Manipulation der Selektivität von DNA-Polymerasen
- Chemisch modifizierte Substrate und optimierte Enzyme zur Analyse und Anwendung -
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
an der Universität Konstanz Naturwissenschaftliche Sektion
Fachbereich Chemie
vorgelegt von Michael Strerath aus Grevenbroich
2006
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://www.ub.uni-konstanz.de/kops/volltexte/2007/2868/
URN: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-28688
Dissertation der Universität Konstanz
Erstgutachter: Prof. Dr. A. Marx
Zweitgutachter: Prof. Dr. V. Wittmann (Prüfungsvorsitz) Drittgutachter: Prof. Dr. M. Scheffner
Tag der Prüfung 01.12.2006
Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht in:
Publikationen
ChemBioChem 2006, in Vorbereitung
M. Strerath, Dan Liu, Andreas Schnur, A. Marx, “Directed DNA polymerase evolution: Effects of mutations in Motif C on the Mismatch Extension Selectivity of a Thermus aquaticus DNA Polymerase”
Buchartikel für Methods Mol. Biol.
2006, im Druck.
M. Strerath, I. Detmer, J. Gaster, A. Marx "Modified oligonucleotides as tools for allele-specific amplification"
Angew. Chem. Int Ed.
2005, 44, 7842-9 Mini Review
M. Strerath, A. Marx, „Genotyping – From Genomic DNA to Genotype in one Tube“
ChemBioChem 2004, 5, 1585 - 1588
M. Strerath, J. Gaster, A. Marx, „Recognition of Remote Mismatches by DNA Polymerases“
ChemBioChem 2004, 5, 333 - 339
M. Strerath, J. Gaster, D. Summerer, A. Marx, „Increased Single-Nucleotide Discrimination of PCR by Primer Probes Bearing Hydrophobic 4’C-Modifications“
Buch Artikel für Bioorganic Chemistry Highlights II:
2004, WILEY-VCH
A. Marx, D. Summerer, M. Strerath, „Selectivity of DNA Replication“
Biol. Chem.
2003, 384, 1533 - 1541
B. Tews, J. Wilhelm, D. Summerer, M. Strerath, A. Marx, P. Friedhoff, A. Pingoud, M. Hahn, „Application of the C4´
Alkylated Deoxyribose Primer System (CAPS) in Allele Specific Real-Time PCR for Increased Selectivity in Discrimination of Single Nucleotide Sequence Variants“
Angew. Chem. Int. Ed.
