• Keine Ergebnisse gefunden

• Replikation der DNA

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Aktie "• Replikation der DNA "

Copied!
94
0
0

Wird geladen.... (Jetzt Volltext ansehen)

Volltext

(1)

1

• Struktur und Funktion von Nukleinsäuren

• Chromosomen und Chromatin

• Replikation der DNA

• Transkription und Genregulation

• Gentechnologie

Thomas Hankeln

AG Molekulargenetik & Genomanalyse

Institut für Organismische und Molekulare Evolutionsbiologie J. J. Becherweg 30a, EG

hankeln@uni-mainz.de

WS 2018/19 Grundvorlesung Modul 8

„Allgemeine und Molekulare Genetik

(2)

2

Aktualisierte Versionen der Vorlesung als PDF...

http://molgen.biologie.uni-mainz.de

Oder im

(3)

3

Für besonders Interessierte...

Also lautet ein Beschluss, dass der Mensch was lernen muss...

(auch im Selbststudium)

Die PDFs auf Homepage/Reader enthalten bisweilen

Zusatzfolien als Erweiterung und zum tieferen Verständnis.

Aber: auch Vorlesung hat spezielles Bonusmaterial...☺

(4)

4

Struktur und Funktion von Nukleinsäuren

...von der DNA zum „Personal Genome

www.dnaftb.org Kap. 17, 19, 31, 32, 39

hankeln@uni-mainz.de

(5)

5

Zur historischen Einordnung....

(6)

6

(7)

7

•Desoxyribonukleinsäure DNA

• Ribonukleinsäure RNA

Zwei Typen...

Die Erbinformation aller Lebewesen ist die Desoxyribonukleinsäure (DNA).

(Viren können auch RNA haben)

(8)

8

Die Umsetzung der genetischen Information*

Informationsspeicher

Informationsabschrift

Genprodukt

*“the central dogma of molecular genetics“, Francis Crick 1958

(9)

9

DNA im Elektronenmikroskop

E. coli

Säuger-Chromosom

Bakteriophage

Gerüst („Scaffold“)

(10)

10

Entdeckung der DNA als „Nuklein“ in Zellkernen von weißen Blutkörperchen (1869)

Friedrich Miescher (1844-1895)

„Sofern wir annehmen wollten, dass eine einzelne Substanz auf irgendeine Art die spezifische Ursache der Befruchtung sei, so müsste man ohne Zweifel vor allem an das Nuklein denken. (1874)

(11)

11

Griffith 1928:

das Prinzip der „Transformation

Streptococcus pneumoniae

(12)

12

Avery, MacLeod & McCarty 1944

• „Verfeinerung des Griffith-Experiments durch Behandlung des virulenten Zellextrakts mit Nukleasen (DNasen

oder RNasen) bzw. Proteasen

• Ergebnis: nur Behandlung mit DNasen verhindert Transformation!

Daher ist die DNA das „transformierende Prinzip

„If the results of the present study on the chemical nature of the transforming principle are confirmed, then nucleic acids must be regarded as possessing biological specificity, the chemical basis of which is as yet undetermined

(13)

13

Hershey & Chase 1952:

„DNA ist die Erbinformation

(14)

14

Die Bausteine von DNA/RNA sind die NUKLEOTIDE

Zucker (Ribose od.

2‘Desoxyribose) Nukleobase Phosphat

N-glykosidische Bindung

(15)

15

(16)

DNA

16

RNA

Zwei Typen von Pentose-Zuckern

in Nukleinsäuren…

(17)

17

Die (häufigsten) Nukleobasen

nur in RNA!

(statt Thymin)

(18)

18

DNA versus RNA

(19)

19

Die Nukleoside

• Adenin + Zucker > Adenosin • Thymin + Zucker > Thymidin • Guanin + Zucker > Guanosin • Cytosin + Zucker > Cytidin • Uracil + Zucker > Uridin

(20)

20

Immer wichtiger:

Die „fünfte Base der DNA

5-Methylcytosin

• existiert als Modifikation in allen Lebewesen

• bei Säugetieren:

In „CpG“-Abfolge sind 60-80%

der Cytosine methyliert

• Bedeutung für Mutationsentstehung („Hotspot“),

• Genregulation und Epigenetik (5mC korreliert mit Gen-Inaktivität)

(21)

21

...und die Nr. 6!

