5 Material
5.7 Puffer und Lösungen
Bezeichnung Zusammensetzung 1x Agarose-Ladepuffer 0,025% (w/v) Bromphenolblau
0,025% (w/v) Xylencyanol
60% Glycerin
60 mM EDTA
1x Agarose-Färbelösung Ethidium bromide 0,5 μg/ml in 0,5x TBE bzw. 1x TAE
1x Coomassie-Färbelösung 50 ml Essigsäure 125 ml Ethanol
375 mg Coomassie Roti Blue 300 ml Wasser
1x Coomassie-Entfärbelösung 10% Essigsäure 30% (v/v) Ethanol
2x Dpo4-Lagerpuffer 100 mM Tris-Acetat (pH 7,5) 100 mM Na-Acetat
2 mM DTT 1 mM EDTA
_____________________________________________________________________
1x Dpo4-Reaktionspuffer 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) 20 mM KCl
10 mM MgCl2
2 mM DTT (2 mM)
0,01% (w/v)
10% (v/v) Glycerin
1x Gelfiltrationspuffer 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) 100 mM NaCl
0,2% (v/v) Nonidet P-40 1 mM DTT
10% Glycerin
1x PAGE-Ladepuffer und Stopplösung 20 mM EDTA
80% (v/v) Formamid
0,025% (w/v) Bromophenolblau 0,025% (w/v) Xylencyanol
1x PAGE-Laufpuffer 1x TBE
PAGE Lösung 1 8,3 M Harnstoff in 10x TBE
108
PAGE Lösung 2 25% Acrylamidlösung in
8,3 M Harnstoff
2% N,N´-Methylenbisacrylamid
0,08% (w/v) APS
0,04% (v/v) TEMED
PAGE Lösung 3 8,3 M Harnstoff
5x SDS-PAGE-Ladepuffer 1 M Tris-HCl (pH 6,8) 0,5 M EDTA (pH 8,0)
50% Glycerin
0,05% (w/v) Bromphenolblau
1% (v/v) ß-Mercaptoethanol 10x SDS-PAGE-Laufpuffer 250 mM Tris-HCl (pH 8,9)
2 M Glycin
1% (w/v) SDS
SDS-PAGE Sammelgel (4 %) 250 mM Tris-HCl (pH 6,8)
0,05% (w/v) SDS
4% Acrylamid/Bisacrylamid (30%)
Verhältnis 37,5:1
0,05% (w/v) APS
0,25% (v/v) TEMED
SDS-PAGE Trenngel (12 %) 370 mM Tris-HCl (pH 8,8) 0,1% (w/v) SDS
12% Acrylamid/Bisacrylamid (30%)
Verhältnis 37,5:1
0,1% (w/v) APS
0,1% (v/v) TEMED 1x Reaktionspuffer error-prone PCR 10 mM Tris-HCl (pH 8,3)
50 mM KCl 7 mM MgCl2
1x Ribozym-Reaktionspuffer 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)
_____________________________________________________________________
109
1x Stopplösung mit SYBRGreen I 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM EDTA
4x SYBRGreen I
1x TAE-Puffer 40 mM Tris (pH 8,5)
1 mM EDTA 40 mM Essigäure
0,5x TBE-Puffer 45 mM Tris-Borat
1 mM EDTA 1x Therminator Basispuffer für
Ni-IDA-Affinitätschromatographie
10 mM Tris-HCl (pH 8,1) 100 mM NaCl
0,1 % (v/v) Triton X-100 2x Therminator-Lagerpuffer 20 mM Tris-HCl (pH 7,4)
200 mM KCl 2 mM DTT 0,2 mM EDTA
1x Therminator-Lysepuffer 10 mM Tris-HCl (pH 9,55) 300 mM NaCl
0,1% (v/v) Triton X-100 1 mM PMSF
0,05% (w/v) Lysozym
1x Therminator-Reaktionspuffer 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM NH4SO4
110 5.8 Medien
Bezeichnung Zusammensetzung LB-Medium, flüssig 2% (w/v) LB-Broth
LB-Medium, fest 2% (w/v) LB-Broth
2% (w/v) Agar
SOC-Medium 2% (w/v) Trypton
0,5% (w/v) Hefeextrakt
0,05% (w/v) NaCl
10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
20 mM Glukose
nach dem Autoklavieren zugeben
5.9 Verbrauchsmaterial
384-well-Mikrotiterplatten ABgene 384-well-Mikrotiterplatten, schwarz ABgene
96-Deep-well Platten ABgene
Deckgläser für Objektträger (24 x 60 mm) Menzel-Gläser Dünnschichtchromatographieplatten Merck
Einmalküvetten Roth Einmalspritzen, steril (20 ml) Normject
_____________________________________________________________________
111
Elektroporationsküvette (1mm) Gene Pulser® Cuvette, BioRAD Falcon Tubes (15 ml, 50 ml) Roth
Glas Slides, Aminopropyl-silyliert Genetix
G25 Microspin™ GE Healthcare
Low Profile Thermo-Strips ABgene