2002, 41, 4766 - 4769
M. Strerath, A. Marx, „Tuning PCR specificity by chemically modified primer probes“
J. Biol. Chem.
2002, 277, 43593 - 43598
J. Cramer, M. Strerath, A. Marx, T. Restle, „Exploring the effects of active site constraints on HIV-1 reverse
transcriptase DNA polymerase fidelity“
J. Am. Chem. Soc.
2002, 124, 11230 - 11231
M. Strerath, J. Cramer, T. Restle, A. Marx, „Implications of Active Site Constraints on Varied DNA Polymerase Selectivity“
ChemBioChem 2002, 3, 578 - 580
M. Strerath, D. Summerer, A. Marx, „Varied DNA
polymerase - sugar interactions in the nucleotide binding pocket“
Patente
Patent International Publication Number
WO 03/072814 A2
M. Strerath, D. Summerer, J. Gaster A. Marx
„Improved method for allele-specific PCR“
1.Einleitung ...1
1.1.Der genetische Code ... 1
1.2.DNA-Polymerasen ... 2
1.2.1. DNA-Polymerasen als Wirkstoffziel: HIV-1 Reverse Transkriptase ... 3
1.2.2. Kinetik von DNA-Polymerasen... 4
1.2.3. Die Genauigkeit von DNA-Polymerasen... 6
1.2.4. 4’-C-modifizierte-Desoxyribonukleotidtriphosphate ... 6
1.2.5. Interaktionen zwischen eintretendem dNTP und dem aktiven Zentrum der DNA-Polymerase ... 7 1.2.6. Wechselwirkungen zwischen DNA-Polymerase und Primer-Templat-Komplex...155H9
9H1.3.Detektierung von Genvarianten ...156H10
10H1.3.1. Methoden zur Detektierung von Genvarianten in geschlossenen Gefäßen...157H10
11H1.3.2. Sequenzspezifische invasive Spaltung von Oligonukleotiden: Der Invader Assay ...158H11
12H1.3.3. Genotypisierung durch die 5’-3’-Exonukleaseaktivtät von DNA-Polymerasen:
Der TaqMan Assay ...159H13
13H1.3.4. Genotypisierung durch Verwendung der DNA-Polymerase-Selektivität: Allel-
Spezifische Amplifikation...160H15
14H1.3.5. Isotherme Genotypisierung durch zirkularisierte Oligonukleotidsonden: Padlock Probes und Rolling Circle Amplification (RCA)...161H18
15H2.Aufgabenstellung ...162H22
16H3.Ergebnisse und Diskussion...163H24
17H3.1.4’-C-modifizierte Thymidintriphosphatanaloga als sterische Sonden...164H24
18H3.1.1. Synthese von Oligonukleotiden ...165H24
19H3.2.Funktionale Untersuchung der wildtyp HIV-I reversen Transkriptase sowie einer auftretenden M184V Mutation mit modifizierten Nukleosidriphosphaten als sterische Sonden. ...166H26
20H3.2.1. Einfluss von modifizierten Nukleosidtriphosphaten auf HIV-1 RT und deren M184V Mutante ...167H26
21H3.2.2. Diskussion der in den Untersuchungen mit HIV-I reversen Transkriptase und ihrer M184V-Mutante erhaltenen Ergebnisse...168H29
22H3.3.Wechselwirkungen zwischen der 2’-Desoxyriboseeinheit des Templatnukleotids und KF exoP-P...169H30
23H3.3.1. Qualitative Untersuchung der Substratinteraktionen in der Nukleotidbindungstasche des Klenow Fragments ...170H30
24H3.3.2. Quantitative Analyse der Substratinteraktionen bei kanonischem Einbau gegenüber modifizierten Nukleotiden ...171H31
25H3.3.3. Qualitative Untersuchung des nichtkanonischen Nukleotideinbaus gegenüber modifizierten Nukleotiden ...172H32
26H3.3.4. Quantitative Analyse der Substratinteraktionen bei kanonischem Einbau gegenüber modifizierten Nukleotiden ...173H32
27H3.3.5. Diskussion der Ergebnisse aus den Studien zu Wechselwirkungen von KFP-P mit der 2’-Desoxyriboseeinheit des kodierenden Nukleotides ...174H33
28H3.4.Primerverlängerungsstudien mit 4’-C-modifiziertem 3’-Terminus...175H34
29H3.4.1. Effekte von 4’-C-modifiziertem 3’-Terminus auf die Primerverlängerung durch verschiedene DNA-Polymerasen ...176H34
30H3.4.2. Kinetische Untersuchung der Effekte von 4’-C-modifiziertem 3’-Terminus auf die Primerverlängerung durch Vent exoP-P-DNA-Polymerase ...177H37