• bereits 1952 in Bakteriophagen-DNA erstmals entdeckt

• 2009: Säugetiere haben Gene für Hydroxylasen (Tet), die aus 5mC das 5hmC herstellen

• 2011: Tet wandelt 5mC in noch 2 weitere C-Basen-Intermediate um und bewirkt wohl damit DEMETHYLIERUNG von DNA (>Genregulation)

(22)

22

Science 2011

(23)

23

Basen-Modifikationen gibt es auch in der RNA!

Wichtig beim

Thema „Translation

...und RNA bildet zudem mit sich

selbst Doppelstränge!

tRNA

Inosin = Nukleosid der Purinbase ‚Hypoxanthin I paart mit C/U/A

(24)

24

RNA kann noch mehr...

http://nobelprize.org/chemistry/articles/cech/#2

„Ribozyme “

RNA ist mehr als eine reine Abschrift:

Sie kann Information speichern, sich replizieren und sogar Enzym-Funktionen ausführen!

dnaftb Kap. 26

(25)

25

Eine RNA-Welt?

(26)

26

Die Chargaff-Regeln

Zurück zur DNA...

Die Basenzusammensetzung ist

• artspezifisch

• gleich in verschiedenen Geweben eines Individuums

• unabhängig von Faktoren wie Alter, Ernährung etc.

Mengenmäßig gilt A = T, C = G und A+G = T+C

(27)

27

Röntgen-Strukturdaten zeigten…

(28)

28

„In dem Augenblick, als ich das Bild sah, klappte mir der Unterkiefer herunter, und mein Puls flatterte. Das Schema war unvergleichlich viel einfacher als alle, die man bis dahin erhalten hatte … [Maurice Wilkins gab jedoch zu bedenken,] das eigentliche Problem

sei noch immer das Fehlen einer Strukturhypothese, die gestatte, die Basen auf regelmäßige Weise auf der Innenseite der Spirale anzuordnen. Das setzte natürlich voraus, dass

Rosy [Rosalind Franklin] recht hatte, wenn sie die Basen im Zentrum und das Skelett außen haben wollte! Obwohl Maurice mir versicherte, er sei jetzt völlig von der

Richtigkeit ihrer Behauptungen überzeugt, blieb ich skeptisch, denn Francis [Crick] und ich konnten ihren Beweis noch immer nicht recht verstehen.“

 

James Watson, The Double Helix:

(29)

29

Die Basenpaarungen in der DNA

(30)

30

The 1st Bond…

1953 Watson

& Crick

1956 Corey

& Pauling

The 3rd bond…

1953

(31)

31

DNA-Moleküle haben unterschiedliche Enden (5‘Phosphat bzw. 3‘OH) und damit eine Richtung!

Ein kurzes Stück DNA...

(Trinukleotid, Einzelstrang)

(32)

32

Die 3- 5-Phosphodiesterbindung

α β

γ Pyrophosphat (PPi)

wird frei

(33)

33

5‘ P-Ende

5‘ P-Ende 3‘ OH-Ende

3‘ OH-Ende

Die DNA-Stränge sind anti-parallel !

(34)

34

Der DNA-Doppelstrang

(35)

35

Schreiben einer DNA-Sequenz...

• immer von links (5‘ Ende) nach rechts (3‘ Ende)

• meist nur ein Strang („Watson“ oder „Crick“)

Beispiel:

5‘-GAGGGCTACTGCA-3‘ oder

5‘-TGCAGTAGCCCTC-3‘

(36)

36

Watson crick

Die Watson-Crick Doppelhelix (B-Helix)

+29.7.2004

(37)

37

• ist ein Polymer aus Desoxy-Nukleotiden, die über 3‘-5‘ Phosphodiester-Brücken verbunden sind

• besteht aus 2 Einzelsträngen, die über

Wasserstoffbrücken-Bindungen zwischen den Basen zusammengehalten werden

• Die Einzelstränge sind komplementär, antiparallel und plektonämisch verwunden (= Doppelhelix)

• trägt ihre Information in der Abfolge der Basen!

Die DNA...

(38)

38

Stapelkräfte stabilisieren die DNA

Ringsysteme mit konjugierten

Doppelbindungen haben π-Elektronen- wolken

π-Elektronen der übereinander liegenden Basen interagieren

(39)

39

DNA ist in der Umwelt stabil

DNA bindet an negativ geladene Bodenpartikel über Salzbrücken

" schützt sogar vor Abbau

durch DNasen!