Parafilm Parafilm
Qiagen-tip 100 Quiagen
Reaktionsgefäße PCR (200 µl) TreffLab
Petrischalen Nunclon Reaktionsgefäße (1,5 ml bzw. 2,0 ml) Eppendorf
Spritzenfilter, steril, Rotilabo® Roth Zentrifugenröhrchen (15 ml bzw. 50 ml) Peske
5.10 Geräte
Agarosegelkammern Fisher Scientific
Autoklav Systec 3150 ELV
Autoradiographiefilme Fujifilm
Elekroporator GenePulser Xcell™, BIORAD
112
Elektrophoreseapparaturen BIORAD
Flächencounter Contamat FHT111M
Fluoreszenz-Reader Polastar, BMG
Geltrockner BIORAD GenePix Personal 4100A microarray scanner Molecular Devices
Heizblock Fisher Scientific
Heizschränke Memmert Inkubationsschüttler New Brunswick Scientific
Inkubationsschüttler, Titramax 1000 Heidolph
Kühl- und Gefrierschrank (4 °C, -20 °C, -80 °C) Premium, Liebherr, Thermo Forma
Magnetrührer Heidolph, MR 3000 D
Mikropipetten Eppendorf Research
Mikrowellenofen Micromaxx UV/VIS-Spektralphotometer NanoDrop® ND-1000, PEQLAB
Nanoplotter 2.0 System ausgestattet mit GeSiM
Thermostat Unistat Tango Huber Kältemaschinenbau Humidity Control II Lucky Reptile Hobby Mist generator Hygro Plus Hobby
_____________________________________________________________________
113
PAGE-Apparatur BIORAD, Sequi Gen GT
pH-Meßgerät Seven Easy, Mettler Toledo
Phosphorimager Molecular Imager®ChemiDoc™
XRS System, BIORAD Phosphorimagerscreen BAS-Cassette 2025, Fujifilm
Photometer Bio Photometer, Eppendorf
Pipettierroboter Hamilton Robotics
Reagenzien-Dispenser Multidrop Thermo
Reinstwasseranlage Satorius Spannungsquelle Gelelektrophorese BIORAD, Power Pac 3000
Speed-Vac Concentrator 5301, Eppendorf
Sterilbank HERA safe
Thermocycler Biometra®, Biometra
Thermomixer Eppendorf
Überkopfschüttler Reax 2, Heidolph
Ultraschall Sonifier 250, Branson
Vortexer Reax Control, Heidolph
Waagen Mettler PJ3000, Mettler PG403S
Wasserbad Memmert
114 Zentrifugen
Mini Spin 5417C, 5810R, Eppendorf; Biofuge Primo R,Hereus
_____________________________________________________________________
115
6 Methoden
Die Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide können dem Anhang (siehe 7.1 bis 7.3) entnommen werden.
6.1 Enzymatische Reaktionen
6.1.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Amplifikation von DNA-Sequenzen erfolgte standardmäßig mittels PCR unter Verwendung der Phusion® High-fidelity DNA-Polymerase.
Tabelle 7: Ansatz Standard-PCR
Reagenz Menge / Endkonzentration
HF-Reaktionspuffer gemäß Hersteller 1x
dNTPs 200 µM
DNA-Templat variabel*
Primer variabel*
Phusion® High-fidelity DNA-Polymerase 1 U 50 µl Reaktionsvolumen
*Primer- und Templatkonzentrationen können den Abschnitten 6.6 bis 6.8 entnommen werden.
Die Reaktion wurde mit dem folgenden Temperaturprofil durchgeführt
116 Tabelle 8: Temperaturprofil Standard-PCR
Temperatur Zeit
Heizdeckel 99-110 °C
Initiale Denaturierung 98 °C 3 min
Denaturierung 98 °C 10 s
Hybridisierung variabel* 30 s
Elongation 72 °C 15 s bis 30 s/kb
Finale Elongation 72 °C 10 min
30 Zyklen
*Hybridisierungstemperaturen wurden den Schmelztemperaturen der verwendeten Primer angepasst. Diese wurden online mit dem Oligonucleotide Properties Calculator202 kalkuliert.
Die Reaktionsprodukte wurden anschließend mittels Agarosegelelektrophorese (siehe 6.2.1) aufgetrennt und visualisiert. Zur weiteren Verwendung wurden die PCR-Produkte mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und anschließend aus dem Gel isoliert (siehe 6.2.2).