31H3.4.3. Diskussion der Ergebnisse der Primerverlängerungsstudien mit 4’-C-
modifizierten Sonden und verschiedenen DNA-Polymerasen ...178H40
32H3.5.PCR basierte Detektierung von Einzelbasenvariationen mit Hilfe von 4’-C-
modifizierten Primersonden ...179H42
33H3.5.1. Allelspezifische-Detektion von Einzelbasenvariationen mit Endpunktbestimmung in der PCR ...180H42
34H3.5.2. Allelspezifische-Detektierung von Einzelbasenvariationen in der Echtzeit PCR...181H44
35H3.5.3. Allelspezifische-Echtzeit-PCR mit genomischer DNA ...182H46
36H3.5.4. Allelspezifische-Echtzeit-PCR in verschiedenen Sequenzräumen...183H47
37H3.5.5. Schmelzpunktanalyse der verschiedenen Primersonden mit terminalen Fehlpaarungen...184H48
38H3.5.6. Einfluss der Pufferbedingungen auf die Fehlpaarungs-diskriminierung ...185H49
39H3.5.7. Diskussion der Ergebnisse aus den Versuchen zur PCR basierten Detektierung von Einzelbasenmutionen...186H50
40H3.6.Einfluss von distalen Fehlpaarungen auf die Primer-verlängerung ...187H55
41H3.6.1. Einfluss von distalen Fehlpaarungen auf den Einzelnukleotideinbau...188H55
42H3.6.2. Einfluss von distalen Fehlpaarungen auf die Primerverlängerung ...189H56
43H3.6.3. Einfluss von distalen Fehlpaarungen in der allelspezifischen-PCR...190H57
44H3.6.4. Schmelzpunktanalyse der verschiedenen Primersonden mit distalen Fehlpaarungen...191H57
45H3.6.5. Diskussion der Ergebnisse aus den Untersuchungen mit distal fehlgepaarten 4’-C-modifizierten Primersonden ...192H58
46H3.7.Generierung und Durchmusterung einer Bibliothek aus Taq-DNA-Polymerase Mutanten ...193H59
47H3.7.1. Erzeugen der Primer für die Kassettenmutagenese am DNA-Synthesizer...194H59
48H3.7.2. Einführen des zufällig randomisierten Bereiches durch Whole Plasmid PCR...195H60
49H3.7.3. Einführen der randomisierten Kassette durch megaprimer PCR und klassische Klonierung...196H64
50H3.7.4. Durchmusterung der Bibliothek von Taq DNA-Polymerasevarianten nach in der PCR aktiven Varianten ...197H65
51H3.7.5. Reinigung und Anwendung von verbesserten Taq-DNA-Polymerasevarianten in der ASA...198H69
52H3.7.6. Diskussion der Ergebnisse aus den Untersuchungen zur gerichteten Evolution von Taq-DNA-Polymerasen mit verbesserten Eigenschaften in der allelspezifischen Amplifikation ...199H72
53H4.Zusammenfassung und Ausblick ...200H75
54H4.1.Modifizierte Nukleosidtriphosphate als Sonden ...201H75
55H4.2.Erhöhung der Genauigkeit der allelspezischen-Amplifikation durch Modifikationen am 3’-Primerende und der Einsatz zur Detektierung von Einzelbasenvariationen im Genom...202H76
56H4.3.Gerichtete Evolution einer Taq-DNA-Polymerase zur Anpassung an die Anforderungen der allelspezifischen PCR ...203H77
57H5.Material und Methoden ...204H78
58H5.1.Material...205H78
59H5.1.1. Chemikalien ...206H78
60H5.1.2. Nukleotide und Radiochemikalien...207H79
61H5.1.3. Standards und Kits...208H79
62H5.1.4. Enzyme und Proteine...209H80
63H5.1.5. Medien und Zellkulturpuffer ...210H81
64H5.1.6. Oligonukleotide ...211H81
65H5.1.7. Verbrauchsmaterial...212H82
66H5.1.8. Geräte ...213H83
67H5.2.Methoden ...214H84
68H5.2.1. Synthese modifizierter Oligodesoxynukleotide ...215H84
69H5.2.2. Synthese von Oligonukleotidprimern mit zufällig randomisierten Kassetten...216H85
70H5.2.3. Thermische Denaturierungsstudien mit doppelsträngiger DNA ...217H85
71H5.3.Molekularbiologische Methoden...218H86
72H5.3.1. Reinigung und Quantifizierung von DNA ...219H86
73H5.3.2. Agarose-Gelelektrophorese ...220H86
74H5.3.3. DNA Extraktion aus LMP-Agarose ...221H87
