaften zur Anwendung in der Elektronenspinresonanz (EPR, electron paramagnetic resonance)-Spektroskopie.125, 145
Durch die Inkorporation von 2´-modifizierten Ribonukleotiden in RNA können Eigenschaften wie die Thermostabilität von Duplexen155 oder die Nukleaseresistenz109, 155 im Vergleich zur nicht modifizierten RNA deutlich erhöht werden, was vor allem für den Einsatz als siRNA attraktiv ist.156, 157
Eine weit verbreitete Methode zur Generierung von Enzymen mit veränderten Eigenschaften, wie einem erweiterten Substratspektrum, stellt die gerichtete Evolution (directed evolution) dar (siehe 1.7).86, 116 Es konnten bereits DNA- Polymerase-Varianten generiert werden, die in der Lage sind DNA-Bausteine mit verschiedensten Modifikationen als Substrate zu akzeptieren und modifizierte DNA- Analoga zu synthetisieren.109-115
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In dieser Arbeit sollte das Substratspektrum der Therminator DNA-Polymerase durch gerichtete Evolution erweitert werden. Bei der Therminator DNA-Polymerase handelt es sich um eine 3´ 5´-Exonuklease-defiziente Variante (D141A/E143A/A485L) der 9°N DNA-Polymerase.158 Die 9°N DNA-Polymerase wird der B-Familie zugeordnet und wurde 1996 erstmals aus dem extrem thermophilen Archaebakterium Thermococcus species 9°N-7 isoliert.159
Ziel dieser Arbeit war es eine Variante zu identifizieren, die neben natürlichen Desoxyribonukleotiden und Ribonukleotiden auch modifizierte Nukleotide effizient als Substrate umsetzen kann. Als Substrate wurden dNTPs, rNTPs, C5-modifiziertes 2´-Deoxyuridintriphosphat sowie 2´-modifizierte Desoxycytidintriphosphate (2´-NH2-dCTP, 2´-F-dCTP, 2´-O-Methyl-dCTP) ausgewählt. Diese DNA-Polymerase wurde als Ausgangspunkt für die gerichtete Evolution gewählt, da bereits das Wildtyp-Enzym über eine mäßige RNA-Polymerase-Aktivität verfügte160 und zusätzlich verschiedene nicht natürliche Nukleotidanaloga als Substrate akzeptiert.102,
161-163
3.1.2 Ergebnisse
3.1.2.1 Herstellung von rekombinanten Plasmiden für die Expression der Therminator Wildtyp DNA-Polymerase
Als Ausgangssequenz wurde ein Codon-optimiertes Genkonstrukt der Therminator DNA-Polymerase (9°N D141A/E143A/A485L) verwendet, dessen Nukleotidsequenz für die Expression in E. coli optimiert war.164 Diese wird im Folgenden als Therminator Wildtyp (Therminator WT) bezeichnet. Für die Expression der Therminator DNA-Polymerase wurde die Gensequenz mittels PCR amplifiziert und nach Verdau mit den beiden nicht isoschizomeren Restriktionsendonukleasen BamHI und SalI in den Expressionsvektor pGDR11 eingebracht. Bei diesem handelt es sich um ein Derivat des Vektors pQE-31 mit zusätzlichem laqIq Gen für eine verstärkte
30
Kontrolle der Basalexpression.165 Das hergestellte Konstrukt wird im Folgenden mit pGDR11-Therminator WT bezeichnet.
3.1.2.2 Herstellung einer zufällig randomisierten Therminator-Variantenbibliothek mittels error-prone PCR
Zur Identifizierung von Enzymvarianten mit einer erhöhten Akzeptanz von Ribonukleotiden, sowie Zucker- bzw. Basen-modifizierten Nukleotiden, wurde eine zufällig randomisierte Enzymbibliothek hergestellt. Die Randomisierung erfolgte ausgehend von der Therminator Wildtyp-Sequenz durch error-prone PCR (siehe 1.7.1). In dieser PCR wird die Fehleranfälligkeit der ohnehin schon ungenauen Taq DNA-Polymerase durch Zugabe von Mn2+-Ionen weiter erhöht.128, 129 Somit kann die Mutationsrate während der DNA-Amplifikation über die in der epPCR eingesetzte Mn2+-Konzentration beeinflusst werden. Für die randomisierte Mutagenese wurden zwei unterschiedliche Mn2+-Konzentrationen von 0,15 mM und 0,3 mM MnCl2
eingesetzt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden anschließend durch die Verwendung der Restriktionsendonukleasen BamHI und SalI in den Expressionsvektor pGDR11 kloniert und die dadurch erhaltenen rekombinanten Plasmide in E. coli XL10gold Bakterien transformiert. Nach Anlegen von Plattenkulturen wurden die Kolonien in 384-Deep-well-Platten vereinzelt. Die Überexpression der rekombinanten Enzyme erfolgte in 1 ml Kulturvolumen.