6.1.2 Fehleranfällige PCR (error-prone PCR)
Die error-prone PCR (epPCR) dient der zufälligen Randomisierung von Gensequenzen. Durch die Zugabe von Mn2+ im Reaktionsmix, wird die Fehleranfälligkeit der verwendeten Taq DNA-Polymerase erhöht.128, 129
_____________________________________________________________________
117 Tabelle 9: Ansatz error-prone PCR
Reagenz Menge / Endkonzentration
Reaktionspuffer error-prone PCR 1x
dATP 200 µM
dGTP 200 µM
dCTP 1 mM
dTTP 1 mM
MnCl2 0,15 mM bzw. 0,3 mM
DNA-Templat pGA4-Therminato WTr 3 fmol
p-Therminator-BamHI-Thromb—for 200 nM
p-Therminator-SalI-rev 200 nM
Taq DNA-Polymerase 2,5 U
50 µl Reaktionsvolumen
Die Reaktion wurde mit dem folgenden Temperaturprofil durchgeführt.
Tabelle 10: Temperaturprofil error-prone PCR
Temperatur Zeit
Die Reaktionsprodukte wurden anschließend mittels Agarosegelelektrophorese (siehe 6.2.1) aufgetrennt und visualisiert. Zur weiteren Verwendung wurden die PCR-Produkte mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und anschließend aus dem Gel isoliert (siehe 6.2.2).
118
6.1.3 PCR zur Sättigungsmutagenese von Gensequenzen
Für die Sättigungsmutagenese an einer definierten Position im Templat wurden NNK-randomisierte Primer (siehe 7.1) verwendet. Die Randomisierung erfolgte über eine 2-stufige PCR-Methode. Die erste PCR diente der Herstellung von randomisierten Megaprimern mit einer Länge von 1140 bp, welche nach gelelektrophoretischer Reinigung in einer zweiten PCR als Primer zur Amplifikation des gesamten Zielgens eingesetzt wurden.
Tabelle 11: PCR-Ansatz zur Herstellung randomisierter Megaprimer (PCR 1)
Reagenz Menge / Endkonzentration
HF-Reaktionspuffer gemäß Hersteller 1x
dNTPs 200 µM
DNA-Templat pGDR11-Therminator WT 2 fmol
P-Therm-L408NNK-for 250 nM
p-Therminator-SalI-rev 250 nM
Phusion® High-fidelity DNA-Polymerase 1 U 50 µl Reaktionsvolumen
Die Reaktion wurde mit dem folgenden Temperaturprofil durchgeführt.
Tabelle 12: Temperaturprofil zur Herstellung randomisierter Megaprimer (PCR 1)
Temperatur Zeit
Die Reaktionsprodukte wurden anschließend mittels Agarosegelelektrophorese (siehe 6.2.1) aufgetrennt und visualisiert. Zur weiteren Verwendung wurden die
PCR-_____________________________________________________________________
119
Produkte mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und anschließend aus dem Gel isoliert (siehe6.2.2).
Tabelle 13: PCR-Ansatz zur Amplifikation des gesamten Zielgens (PCR 2)
HF-Reaktionspuffer gemäß Hersteller 1x
dNTPs 200 µM
DNA-Templat pGDR11-Therminator WT 2 fmol
p-Therminator-BamHI-Thromb—for 100 nM
Megaprimer aus PCR1 100 nM
Phusion® High-fidelity DNA-Polymerase 0,4 U*
20 µl Reaktionsvolumen
*Zugabe bei 98 °C (Hot start)
Die Reaktion wurde mit dem folgenden Temperaturprofil durchgeführt.
Tabelle 14: Temperaturprofil zur Amplifikation des gesamten Zielgens (PCR 2)
Temperatur Zeit
Heizdeckel 99-110 °C
Initiale Denaturierung 98 °C 2 min
Denaturierung 98 °C 10 s
Hybridisierung 60 °C 90 s
Elongation 72 °C 50 s
Finale Elongation 72 °C 5 min
30 Zyklen
Die Reaktionsprodukte wurden anschließend mittels Agarosegelelektrophorese (siehe 6.2.1) aufgetrennt und visualisiert. Zur weiteren Verwendung wurden die PCR-Produkte mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und anschließend aus dem Gel isoliert (siehe 6.2.2).