75H5.3.4. Polyacrylamidgelelektrophorese...222H87
76H5.3.5. Isolierung von DNA aus Polyacrylamidgelen...223H89
77H5.3.6. Ethanolpräzipitation ...224H89
78H5.3.7. Quantitative Nukleinsäure-Bestimmung ...225H89
79H5.3.8. Phenol-Chloroform-Extraktion...226H90
80H5.4.Enzymatische Reaktionen...227H90
81H5.4.1. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)...228H90
82H5.4.2. Primer-Verlängerungsreaktionen mit radiometrischer Produktanalyse ...229H92
83H5.4.3. 5'-Phosphorylierung mit [γP32PP] ...230H93
84H5.4.4. Restriktionsverdau doppelsträngiger DNA...231H93
85H5.4.5. Dephosphorylierung des geschnittenen Vektors ...232H94
86H5.4.6. Ligation...233H94
87H5.4.7. DNA-Sequenzierung ...234H95
88H5.4.8. Plattenkultur ...235H95
89H5.4.9. Flüssigkultur ...236H95
90H5.4.10. Glycerinkultur ...237H95
91H5.5.Plasmidisolierung ...238H96
92H5.6.Herstellung elektrokompetenter E. coli XL10 Gold ...239H96
93H5.7.Transformation von E. coli ...240H97
94H5.7.1. Elektroporation...241H97
95H5.8.Expression und Reinigung von Polymerasen ...242H97
96H5.8.1. Expression im 96 well Format...243H97
97H5.8.2. Native Lyse von Expressionskulturen...244H97
98H5.8.3. Proteinreinigung...245H98
99H5.8.4. Glycin SDS-PAGE ...246H98
100H5.8.5. Coomassie Färbung von SDS-PAGE Gelen ...247H100
101H5.8.6. Silberfärbung von SDS-PAGE Gelen ...248H100
102H5.9.Hochdurchsatzscreening...249H101
103H5.9.1. Generierung der Taq DNA-Polymerasevarianten Bibliothek ...250H101
104H5.9.2. Expression Taq DNA-Polymerasevarianten Bibliothek ...251H102
105H5.9.3. Durchmusterung Taq DNA-Polymerasevarianten Bibliothek...252H102
106H6.Abkürzungsverzeichnis ...253H103
107H7.Literaturverzeichnis ...254H106
108H8.Anhang ...255H111
109H8.1.Sequenzen der verwendeten Primer und synthetischen Template ...256H111
110H8.1.1. Farbersche Krankheit...257H111
111H8.1.2. Leiden Disease ...258H111
112H8.1.3. BRAF Mutation...259H112
113H8.1.4. DpyD Mutation ...260H112
114H8.1.5. Megaprimer PCR ...261H113
115H8.2.Vektor und Insertsequenzen ...262H113
116H8.2.1. Sequenz des zirkulären leeren Vektors ...263H113
117H8.2.2. Sequenz des geschnittenen Vektors ...264H114
118H8.2.3. Elektroferrogramme ...265H116
119H8.3.Danksagung ...266H123
120H8.4.Lebenslauf...267H124
121H8.5.Eidestattliche Erklärung ...268H125
1. Einleitung
1.1. Der genetische Code
Die uns heute bekannten Lebewesen haben sämtliche Informationen, die sie zur Entwicklung und Fortpflanzung benötigen, in Form eines Makromoleküls gespeichert, das aus Desoxyribonukleinsäuren (DNA) besteht. Dieses dem Leben zentrale Makromolekül birgt somit die Möglichkeit in sich alle verschiedenen Baupläne des Lebens zu kodieren. Die Speicherung der Erbinformation wie auch die Übersetzung und Vervielfältigung der abgelegten Informationen basiert auf einem von Watson und Crick und darauf aufbauend von Nierenberg und Khorana beschriebenen vier Buchstaben-Code. Die einzelnen Buchstaben repräsentieren verschiedene Nukleotidbausteine, die sich in ihren Nukleobasen unterscheiden und über Phosphodiesterbrücken miteinander verknüpft sind. Als Nukleobasen kommen mit Thymidin (T) und Cytidin (C) zwei Pyrimidinderivate und mit den Bausteinen Adenin (A) und Guanin (G) zwei Purinderivate in der DNA vor. Durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Nukleobasen T-A und C-G können doppelsträngige DNA-Hybride gebildet werden, wenn die DNA-Einzelstränge komplementäre Basenabfolgen aufweisen. Im Fall des T-A Basenpaares können sich zwei und zwischen C-G Basenpaaren drei Wasserstoffbrücken ausbilden.