Anschließend wurde die Aktivität hergestellter Lysate von 88 Varianten mit dNTPs als Substrat bestimmt. Es wurde festgelegt, dass 40% bis 50% der Enzyme innerhalb einer Bibliothek aktiv sein sollten. Als aktive Enzyme wurden solche eingestuft, welche mindestens 70% der Aktivität der Therminator Wildtyp DNA-Polymerase mit dNTPs als Substrat zeigten. Um dies festzustellen, wurden von jeder Enzymbibliothek 88 Mutanten in Primerverlängerungsreaktionen mit SYBRGreen I untersucht (siehe 6.6.6). Die Anzahl aktiver Varianten war von der Mn2+-Konzentration während der epPCR abhängig. Bei einer Mn2+-Konzentration von 0,15 mM MnCl2 wurden 42 aktive Varianten detektiert, was einem Anteil von 48% entsprach. Im Vergleich hierzu wurden bei einer eingesetzten
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31
Mn2+-Konzentration von 0,3 mM lediglich 12 Varianten als aktiv eingestuft, was einem prozentualen Anteil von 14% der getesteten Enzyme entsprach (Abb. 15).
Aufgrund dieser Ergebnisse wurde zur Herstellung einer umfassenderen Variantenbibliothek eine Konzentration von 0,15 mM MnCl2 gewählt.
Abb. 15: Prozentualer Anteil aktiver Varianten aus zufällig randomisierten Variantenbibliotheken.
Die Randomisierung erfolgte mittels epPCR mit 0,15 mM bzw. 0,3 mM MnCl2. Untersucht wurden jeweils 88 Varianten. Als aktiv wurden Varianten eingestuft, die mindestens 70 % der Wildtyp-Aktivität in Primerverlängerungsreaktionen mit dNTPs als Substrat zeigten.
3.1.2.3 Heterologe Expression der Therminator DNA-Polymerase
Die heterologe Expression der rekombinanten Therminator DNA-Polymerase wurde durch Verwendung des Expressionvektors pGDR11-Therminator WT in E. coli XL10gold Bakterien durchgeführt. Die Induktion der Proteinexpression erfolgte jeweils mit einer Endkonzentration von 1 mM IPTG. Nach einer Expressionszeit von 4 Stunden war eine deutliche Proteinbande der Therminator DNA-Polymerase sichtbar (Abb. 16).
32
Abb. 16: SDS-PAGE nach Coomassie-Färbung. Qualitative Analyse der Überexpression der Therminator WT DNA-Polymerase in E. coli XL10gold (XL10gold) mit pGDR11-Therminator WT. M: Marker; Bahn 1: Probe vor Induktion; Bahn 2: Probe 4 Stunden nach Induktion mit 1 mM IPTG. Der Pfeil markiert die erwartete Proteinbande der Therminator DNA-Polymerase mit einer Größe von ca. 92 kDa. Die Proben wurden auf die gleiche Zellzahl eingestellt. Details siehe 6.4.1.
3.1.2.4 Proteinexpression der Variantenbibliothek für das Hochdurchsatz-Screening
Um einen möglichst hohen Durchsatz bei der Durchmusterung einer Enzymbibliothek erzielen zu können, ist es erforderlich die Proteinexpression in einem geringen Kulturvolumen durchzuführen. Üblicherweise erfolgt dies in 96-Deep-well-Platten mit einem Expressionsvolumen von 1 ml. Problematisch ist hierbei oftmals eine für die Durchmusterung ausreichende Proteinmenge zu erhalten, wobei eine möglichst gleichmäßige Proteinexpression in den 96 parallel exprimierten Kulturen erreicht werden sollte. In dieser Arbeit wurden verschiedene Einflussgrößen wie die optische Dichte der Bakterienkulturen zum Induktionszeitpunkt, die Expressionszeit und die Zusammensetzung des Lysepuffers optimiert, so dass eine für die Durchmusterung ausreichende Proteinmenge bei gleichmäßigen Proteinkonzentrationen erhalten werden konnte, wie beispielhaft in Abb. 17 gezeigt ist.
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Abb. 17: SDS-PAGE nach Coomassie-Färbung. Proteinexpression der Therminator DNA- Polymerase in 96-Deep-well-Platten. M: Marker, Bahn 1: Therminator WT DNA-Polymerase, Bahn 2: Negativkontrolle (pGDR11-Leervektor ohne Insert), Bahn 3 bis 10: Varianten der Therminator DNA-Polymerase. Der Pfeil markiert die erwartete Proteinbande der Therminator DNA-Polymerase mit einer Größe von ca. 92 kDa.