120
6.1.4 Ortsgerichtete Mutagenese (site directed mutagenesis)
Der gerichtete Austausch von Aminosäuren erfolgte mittels ortsgerichteter Mutagenese (site directed mutagenesis) und wurde mit geringfügigen Änderungen gemäß dem Standardprotokoll des QuickChange® Site-Directed Mutagenesis Kit der Firma Stratagene durchgeführt. Abweichend davon wurde 0,75 U Phusion® High-fidelity DNA-Polymerase in einem Reaktionsvolumen von 20 µl eingesetzt. Die Reaktion wurde entsprechend dem Temperaturprofil für Standard-PCR (siehe 6.1.1) mit einer Elongationszeit von 30 s/kb durchgeführt.
6.1.5 Kolonie-PCR (colony PCR)
Die Kolonie-PCR wurde zum Nachweis von rekombinanten Plasmiden in Bakterienklonen verwendet. Hierfür wurden einzelne Klone mit einer Pipettenspitze in 10 µl bidest. H2O überführt und davon je 1 µl als Templat in der Kolonie-PCR verwendet.
Tabelle 15: Ansatz Kolonie-PCR
Reagenz Menge / Endkonzentration
Reaktionspuffer gemäß Hersteller 1x
dNTPs 200 µM
DNA-Templat (siehe oben) 1 µl
p-Therminator-BamHI-Thromb—for 200 nM
p-Therminator-SalI-rev 200 nM
Taq DNA-Polymerase* 18 nM
50 µl Reaktionsvolumen
*freundlicherweise von Dr. C. Glöckner zur Verfügung gestellt
Die Reaktion wurde mit dem folgenden Temperaturprofil durchgeführt.
_____________________________________________________________________
121 Tabelle 16: Temperaturprofil Kolonie-PCR
Temperatur Zeit
Heizdeckel 99-110 °C
Initiale Denaturierung 95 °C 5 min
Denaturierung 95 °C 1 min
Hybridisierung 72 °C 1 min
Elongation 72 °C 1 min/kb
Finale Elongation 72 °C 5 min
30 Zyklen
Die Reaktionsprodukte wurden anschließend mittels Agarosegelelektrophorese (siehe 6.2.1) aufgetrennt und visualisiert. Positive Kolonien wurden in Flüssigkultur überführt und bei 37 °C über Nacht inkubiert. Anschließend wurde eine Überprüfung der Zielsequenzen durch Sequenzierung durchgeführt (siehe 6.1.10).
6.1.6 Restriktionsverdau doppelsträngiger DNA (dsDNA)
Um kohäsive DNA-Enden für die anschließende Herstellung rekombinanter Plasmide zu erhalten, wurde die dsDNA mit zwei nicht isoschizomeren Enzymen verdaut. Die Reaktionen erfolgten für 3 Stunden bei Temperaturen entsprechend den Angaben des Herstellers. Die Bedingungen für die darauf folgende Hitzeinaktivierung der Enzyme wurden ebenfalls entsprechend den Herstellerangaben gewählt. Bei Verwendung des nicht vollständig Hitze inaktivierbaren Restriktionsenzyms BamHI wurde das Enzym mit Hilfe des MinElute™ Reaction Cleanup Kit (Qiagen) entfernt. Im Falle von Plasmid-DNA erfolgte im Anschluss an den Hitzeinaktivierungsschritt eine Dephosphorylierung gemäß 6.1.7. Zur weiteren Verwendung wurden die Restriktionsprodukte mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und anschließend aus dem Gel isoliert (siehe 6.2.1und 6.2.2).
122 Tabelle 17: Restriktionsverdau von dsDNA
Reagenz Menge / Endkonzentration
Reaktionspuffer gemäß Hersteller 1x
BSA 1x*
dsDNA 0,5 µg bis 2 µg
Enzym variabel**
50 µl Reaktionsvolumen
* gemäß Herstellerangaben falls erforderlich
**berechnet entsprechend der Unit-Definition des Herstellers
Zur Herstellung rekombinanter pGDR11-Plasmide, welche die Gensequenz der Therminator DNA-Polymerase enthielten, wurden die Restriktionsenzyme BamHI sowie SalI in dem selben Reaktionsansatz mit NEB Puffer 3 verwendet.
6.1.7 Dephosphorylierung von dsDNA
Um die Religation eines geschnittenen Vektors zu verhindern, wurde die Phosphatgruppe am 5´-Ende des Vektors mit Hilfe der Antarctic Phosphatase entfernt. Die Reaktion erfolgte im Anschluss an den Restriktionsverdau für 1 Stunde bei 37 °C.