„Ancient DNA“

Science und Fiction

(40)

40

(41)

41

(42)

42

B-Helix Parameter

• rechtsgewunden

• ca. 10,4 Basenpaare pro Windung

• Abstand zwischen zwei Bp beträgt 3.4 Angstrom (10-10 m)

• Dicke der Helix beträgt 2 nm (= 20 A)

zurück zum Kerngeschäft...

(43)

43

Die „Furchen der DNA bieten Proteinen Möglichkeiten zur basenspezifischen

Erkennung und Bindung

Wichtig für Thema

„Transkription“

(44)

44

(45)

45

Es gibt auch noch andere Helix-Formen!

z. B. abhängig von DNA-Sequenz, Nukleinsäuretyp und Ionen-Milieu

(46)

Ribosen passen wegen C2-O nicht in eine B-Typ Helix ! 46

A-Helix

• in ds RNA

• in DNA/RNA- Hybriden

(47)

47

A B

Charakteristika der A-Helix

• rechtsgewunden

• Basen stehen im 20°- Winkel zur Achse

• Helix ist innen „hohl“

• Helix ist „dicker“

• 11 statt 10,4 Bp pro Windung

(48)

48

Z B

Charakteristika der Z-Helix

• bei alternierenden

Purin/Pyrimidin-Folgen (z.B. GC oder AC)

• linksgewunden !!!

• ‚major groove‘ nahezu verschwunden

• Helix ist „dünner“

• 12 statt 10,4 Bp pro Windung

(49)

49

• ‚syn oder ‚anti Stellung der Basen relativ zum Zucker

• C2-endo oder C3-endo-Konfiguration des Zuckers

• ‚Propeller-Twist der Basen

Verschiedene DNA-Konformationen

sind möglich durch…

(50)

50

Syn vs. Anti

Stellung der Basen

relativ zum Zucker

(51)

51

Einfluss der Zuckerkonformation auf den Abstand der 3-5 Phosphodiester-Bindung

0,7 nm

0,5 nm

(52)

C3endo C2endo G: C2endo 52

C: C3endo Zuckerkonformation

(53)

53

Propeller-Twist zwischen Basen

(54)

54

„curved DNA

(55)

55

Änderung des Propellertwists führt zu DNA-Krümmung

z.B. bei Wiederholung von (A)n>3 im

Abstand von ca. 10 Bp

AAAgcatgacAAAA gatcctAAAAAgcttg...

Propellertwist-Änderungen wiederholen sich ca alle 10 Bp und liegen so auf der gleichen Seite der Helix. Die Summe mehrerer kleiner Winkel führt zur sichtbaren Krümmung.

(56)

56

RNA Pol II

Nukleosomen

Curved DNA: Funktionen

Bei Bakterien

vielfach bestätigt…

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6500/

(57)

57

H-DNA

• Triple-Helix!!!!

• non-Watson/Crick- Basenpaarung

(„Hoogsteen-Paarung“)

• in Bereichen mit alternierenden T/C- bzw. G/A-Abfolgen

• in vivo nachgewiesen in

Gen-Promotern; im Human- genom häufig: 1/50000 Bp

(58)

58

H-DNA

(59)

59

H-DNA: biologische Relevanz

(60)

60

Science 2003

(61)

61

(62)

62

DNA: Informationsspeicher für die Ewigkeit?

• Kodieren der Daten durch chemische DNA-Synthese

• Vermehrung (PCR!) und Lagerung der DNA

• Auslesen der Information durch DNA-Sequenzierung

Erlich et al., Science 355, 950–954 (2017) 3 March 2017

215 Peta-Byte (10 15 ) pro g DNA !!

(63)

63

Denaturierung und Renaturierung von DNA

...und was man damit anfangen kann!

zurück ins Labor...

(64)

64

Bestimmung des Schmelzpunkts der

DNA durch Denaturierung

(65)

65

• Tm = Schmelzpunkt der DNA (50% einzelsträngig)

• Tm = 69,3 + 0,41 (%GC)

• Hyperchromizität = Zunahme der Absorption von einzelsträngiger

DNA bei OD260nm

Der Schmelzpunkt der DNA

(66)

66

Der Schmelzpunkt der DNA ist mit ihrem GC-Gehalt korrreliert

• Dictyostelium 22 % GC

• S. cerevisiae 39

• Maus, Mensch 44

• E. coli 51

• Pseudomonas 68

• Herpes simplex Virus 72

Unterschiedliche Mutationsrichtungen?