3.1.2.5 Durchmusterung der Therminator-Variantenbibliothek nach randomisierter Mutagenese
Die Anwendbarkeit einer am Lehrstuhl entwickelten chip-basierten Screening- Methode wurde für die Durchmusterung nach RNA-aktiven Varianten untersucht. Die verwendete Primerverlängerungs-Methode „Oligonucleotide Adressed Enzyme Assay“ (OAEA)166 basiert auf der kovalenten Immobilisierung von Primeroligonukleotiden auf einer Glasoberfläche (glass slide). Zur Durchmusterung im Hochdurchsatz wurden DNA-Primer eingesetzt. Diese wurden mit Hilfe des Nanoplotter 2.0 Systems (GeSiM) an definierten Punkten (spots) aufgetragen. Durch Zugabe der Reaktionsmischung mit dem entsprechenden DNA-Templat, den Nukleotiden sowie der zu untersuchenden Enzymvariante, konnte eine Primerverlängerungsreaktion stattfinden. Aufgrund der Thermostabilität der Therminator DNA-Polymerase konnte das Bakterienlysat nach einem Hitzedenaturierungsschritt zur Inaktivierung von E. coli DNA-Polymerasen ohne weitere Reinigungsschritte zur Durchmusterung eingesetzt werden. Um RNA-aktive
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DNA-Polymerasen zu identifizieren, wurden Ribonukleotidtriphosphate (rNTPs) als Substrat eingesetzt, wobei 7,5% des Uridintriphosphats (UTP) durch ein biotinyliertes dUTP-Analogon ersetzt wurden. Während der Inkubationszeit von 1 Stunde bei 55° C wurden in den spots, die RNA-aktive Enzyme enthielten, biotinylierte RNA-Produkte generiert. Diese konnten durch die nachfolgende Bindung eines Streptavidin- konjugierten Fluoreszenzfarbstoffes (Streptavidin-Alexa Fluor 546 Konjugat) detektiert werden (Abb. 18). Es wurden parallel 96 Reaktionen durchgeführt.
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Abb. 18: Chip-basierter Primerverlängerungs-Assay zur Durchmusterung der randomisierten Therminator-Variantenbibliotek. A) Prinzip des Oligonucleotide addressed enzyme assay (OAEA). Immobilisierte DNA Primer alleine sowie DNA-Primer/DNA-Templat-Komplexe (grau), DNA-Polymerase (gelb), synthetisierte RNA (blau) sowie Streptavidin-Alexa Fluor 546 Konjugat (grüne Sterne) gebunden an biotinylierte (grüne Kugeln) RNA-Stränge. B-C) Fluoreszenzanalysen der Wildtyp DNA-Polymerase mit rNTPs (B) bzw. dNTPs (C) als Substrat.
D-E) analog B-C) mit pGDR11 ohne Insert als Negativkontrolle (pGDR11). Inlets: Ausgewertete Reaktionen nach Bindung von Streptavidin-Alexa Fluor 546 Konjugat. Modifiziert nach Ref.125
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Mit dieser Methode war es möglich RNA-aktive DNA-Polymerasen reproduzierbar zu detektieren. Von den 1760 untersuchten Varianten waren 512 in der Lage biotinylierte RNA-Produkte zu bilden. Die RNA-Aktivität dieser Varianten wurde anschließend in 5´-32P-markierten Primerverlängerungsreaktionen näher untersucht.
Hierbei zeigten 37 Varianten eine erhöhte Aktivität bei der Konversion von Ribonukleotiden im Vergleich zur Wildtyp DNA-Polymerase (Daten nicht gezeigt).
Anschließend wurden die drei Varianten mit der höchsten RNA-Aktivität im Batch- Verfahren mittels Ni-IDA-Affinitätschromatographie gereinigt und mit den gereinigten Wildtypen der 9°N DNA-Polymerase und der Therminator DNA- Polymerase in Primerverlängerungsreaktionen eingesetzt (Abb. 19). Die 9°N Wildtyp DNA-Polymerase sowie die Therminator Wildtyp DNA-Polymerase konnten lediglich 6 nt bzw. 10 nt aufeinanderfolgend einbauen, was zu DNA/RNA- Transkriptionsprodukten von 26 nt bzw. 30 nt führte. Im Gegensatz dazu wurden mit den Varianten G3 und H3 Transkriptionsprodukte mit einer Länge von 57 nt bzw.
54 nt synthetisiert. Die höchste RNA-Aktivität zeigte jedoch die Variante A5. Diese war in der Lage aufeinanderfolgend mehr als 50 nt zu prozessieren, wodurch Transkriptionsprodukte von über 70 nt erhalten werden konnten.