Tabelle 18: Dephosphorylierung von dsDNA
Reagenz Menge / Endkonzentration
Reaktionspuffer gemäß Hersteller 1x
dsDNA 50 µl Restriktionsverdau
Antarctic Phosphatase (5 U/µl) 1 µl
60 µl Reaktionsvolumen
_____________________________________________________________________
123 6.1.8 Ligation
Zur Ligation von Vektor- und Insert-DNA wurden 35 ng Vektor-DNA mit einem 3fachen bis 5fachen molaren Überschuss der Insert-DNA mit Ligase inkubiert. Die Reaktion erfolgte für 16 Stunden bei 16 °C im Thermocycler. Zur Überprüfung der Religation des Vektors wurde eine Kontrolle ohne Zugabe der Insert-DNA mitgeführt. Die Reinigung des Ligationsansatzes erfolgte mit dem MinElute™
Reaction Cleanup Kit (Qiagen). Die ligierte DNA wurde bis zur anschließenden Elektroporation von E. coli Bakterien (siehe 6.3.2) bei -20 °C gelagert.
Tabelle 19: Ligation
Reagenz Menge / Endkonzentration
Reaktionspuffer gemäß Hersteller 1x
Vektor-DNA 35 ng
Insert-DNA 3facher bis 5facher molarer Überschuss
T4 DNA Ligase 1 Weiss U
20 µl Reaktionsvolumen
6.1.9 5´-Phosphorylierung mit [- 32P]-ATP
Zur radioaktiven Markierung von DNA- bzw. RNA-Primern wurden die Oligonukleotide unter Verwendung der T4-Polynukleotidkinase und [- 32P]-ATP für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte bei Reaktionen mit DNA-Primern durch Hitzebehandlung für 2 min bei 95 °C. Bei Reaktionen zur Markierung von RNA-Primern wurde eine Phenol-Chloroform-Extraktion (1 Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol im Verhältnis 25:24:1) nach Standardprotokoll durchgeführt. Anschließend wurden die erhaltenen DNA- bzw.
RNA-Primer durch Gelfiltration mittels G25 Microspin™ weiter gereinigt. Um eine Endkonzentration von 3 µM zu erhalten, wurden 20 µl nicht markierter Primer (10 µM) zugegeben.
124 Tabelle 20: 5´-Phosphorylierung mit -32P]-ATP
Reagenz Menge / Endkonzentration
Reaktionspuffer A gemäß Hersteller 1x
DNA/RNA-Primer 400 nM
-32P]-ATP 20 µCi
T4-Polynukleotidkinase 20 U
50 µl Reaktionsvolumen
6.1.10 Sequenzierung von dsDNA
Sequenzierungen wurden von der Firma GATC Biotech AG (Konstanz) durchgeführt.
Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte gemäß 6.2.6.
6.2 Auftrennung, Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren
6.2.1 Auftrennung von dsDNA durch Agarosegelelektrophorese
Die Auftrennung von dsDNA durch Agarosegelelektrophorese erfolgte entsprechend Standardprotokollen. Als Längenmarker diente der GeneRuler DNA Ladder Mix bzw. Gene Ruler 1 kp DNA ladder (Fermentas). Abhängig von der Fragmentlänge wurden 0,8 %ige bis 2,5 %ige Agarosegele in 0,5x TBE-Puffer hergestellt. Die Auftrennung erfolgte bei 100 V bis 150 V. Nach Färbung des Gels für 20 min in ca. 0,01 % Ethidiumbromid-Lösung in 0,5x TBE-Puffer wurde dieses 10 min in 0,5x TBE-Puffer entfärbt und die Banden mit dem Molecular Imager®ChemiDoc™XRS (Bio-Rad) visualisiert.
Zur Isolierung der DNA aus dem Agarosegel wurde dieselbe Prozedur mit 1x TAE-Puffer durchgeführt und die entsprechende Bande aus dem Gel isoliert (siehe 6.2.2).
_____________________________________________________________________
125 6.2.2 Isolierung von dsDNA aus Agarosegelen
Zur Isolierung von dsDNA wurden die DNA-Fragmente mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt (siehe 6.2.1) und anschließend das Fragment der gewünschten Größe mit einem Skalpell bei minimaler Expositionszeit unter UV-Licht aus dem Gel geschnitten. Die DNA-Isolierung wurde entsprechend Herstellerangaben mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) bzw. dem peqGOLD Gel Extraction Kit (PEQLAB) durchgeführt.
6.2.3 Auftrennung von Nukleinsäuren durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese Die Auftrennung von DNA-und RNA-Oligonukleotiden erfolgte durch denaturierende Polyacrylamid-Gelektrophorese (PAGE) entsprechend Standardprotokollen. Als Laufpuffer diente 1x TBE-Puffer. Die Farbstoffe Bromphenolblau sowie Xylencyanol wurden als Längenmarker verwendet.
Präparative Gele waren 1,5 mm, analytische 0,4 mm dick.