Die Weitergabe der Erbinformationen erfolgt durch die Replikation des Genoms.
Dabei wird durch DNA-Polymerasen, ausgehend von einer kurzen, auf die genomische DNA hybridisierten DNA-Sequenz, ein Tochterstrang aufgebaut. Dies geschieht in einer templatgesteuerten Synthese, in der die DNA-Polymerase den bereits aufgebauten DNA-Strang durch zur Templatsequenz komplementäre Nukleotidbausteine verlängert. Dabei entsteht ein reverser, zum Mutterstrang komplementärer DNA-Strang. Die auf diese Art stattfindende Weitergabe der Erbinformation von einer Generation zur anderen ist ein zentraler Prozess der Evolution. Fehler, die bei der Replikation der DNA auftreten, führen zu einer Diversifizierung der Genomsequenz. Das Verwenden der so entstehenden unterschiedlichen genomischen DNA-Sequenzvarianten kann im weiteren Verlauf der Proteinbiosynthese zu veränderten Proteinvarianten führen. Unterschiede in der Sequenz der kodierenden genomischen DNA können konservativ oder mutagen sein, das heißt, dass durch den Unterschied ein DNA-Triplett entsteht, dass für die
gleiche Aminosäure kodiert oder aber für eine andere. Sollte darüber hinaus dieser mutagene Unterschied in einem kodierenden Bereich der genomischen DNA liegen, so führt diese Mutation zu einem verändertem Protein (Phänotyp). Auf diese Weise entstandene unterschiedliche Phänotypen können sich neutral verhalten, aber auch negative Effekte auf den betroffenen Organismus haben. Setzen sich die so entstandenen Phänotypen aufgrund einer höheren evolutionären „Fitness“
gegenüber den Ursprungsphänotypen durch,[1, 2] so kann dies zur Anpassung an neue Bedingungen bis hin zur Entstehung neuer Spezies führen.[3] Andere Mutationen können aber auch zu inaktiven Proteinen und so zu Erkrankungen oder Prädispositionen für Krankheiten oder Arzneimittelunverträglichkeiten führen. [4-7]
1.2. DNA-Polymerasen
Die natürliche DNA-Synthese wird ausschließlich von DNA-Polymerasen durchgeführt. Diese Enzyme wurden vor fast 50 Jahren von Kronberg entdeckt.[8] In den darauf folgenden Jahren wurde eine Vielzahl weiterer DNA-Polymerasen mit unterschiedlichen Strukturen und spezialisierten Funktionen identifiziert, deren Anzahl bis heute wächst.[9-11] Es treten DNA-Polymerasen mit sehr hohen Genauigkeiten von einem Fehler pro einer Million kopierter Nukleotide auf, aber auch solche, die extrem hohe Fehlerraten aufweisen oder sogar den bevorzugten Einbau von nicht nach Watson-Crick-Regeln gepaarten Nukleotiden katalysieren.[12, 13]
Andere DNA-Polymerasen sind in der Lage über Läsionen im Templatstrang hinweg zu synthetisieren und dienen als Hilfs- und Reparaturenzyme im Fall von DNA- Schädigungen.[14-20] Es werden große Anstrengungen unternommen die Mechanismen, die zu dieser hohen Varianz der DNA-Polymerasenselektivität und auch deren Aktivität führen, zu verstehen.
