DNA-Polymerasen erfüllen einerseits zentrale Aufgaben bei der Replikation, Reparatur und Rekombination von DNA7, 9 und sind somit interessant für grundlegende Forschungen bezüglich der Genauigkeit oder dem Verhalten bei auftretenden DNA-Läsionen, andererseits werden DNA-Polymerasen bereits für verschiedene biotechnologische Zwecke eingesetzt.86, 116 Eine Voraussetzung für neue Anwendungen ist oft die Erweiterung des Substratspektrums dieser sehr substratspezifischen Enzyme.
Im ersten Teil dieser Arbeit sollte das Substratspektrum der Therminator DNA-Polymerase (9°N A485L exo-) hin zu einer erhöhten Akzeptanz von Ribonukleotiden sowie von Zucker- bzw. Basen-modifizierten Nukleotiden erweitert werden. Durch die Generierung einer DNA-Polymerase, welche effizient Ribonukleotide als Substrate verwerten kann, könnte eine Möglichkeit zur promoter-unabhängigen Synthese von RNA geschaffen werden. Dies hätte den Vorteil, dass die Sequenz am 5´-Ende des erhaltenen Transkriptes frei wählbar und nicht mehr auf purinreiche Sequenzen beschränkt wäre, wie dies bei der Verwendung von RNA-Polymerasen der Fall ist. Zum Erhalt einer solchen Therminator-Variante wurden Methoden der gerichteten Evolution eingesetzt. Zuerst wurde eine mittels epPCR zufällig randomisierte Variantenbibliothek nach DNA-Polymerasen durchmustert, die eine erhöhte Akzeptanz von Ribonukleotiden aufwiesen. Mit dem Oligonucleotide addressed enzyme assay (OAEA) konnten Varianten mit einer erhöhten RNA-Aktivität über chip-basierte Primerverlängerungsreaktionen identifiziert werden.
Interessanterweise zeigten Sequenzierungsergebnisse der drei aktivsten Varianten denselben Aminosäureaustausch L408Q. Die Variante, welche die längsten RNA-Transkripte synthetisieren konnte, enthielt keine weiteren Mutationen und wurde als Ausgangspunkt für eine weitere Mutagenese gewählt.
94
Zur Untersuchung des Einflusses weiterer Substitutionen an Position 408 auf die RNA-Aktivität, wurde eine Sättigungsmutagenese an dieser Position durchgeführt.
Die Durchmusterung erfolgte nun mit einem fluoreszenzbasierten Durchmusterungsansatz nach Summerer und Marx.144 Zahlreiche Varianten aus dieser zweiten Enzymbibliothek zeigten zwar eine deutlich erhöhte RNA-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp, allerdings konnte keine Verbesserung gegenüber der Variante L408Q festgestellt werden. Sequenzierungen zeigten, dass bei 90 % der sequenzierten Varianten eine aromatische Aminosäure an Position 408 zu finden war.
Eine nähere Charakterisierung der Eigenschaften wurde mit der Variante L408Q aus der ersten Variantenbibliothek unternommen. In steady state kinetischen Untersuchungen zeigte sich eine 750fach höhere Effizienz bei der Inkorporation von rCMP im Vergleich zum parentalen Enzym. Trotz einer etwas geringeren Diskriminierung (13fach) zwischen kanonischem und nicht-kanonischem Einbau von dCMP, wurde rCMP gegenüber dem kanonischen Templat (dG) mit einer 840fach höheren Effizienz umgesetzt als im fehlgepaarten Fall (dA).
Ferner wurde die promoter-unabhängige Transkription von DNA zur Herstellung einer tRNA, welche aufgrund der Basensequenz ein schwieriges Templat für eine standardmäßig eingesetzte RNA-Polymerase darstellt, getestet. Bei Verwendung der L408Q Variante konnte im Gegensatz zur Wildtyp DNA-Polymerase ein 76 nt langes tRNA-Transkript erhalten werden. Auch die Synthese funktionaler Hammerhead-Ribozyme war mit dieser Variante möglich. Bei Verwendung des Wildtyps konnten keine funktionalen Ribozyme detektiert werden.
Desweiteren war die Variante L408Q in der Lage sowohl Zucker (2´-OH)-modifizierte Nukleotide als auch Basen (C5)-modifzierte Nukleotide zu prozessieren. Vor allem die Akzeptanz der C5-modifzierten Nukleotide konnte im Vergleich zur Therminator Wildtyp DNA-Polymerase deutlich verbessert werden.