Gele zur Analyse wurden abhängig von der Länge der Oligonukleotide mit Konzentrationen von 6 % bis 12 % Polyacrylamid durch Mischen der PAGE-Lösungen 1 bis 3 hergestellt (siehe 5.7). Es wurde je 1,5 µl bis 2 µl Probe nach Hitzedenaturierung für 5 min bei 95 °C aufgetragen. Die Trennung erfolgte bei einer max. Leistung von 100 W und einer max. Temperatur von 50 °C. Im Anschluss daran wurden die Gele auf Whatmanpapier übertragen, 1 Stunde bei 80 °C unter Vakuum getrocknet und über Nacht auf einem Phosphorimagerscreen exponiert. Die Visualisierung erfolgte über Phosphoimaging (Molecular Imager® FX, Bio-Rad).
Präparative Gele zur Reinigung von Oligonukleotiden enthielten eine Konzentration von 12 % Polyacrylamid (siehe 5.7). Die DNA wurde in einem angemessenen Volumen PAGE-Ladepuffer aufgenommen und in Geltaschen überführt. Nach erfolgter Auftrennung wurde die DNA aus dem Gel isoliert (siehe 6.2.4).
126 6.2.4 Isolierung von ssDNA aus PAGE-Gelen
Die Reinigung einzelsträngiger DNA (ssDNA) erfolgte über Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Nach Durchführung einer denaturierenden Polyacrylamid-Gelektrophorese unter präparativen Bedingungen (siehe 6.2.3) wurde das Gel auf eine Dünnschichtchromatographieplatte überführt und die entsprechende Bande unter UV-Licht (254 nm) aus dem Gel geschnitten. Anschließend erfolge eine mechanische Zerkleinerung der erhaltenen Gelstücke durch Passieren einer 10 ml Spritze. Die DNA wurde in 2 ml Eppendorf-Gefäßen über Nacht bei 55 °C unter Schütteln in Wasser eluiert. Zur Entfernung der verbleibenden Gelfragmente wurde die Suspension durch eine Sprize mit Glaswolle filtriert und anschließend das Wasser durch Vakuumrotation entfernt. Die erhaltene DNA wurde durch Ethanolfällung entsalzt (siehe 6.2.5).
6.2.5 Ethanolfällung
Zur Entfernung von Salzen wurde eine Ethanolfällung der DNA durchgeführt. Das aus 6.2.4 erhaltene DNA-Pellet wurde in 1 Volumen Na-Acetat (0,3 M) resuspendiert und mit 3 Volumen eiskaltem Ethanol (abs.) für 15 min bei -80 °C präzipitiert. Nach Zentrifugation bei 20000 x g bei 4 °C für 30 min wurde der Überstand verworfen, das Pellet mit eiskaltem Ethanol (70%) gewaschen und nochmals bei 20000 x g bei 4 °C für 30 min zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde mehrfach wiederholt, bis keine Salzrückstände mehr erkennbar waren. Die in dest. H2O resuspendierte DNA wurde bei -20 °C gelagert.
6.2.6 Isolierung von dsDNA aus Flüssigkulturen
Die Isolierung von dsDNA mit hohen Reinheitsanforderungen, wie beispielsweise für die nachfolgende Herstellung rekombinanter Plasmide, erfolgte aus 20 ml Flüssigkultur entsprechend den Herstellerangaben des Plasmid MIDI Kits (Qiagen) unter Einsatz von QIAGEN-tip 100.
_____________________________________________________________________
127
Plasmid-DNA mit geringeren Reinheitsanforderungen sowie für die Verwendung in Sequenzierungsreaktionen wurde mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) bzw.
dem peqGOLD Plasmid Miniprep Kit (PEQLAB) aus 5 ml Flüssigkultur (siehe 6.3.4) isoliert.
6.2.7 Quantifizierung von DNA
Für die Quantifizierung von DNA wurde die Absorption von 1 µl bis 2 µl einer Probe bei 260 nm mit dem NanoDrop® ND-1000 UV/VIS-Spektralphotometer (PEQLAB) bestimmt. Entsprechend dem Lambert-Beerschen-Gesetz besteht ein linearer Zusammenhang zwischen der Extinktion bei =260 nm und der DNA-Konzentration. Durch Verwendung des Oligonucleotide Properties Calculator202 konnte die DNA-Konzentration berechnet werden. Dieses online verfügbare Progamm legt die spezifischen Extinktionskoeffizienten der Nukleobasen A, C, G und T für die Berechnung der DNA-Konzentration zugrunde.