Neben dem wissenschaftlichen Interesse am Verständnis der DNA-Polymerase- Mechanismen besteht auch zunehmend ein Interesse an DNA-Polymerasen in medizinischen und biotechnologischen Anwendungen, wie z.B. in der Entwicklung von Wirkstoffen gegen Krankheitserreger wie HIV (Human Immunodefiency Virus),[21-
23] oder etwa bei der Entwicklung von Werkzeugen wie z.B. DNA-Polymerasen mit an bestimmte Fragestellungen angepassten Eigenschaften. [24-29]
Ein tiefergehendes Verständnis der DNA-Polymerase-Mechanismen durch neue Untersuchungsmethoden würde die Entwicklung von neuen Wirkstoffen und Werkzeugen basierend auf DNA-Polymerasen unterstützen.
Neue Untersuchungsstrategien in dieser Hinsicht könnten chemisch modifizierte Substratsonden sein die durch veränderte Eigenschaften bei ihrer Prozessierung Einblicke in den Katalysemechanismus ermöglichen könnten. Ein anderes Vorgehen ist die Generierung von Enzymbibliotheken durch kombinatorische Verfahren und die anschließende Analyse der veränderten Varianteneigenschaften. Durch solche Bibliotheken kann der Zusammenhang von Enzymstruktur und Enzymfunktion untersucht und verstanden werden. Duch das Durchmustern solcher Bibliotheken nach Enzymen mit veränderten und an bestimmte Fragestellungen angepassten Eigenschaften ist es auch möglich Enzyme mit optimierten oder neuen Funktionen zu finden.[30, 31] Auf diese Art optimierte Enzyme werden in zunehmenden Maß als Werkzeuge in der Medizin, der Diagnostik aber auch in der chemischen Industrie eingesetzt.[32-35]
1.2.1. DNA-Polymerasen als Wirkstoffziel: HIV-1 Reverse Transkriptase
Aufgrund der zentralen Rolle von DNA-Polymerasen in der Replikation aller Organismen stellen diese Enzyme potentielle Ziele in der Wirkstoffentwicklung dar.
Als Beispiele sollen hier z.B. die Verwendung von Telomeraseinhibitoren zur Chemotherapie[36] oder auch diverse Wirkstoffe zur Bekämpfung von Herpes simplex[37] und insbesondere AIDS (Aquired Immunodefiency Syndrom) genannt werden.[38]
Nach dem Eindringen des Retrovirus HIV in die T-Zellen des Wirtes wird das virale RNA-Genom durch die HIV-1 Reverse Transkriptase (HIV-1 RT) in doppelsträngige DNA übersetzt, die daraufhin in das Wirtsgenom integriert wird.[38] Durch eine geringe Genauigkeit in der DNA-Generierung durch die HIV-1 RT wird eine starke Diversifizierung des HIV-Genoms erreicht. Das führt zu einer schnellen Anpassungsfähigkeit des Virus.[39]
Eine Vielzahl von Wirkstoffen gegen die AIDS-Erkrankung hat die Inhibierung der HIV-1 RT zum Ziel. Diese Wirkstoffe lassen sich in zwei Klassen unterteilen. Zum einen in Inhibitoren, die abseits des aktiven Zentrums an das Enzym binden und eine allosterische Hemmung bewirken. Diese Wirkstoffe werden als Nicht Nukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren (NNRTI) bezeichnet. Beispiele für NNRTI sind Efavirenz und Nevirapin. Bei der zweiten Inhibitorklasse handelt es sich um Nukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren (NRTI). Wirkstoffe, die zu dieser Klasse gezählt werden sind z.B. AZT (3’-Azido-2’,3’-didesoxythymidin) und ddC (2’-
3’-Didesoxycytidin). Die Wirkungsweise der NRTI beruht auf der Phosphorylierung und dem Einbau dieser nukleosidischen Monomere während der Replikation des Virus-Genoms. Nach ihrem Einbau kommt es zu einem Strangabbruch, weil die Wirkstoffe zwar durch die DNA-Polymerase eingebaut, aber im Anschluss nicht verlängert werden können.[40-42]
Bei Patienten, die mit NRTI-Wirkstoffen behandelt wurden, tritt häufig eine HIV-1 RT Mutante auf, bei der in Position 184 der Peptidsequenz die Aminosäure Methionin durch einen Valinrest ausgetauscht ist. Durch diese Mutation im aktiven Zentrum des Wildtyp (wt)-Enzyms wird die Effizienz des Einbaus von Nukleosidanaloga wie AZT und ddC gegenüber der Einbaueffizienz natürlicher Nukleoside stark herabgesetzt und die Wirkstoffe werden somit unwirksam.