Auswirkungen auf DNA-Stabilität?

(67)

67

Denaturierung und Renaturierung

von DNA

(68)

68

Hybridisierung

Technische Säulen der Molekulargenetik...

z. B: Wo liegt eine DNA-Sequenz/ein Gen auf den Chromosomen?

(69)

69

http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/49807/title/Building-Nanoscale-Structures-with-DNA/

(70)

70

Nature Sept. 2017

(71)

71

...ist abhängig von

• Temperatur (Optimum ist bei T

m

- 25°C)

• Konzentration der DNA in der Lösung

• erlaubter Zeit für die Renaturierung

Renaturierung (Hybridisierung)

von DNA

(72)

72

Welchen Einfluss hat die Konzentration der DNA in der Lösung auf die Renaturierung?

A.  Bei hoher Konzentration geht Renaturierung schneller

B.  Hohe DNA-Konzentration verlangsamt die Renaturierung

(73)

73

• Produkt aus Anfangs-DNA-Konz. ‚C

o

‘ und der Zeit ‚t ‘

• beschreibt die Renaturierungseigenschaften einer DNA:

Punkt, an dem 50% der zuvor einzelsträngigen DNA wieder doppelsträngig geworden ist

Renaturierungskinetik

:

Bestimmung des Cot 1/2-Werts einer DNA

Roy Britten

(74)

74

Der Cot

1/2

-Wert hängt

von der Komplexität des Genoms ab

passende Partner-Stränge finden sich extrem schnell

Je größer das Genom,

desto mehr DNA-Stränge:

Partnersuche verlängert!

(75)

75

Renaturierungskinetiken bei höheren Organismen

fast

slow

• mind. 2 Komponenten mit unterschiedlicher Reassoziations-

geschwindigkeit

(76)

76

Komponenten der

Genome höherer Eukaryoten

• hoch-repetitive DNA ca. 10% des Genoms; Cot1/2 = 0,001

• mittel-repetitive DNA ca. 40% des Genoms; Cot1/2 = 0,04

• ‚single copy‘ DNA ca. 50% des Genoms; Cot1/2 = 4000

scGen

scGen Genfamilie

hochrepetitive DNA (tandem)

mr mr mr mr

(77)

77

„Springende Genemachen Genome instabil!

Barbara McClintock (1902-1992)

Dnaftb Kap. 32

(78)

78

• single copy DNA

- viele Gene und Intergenregionen

• mittel-repetitive DNA (ca. 10-1000; oft verstreut im Genom) - Genfamilien (z. B. Globin/Histon/rDNA-Gene) - Transposons (= springende DNA-Abschnitte!!)

• hoch-repetitive DNA (ca. 103-106 Kopien)

- Satelliten-DNA der Centromer-Regionen (tandem) - sehr „mobile“ Transposons (stark verstreut)

Genom-Komponenten

(79)

79

Genom-

Architektur

Gene, Genfamilien, Intergenregionen und repetitive Ele- mente sind unregel- mäßig im Genom verteilt

(80)

80

2001 :„working draft“

2003: „finished sequence“ J. Craig Venter / Fa. Celera

Francis Collins /

Human Genome Project

Das Humangenom

(81)

81

Genomgrößen bei Eukaryoten

• Enzephalitozoon 3 MBp 2 000 Gene

• Saccharomyces cerevisiae 12 MBp 6 200 Gene

• Caenorhabditis elegans 97 MBp 19 000 Gene

• Drosophila melanogaster 137 MBp 14 000 Gene

• Gallus gallus 1 000 MBp 23 000 Gene

• Homo sapiens >3 000 MBp <25 000 Gene

• Arabidopsis thaliana 125 MBp 25 000 Gene

• Oryza sativa 400 MBp >50 000 Gene

• Paris japonica 149 000 MBp ?