6.3 Mikrobiologische Methoden
6.3.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli Bakterien
Für die Herstellung elektrokompetenter E. coli Bakterien wurden 500 ml LB-Medium mit 2,5 ml Übernachtkultur (siehe 6.3.4) inokuliert. Im Falle von E. coli BL21-Rosetta(DE3)pLysS wurden dem Medium zusätzlich 34 µg/ml Chloramphenicol zugesetzt (siehe 5.6). Die Kultur wurde im Inkubationsschüttler bei 20 °C bis zu einer OD600 von 0,5 bis 0,6 inkubiert und anschließend für 15 Min bei 4 °C gekühlt. Nach Zentrifugation bei 4000 x g, 4 °C für 30 min wurde der Überstand verworfen, das Pellet in 5 ml sterilem eiskaltem Wasser resuspendiert und durch Zugabe von 500 ml sterilem eiskaltem Wasser gewaschen. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt bei 4000 x g, 4 °C für 30 min wurde erneut mit 500 ml sterilem eiskaltem Wasser gewaschen und zentrifugiert. Danach wurde das Pellet in 40 ml sterilem eiskaltem
128
Glycerin (10 %) resuspendiert, bei 4000 x g, 4 °C für 10 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das verbleibende Pellet in 5 ml sterilem eiskaltem Glycerin (10 %) resuspendiert. Die Lagerung erfolgte bei -80 °C in 100 µl Aliquots.
6.3.2 Elektroporation von E. coli Bakterien
Doppelsträngige Plasmid-DNA wurde durch Elektroporation in E. coli Bakterien eingebracht. Hierfür wurden 1 ng bis 3 ng DNA bzw. 1 µl bis 3 µl Ligationsmix (siehe 6.1.8) mit 50 µl elektrokompetenten Bakterien (siehe 6.3.1) vermischt und in vorgekühlte Elektroporationsküvetten (Elektrodenabstand 1 mm) überführt. Die Elektroporation wurde im GenePulser Xcell™ (Bio-Rad) bei 1800 V, 25 µF und 200 durchgeführt. Anschließend wurden die Bakterien in 1 ml SOC-Medium aufgenommen und für 1 Stunde unter leichtem Schütteln bei 37 °C inkubiert. Nach angemessener Verdünnung mit SOC-Medium wurden Plattenkulturen durch Ausstreichen von 50 µl bis 200 µl Bakterienkulturen angelegt (siehe 6.3.3).
6.3.3 Plattenkulturen
Die Anzucht von E. coli Bakterien erfolgte auf sterilen LB-Agarplatten unter Verwendung des entsprechenden Antibiotikums für die selektive Anzucht von Bakterien und Plasmiden mit Selektionsmarkern (siehe 5.6). Plattenkulturen wurden durch Ausstreichen von 50 µl bis 200 µl Bakterienkulturen angelegt und bei 37 °C über Nacht im Brutschrank inkubiert.
6.3.4 Flüssigkulturen
Zur Vermehrung von E. coli Bakterien in Flüssigkulturen wurde steriles LB-Medium unter Zusatz des entsprechenden Antibiotikums zur selektiven Vermehrung von Bakterien und Plasmiden mit Selektionsmarkern eingesetzt. (siehe 5.6). Zur Inokulation des Kulturmediums wurden 100 µl Glycerinkultur (siehe 6.3.5) zugegeben, bzw. mit einem sterilem Zahnstocher ein Teil einer Bakterienkolonie
_____________________________________________________________________
129
überführt. Standardmäßig wurden die Kulturen bei 37 °C über Nacht im Inkubationsschüttler inkubiert.
6.3.5 Glycerinkulturen
Um Glycerinkulturen für die Langzeitlagerung zu erhalten, wurden die E. coli Bakterien in Flüssigkultur (siehe 6.3.4) vermehrt und anschließend Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 50 % zugegeben. Die Kulturen wurden bei -80 °C gelagert.
Zur Herstellung von Glycerinkulturen aus Variantenbibliotheken wurden Teile von Einzelkolonien mit sterilen Zahnstochern in 150 µl Kulturmedium in 384-Deep-well-Platten überführt und bei 25 °C über Nacht im Inkubationsschüttler inkubiert.
Anschließend wurde Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 20 % zugegeben und die Platten für 30 min im Inkubationsschüttler geschüttelt, um eine ausreichende Durchmischung zu gewährleisten. Die Lagerung erfolgte bei -80 °C.
6.4 Proteinbiochemische Methoden
6.4.1 Expression von DNA-Polymerasen
Die Expression von Zielproteinen in E. coli Bakterien erfolgte bei 37 °C in Schüttelkulturen mit LB-Medium unter Zusatz des entsprechenden Antibiotikums (siehe 5.6). Die Promotoren der verwendeten Plasmide pGDR11 und pET22b(+) waren durch den Lac-Repressor blockiert, so dass eine Induktion der Expression mit Isopropyl--D-thiogalactosid (IPTG) erforderlich war. Abhängig vom Zielprotein betrug die Expressionszeit 2 Stunden bis 4 Stunden. Die Bakterienpellets wurden bei -20 C gelagert. Details können den Punkten 6.6.4.1, 6.7.1.1 und 6.8.2 entnommen werden.