Auch im Vergleich mit kommerziell erhältlichen Varianten der Therminator
DNA-_____________________________________________________________________
95
Polymerase zeigte die L408Q Variante die höchste Akzeptanz für diese C5-modifizierten Nukleotide.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss elektrostatischer Interaktionen im aktiven Zentrum der Dpo4 TLS-DNA-Polymerase beim Überlesen einer abasischen Stelle untersucht werden. Das aktive Zentrum dieses Enzyms ist geprägt von positiven Ladungen erzeugt durch kationische Aminosäurereste.
Aufgrund von Erkenntnissen aus früheren Arbeiten am Lehrstuhl wurde ein Zusammenhang zwischen kationischen Aminosäureseitenketten im aktiven Zentrum und der Fähigkeit zum Überlesen abasischer Stellen formuliert.134, 135, 189, 190
Durch Kristallstrukturanalysen wurde eine für den Bypass potentiell wichtige kationische Aminosäure Lys152 ausgewählt. Aufgrund der räumlichen Nähe zum DNA-Rückgrat und einer für die katalytische Aktivität essentiellen Aminosäure (Glu106)83 wurden Interaktionen von Lys152 mit diesen beiden vermutet. Um mögliche elektrostatische Interaktionen zu unterbinden, wurde Lys152 durch ortsgerichtete Mutagenese mit Methionin substituiert. Primerverlängerungsreaktionen unter Verwendung des Dpo4 Wildtyps und der Variante K152M sowie die Bestimmung der spezifischen Aktivität beim Bypass einer abasischen Stelle zeigten deutliche Unterschiede zwischen den beiden DNA-Polymerasen. Bei Verwendung eines ungeschädigten Templates zeigte die Variante eine spezifische Aktivität von 72% des Wildtyps, während mit einer abasischen Stelle im Templat lediglich noch 20% der Aktiviät der Wildtyp DNA-Polymerase vorhanden waren. Somit konnte gezeigt werden, dass Lys152 eine wichtige Rolle beim Bypass einer abasischen Stelle einnimmt. Hierfür sind vermutlich elektrostatische Interaktionen mit der kleinen Furche des Primer/Templat-Komplexes sowie der katalytischen Aminosäure Glu106 verantwortlich.
96
Im dritten Teil der Arbeit sollte überprüft werden, ob sich der für die KlenTaq DNA-Polymerase (A-Familie) formulierte amino acid templating Mechanismus82 auf die 9°N DNA-Polymerase aus Thermococcus species (B-Familie) übertragen lässt. Bei diesem Mechanismus imitiert der aromatische Ring des Tyr671 (KlenTaq) eine Pyrimidinbase und führt zur bevorzugten Inkorporation von Purinen gegenüber einer abasischen Stelle.82 Das hochkonservierte Tyr671 liegt im Motiv B der KlenTaq DNA-Polymerase. Anhand von Sequenzvergleichen des Motiv B aus verschiedenen DNA-Polymerasen der A- und B-Familie, wurde ein Tyrosin (Tyr494) in der 9°N DNA-Polymerase ermittelt, welches möglicherweise die analoge Funktion zu Tyr671 übernimmt. Desweiteren wurde anhand von Kristallstrukturanalysen ein aromatisches Cluster mit zahlreichen aromatischen Aminosäuren identifiziert, welches an das Motiv B grenzt. Durch ortsgerichtete Mutagenese wurden die Aminosäuren Phe493, Tyr494, Tyr496, Tyr497 und Tyr499 jeweils durch Tryptophan bzw. Alanin ersetzt und der Einfluss auf die Nukleotidauswahl an einer abasischen Stelle überprüft.
Analog wie bei der KlenTaq DNA-Polymerase sollte durch die Substitution eines pyrimidin-ähnlichen Tyrosins durch ein purin-ähnliches Tryptophan die bevorzugte Inkorporation von Pyrimidinen gegenüber der abasischen Stelle erreicht werden.
Durch die Substitution mit Alanin wurden die Auswirkungen aufgrund des Verlusts der aromatischen Seitenkette untersucht.