(82)

82

Das Säugergenom

DOGS - Database Of Genome Sizes http://www.cbs.dtu.dk/databases/DOGS/

Genomgröße = C-Wert (in bp/Kbp/Mbp oder in pg)

1 pg = 0.965 x 109 bp

= 6.1 x 1011 Da = 34 cm

(83)

83

Nature Reviews Genetics 6, 699-708 (September 2005)

Fast die Hälfte des menschlichen

Genoms besteht aus Transposons

(84)

84

Viele Genfunktionen unbekannt…

Mindestens 2000 Gene sind an Erkrankungen beteiligt

(OMIM Datenbank)

(85)

85

Personal Genome

Projects

1. Okt. 2015

(86)

86

..ACGGC..

..TGCCG..

..ACTGC..

..TGACG..

Zwei beliebige Genome

unterscheiden sich im Mittel alle 1000 Bp.

Aus diesen etwa 3 Mio. Bp- Unterschieden pro Genom resultiert ein Großteil

unserer Individualität.

Auch die Reaktion auf Pharmazeutika!

Single Nucleotide

Polymorphisms (SNPs)

Pharmakogenetik > personalisierte Medizin

(87)

87

Genomprojekte bei Modell-Organismen

Fang X et al. (2014)

Blindmulle Spalax

(88)

88

Politik, Forschung und Modellorganismen

https://www.youtube.com/watch?v=Eg1vIeuQT1s

(89)

89

Das C-Wert- Paradoxon*

* Enorme Unterschiede in der Genomgröße

trotz weitgehend ähnlicher Komplexität der Organismen

(90)

90

Die Genomstruktur ist artspezifisch

Mensch

Hefe

Mais

E. coli

(91)

91

Prokaryoten-Genome

z. B. Mycoplasma genitalium: 582 970 Bp und 521 Gene

• meist ringförmig

• wenig repetitive DNA

• ‚dicht-gepackte‘ Gene, oft ca. 1 Gen/kb

(92)

92

Genomgrößen in Prokaryoten

• Eubakterien: Nasuia spec. 112 kb Mycoplasma genitalium 583 kb E. coli (K12) 4639 kb E. coli (O157:H7) 5529 kb Sorangium cellulosum 14782 kb

K12

Pathogener E. coli-Stamm

BioSicherheit!

https://gold.jgi.doe.gov/

(93)

Tot oder lebendig?

• Mimi*-Virus (befällt Amöben) 1.2 Mb DNA

1260 Gene

< 10% repetitive DNA

400 nm groß!

• Pithovirus sibericum (Bohrkern aus sibirischem Permafrost) 600 Kb DNA

470 Gene

1,5 um groß !!

* Microbe-mimicking

(94)

94

Synthetische Biologie !

Science 2010

https://www.youtube.com/watch?v=nKZ-GjSaqgo

Referenzen

ÄHNLICHE DOKUMENTE

Sie zielen oft auf das Gemein- wohl ab und richten sich gegen «korrupte» Eliten, denen man unterstellt, sich im Geheimen verschworen zu haben.. Verschwörungstheorien operie- ren

Da sie eine bestimmte Gruppe als Verschwörer identifizieren, die für alles Böse verantwortlich gemacht wird, können sich diejenigen, die an diese Verschwörungstheorien glauben,

bei Städten (Höhenburgen) oder an Flüssen (Wasserburgen). Im ebenen Gelände waren sie durch Ringstraßen und hohe Zäune umgeben. Durch einen Tunnel gelangte man über den

Die »Tigerin«, welche gleichzeitig mit der »kleinen Juniata« ausge- laufen war, passirte um 10 Uhr am Morgen des 1 3. August das Cap York, ohne sich diesem Vorgebirge jedoch nähern

7 Die Höhere Töchterschule wurde schon Anfang der 1970er Jahre in eine staatliche Mädchen- realschule unter privater Trägerschaft überführt, die schon angefangenen

Frage: Herr von Weizsäcker, Sie haben mit Blick auf die DDR immer wieder darauf gepocht, dass die Bürger Ost- deutschlands ihre eigene Deutungs- hoheit haben sollten,

Bis zu 28 ver- schiedene Erreger hat man in ihnen gefunden, wenn auch noch keine Ansteckung mit HIV oder Hepatitis durch eine Wanze nachgewiesen wurde. Anders sieht es beim

Die Erkrankung ist zwar nicht heilbar, kann jedoch durch sportliche Betätigung und Enzympräparate wie Wobenzym® plus gelindert werden.. © MUCOS Pharma GmbH