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Variantenbibliotheken der Therminator DNA-Polymerase wurden ebenfalls in LB-Medium unter Zusatz des entsprechenden Antibiotikums (siehe 5.6) bei 37 °C exprimiert. Das Kulturvolumen betrug hierbei 1 ml. Nach Induktion der Expression mit IPTG wurden die Kulturen weitere 2 Stunden inkubiert. Die Bakterienpellets wurden bei -20 C gelagert. Details können Punkt 6.6.4.1 entnommen werden.
Die Überprüfung der Überexpression von Proteinen erfolgte mittels denaturierender SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (siehe 6.4.4). Zum Vergleich verschiedener Proben wurde eine Anpassung der Zellzahl nach Silhavy et al.203 durchgeführt.
Hierfür wurde die optische Dichte von je 1 ml Probe bestimmt und die Bakterienpellets nach Zentrifugation in dem entsprechenden Volumen 1x Ladepuffer resuspendiert (Formel 1).
Formel 1: Einstellung gleicher Zellzahl.
6.4.2 Herstellung von Bakterienlysaten
Die aus 6.4.1 erhaltenen Bakterienpellets wurden enzymatisch unter Verwendung von Lysozym lysiert. Im Falle der Dpo4 DNA-Polymerase wurden die erhaltenen Bakterienlysate zusätzlich mit Ultraschall behandelt. Nach der Bakterienlyse folgte ein Hitzedenaturierungsschritt zur Inaktivierung von E. coli Proteinen. Diese konnten zusammen mit dem Zelldebris durch Zentrifugation abgetrennt und die erhaltenen Lysate entweder direkt in enzymatischen Untersuchungen verwendet oder weiter gereinigt werden (siehe 6.4.3). Details können den Punkten 6.6.4.2, 6.7.1.2 und 6.8.2 entnommen werden.
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131 6.4.3 Reinigung von DNA-Polymerasen
Alle Zielproteine wurden mit einem 6xHistidin-Tag exprimiert, so dass die nach der Bakterienlyse erhaltenen Überstände (siehe 6.4.2) mittels Ni-IDA-Affinitätschromatographie gereinigt werden konnten. Im Falle der Dpo4 DNA-Polymerase wurde zusätzlich eine Größenausschlusschromatographie über Gelfiltration durchgeführt. Die Eluate, in denen die entsprechende DNA-Polymerase enthalten war, wurden anschließend durch Zentrifugal-Ultrafiltration konzentriert und im entsprechenden Lagerpuffer bei -20 °C gelagert. Die Bestimmung der Proteinkonzentrationen erfolgte durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (siehe 6.4.4). Details können den Punkten 6.6.4.3, 6.7.1.3 und 6.8.2 entnommen werden.
6.4.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Trennung von Proteinen mittels denaturierender SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) erfolgte gemäß Standardprotokoll. Es wurde ein Sammelgel (4 %) sowie ein Trenngel (12 %) verwendet. Die zu trennenden Proben wurden vorab für 5 min bei 95 °C in SDS-PAGE-Ladepuffer denaturiert und anschließend abhängig von der Größe der Geltaschen je 5 µl bis 15 µl Probe aufgetragen. Als Längenmarker wurde PageRuler Unstained Protein Ladder (Fermentas) verwendet. Als Laufpuffer diente SDS-PAGE-Laufpuffer. Die Trennung erfolgte bei konstant 20 mA bis 35 mA. Das Gel wurde für mehrere Stunden in Färbelösung gefärbt und anschließend ca. 1 Stunde in Coomassie-Entfärbelösung entfärbt. Die Zusammensetzung der verwendeten Puffer und
Die Trennung von Proteinen mittels denaturierender SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) erfolgte gemäß Standardprotokoll. Es wurde ein Sammelgel (4 %) sowie ein Trenngel (12 %) verwendet. Die zu trennenden Proben wurden vorab für 5 min bei 95 °C in SDS-PAGE-Ladepuffer denaturiert und anschließend abhängig von der Größe der Geltaschen je 5 µl bis 15 µl Probe aufgetragen. Als Längenmarker wurde PageRuler Unstained Protein Ladder (Fermentas) verwendet. Als Laufpuffer diente SDS-PAGE-Laufpuffer. Die Trennung erfolgte bei konstant 20 mA bis 35 mA. Das Gel wurde für mehrere Stunden in Färbelösung gefärbt und anschließend ca. 1 Stunde in Coomassie-Entfärbelösung entfärbt. Die Zusammensetzung der verwendeten Puffer und