Anhand der erhaltenen Ergebnisse konnte der amino acid templating Mechanismus82 der KlenTaq DNA-Polymerase nicht in der 9°N DNA-Polymerase nachgewiesen werden. Möglicherweise ist hierfür eine Aminosäureseitenkette verantwortlich, die in dieser Arbeit nicht untersucht wurde. Die hergestellten Alanin bzw. Tryptophan-Varianten zeigten größtenteils ein ähnliches Verhalten bei der Nukleotidauswahl wie die Wildtyp DNA-Polymerase. Es wurde bevorzugt dAMP und dGMP gegenüber einer abasischen Stelle inkorporiert. Allerdings zeigte die Substitution von Tyr496 durch Alanin sowohl einen Einfluss auf die Selektivität bei der Auswahl des Nukleotides als auch auf die Aktivität beim Bypass der Läsion. Im Gegensatz zum Wildtyp wurden durch diese Variante alle vier dNTPs gegenüber einer abasischen
_____________________________________________________________________
97
Stelle umgesetzt. Darüber hinaus war ein effizienter Bypass der Läsion möglich.
Zusätzlich zeigte die Variante Y496A eine erhöhte Terminale Desoxyribonucleotidyl-Transferase (TdT) -ähnliche Aktivität.
Ein vielversprechender Ansatz zur weiteren Optimierung der promoter-unabhängigen Transkription durch die L408Q Variante der Therminator DNA-Polymerase, wäre die Herstellung eines Fusionsproteins mit einem DNA-Bindeprotein zur potentiellen Erhöhung der Prozessivität. Ein möglicher Kandidat hierfür wäre das Protein Sac7d aus Sulfolobus acidocaldarius.200 Bisher ist noch nicht bekannt, ob Sac7d in der Lage ist DNA/RNA-Duplexe zu binden. Das hierzu homologe Protein Sso7d aus Sulfolobus solfataricus wurde erfolgreich zur Erhöhung der Prozessivität von DNA-Polymerasen genutzt.201
Auch die enzymatische Synthese von 2´-OH-modifizierten RNA-Oligonukleotiden, durch die Verwendung von Nukleotiden mit Modifikationen, wie die hier verwendeten 2´-NH2-, 2´-F- oder 2´-O-Methyl-Modifikationen, könnten untersucht werden. Außerdem könnte die Fähigkeit der Variante L408Q bezüglich der Akzeptanz weiterer modifizierter Nukleotide wie 2´-O,4´-C-verknüpfte LNA (locked nucleic acid)- Nukleotide103, 104 überprüft werden. Die in vitro Selektion von LNA-modifizierten Aptameren mittels SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) scheiterte bisher aufgrund fehlender DNA-Polymerasen, die hierfür geeignet sind. Es sind DNA-Polymerasen erforderlich, die einerseits LNA-modifizierte DNA- oder RNA-Oligonukleotide als Templat akzeptieren.
Andererseits müssen sie aber auch Desoxyribonukleotide (DNA-Aptamere) bzw.
Ribonukleotide (RNA-Aptamere) und LNA-Nukleotide als Substrate verwerten können.105
Weitere Arbeiten zur Dpo4 DNA-Polymerase könnten die Eigenschaften beim Bypass anderer DNA-Läsionen wie cis-syn Cyclobutan-Thymin-Thymin-Dimere (CPDs) oder Cisplatin-DNA-Addukte beinhalten. Interessant wäre auch die
98
Untersuchung der Auswirkungen der Mutation K152M auf die Genauigkeit der TLS-DNA-Polymerase. Durch Übertragung der Mutation K152M in die homologe humane DNA-Polymerase könnten die Auswirkungen auf die Bypass-Aktivität von CPDs ermittelt werden. Kürzlich wurde die erste Kristallstruktur der Pol veröffentlicht,75 woraus hervorgeht, dass eine ähnlich positionierte kationische Aminosäure im aktiven Zentrum vorhanden ist.
Wichtig für die nähere Aufklärung eines Mechanismus der 9°N DNA-Polymerase im Falle einer abasischen Stelle im Templat ist der Erhalt von Kristallstrukturen des 9°N Wildtyps sowie der Variante Y496A im Komplex mit DNA. Durch kinetische Messungen könnten detaillierte Informationen zum Inkorporationsverhalten der Enzyme gegenüber einer abasischen Stelle sowie zur templat-unabhängigen Verlängerung des Primer/Templat-Komplexes gewonnen werden.
_____________________________________________________________________
99