Strategien, die Einsichten in den Mechanismus des dynamischen Prozesses der HIV-1 RT Selektivität erlauben, könnten die Entwicklung neuer Inhibitoren unterstützen.
1.2.2. Kinetik von DNA-Polymerasen
Der Reaktionsweg der DNA-Polymerisation durch die Katalyse einer DNA- Polymerase folgt einem in Abbildung 1 dargestellten Schema:
In einem ersten Schritt wird ein dNTP als Substrat an den Komplex aus DNA- Polymerase, Primer und Templat gebunden. Der Komplex aus allen drei Substraten und der DNA-Polymerase wird als ternärer Komplex bezeichnet. Im nächsten Schritt kommt es zu einer konformellen Änderung des Enzyms, dem sogenannten induced
Abbildung 1 Allgemeines Katalyseschema für die enzymatische DNA-Synthese durch DNA-Polymerasen (E=DNA-Polymerase, E*= DNA-Polymerase-veränderter Konformation, PPi=Pyrophosphat)
fit. Durch diese Konformationsänderung bildet sich eine aktive Tasche aus, die formkomplementär zu dem Nukleotid ist, das nach Watson-Crick gegenüber der Templatbase eingebaut würde. In dieser Tasche wird der Einbau des entsprechenden Nukleotides und die Abspaltung eines Pyrophosphates katalysiert.
Nach Freisetzen des Pyrophosphates folgen drei mögliche Reaktionswege. (i) Die Dissoziation der DNA-Polymerase vom Substratkomplex, (ii) die Translokation des Enzyms, gefolgt vom Einbau eines weiteren Nukleotidbausteins, oder (iii) das Ausschneiden eines fehlgepaarten Nukleotides durch eine sogenannte Exonukleasefunktion. Diese Funktion wird auch als proofreading oder Korrekturlesefunktion bezeichnet.[43, 44]
Die Analyse der kinetischen Daten der DNA-Polymerasefunktionen kann durch steady-state kinetische Untersuchungen wie auch durch pre-steady-state kinetische Untersuchungen erfolgen. Bei steady-state- kinetischen Untersuchungen werden Reaktionen mit verschiedenen dNTP-Konzentrationen durchgeführt. Ein Enzymmolekül prozessiert mehrfach verschiedene Substratmoleküle. Im Falle von DNA-Polymerasen werden also verschiedene Nukleoside in verschiedene Primer- Templat-Komplexe eingebaut. Bei steady-state kinetischen Untersuchungen müssen sogenannte single competed hit Bedingungen eingehalten werden, das bedeutet, es müssen Bedingungen geschaffen werden, unter denen ein Enzym nur einmal an jeweils einen bestimmten DNA-Komplex gebunden wird. Diese Bedingung ist mathematisch dann erfüllt, wenn der Umsatz der Reaktion unterhalb von 20% bleibt.
Aus steady-state-Untersuchungen kann die Substratabhängigkeit der Katalysegeschwindigkeit nach Michaelis-Menten (KBMB) bestimmt werden. Außerdem ergibt sich die maximale Katalysegeschwindigkeit kBcatB bzw VBmaxB mit (VBmaxB=kBcatB * cEnzym). Aus Untersuchungen dieser Art können können die kinetischen Parameter der Gesamtreaktion erhalten werden. [45, 46]
Pre-steady-state-Kinetikmessungen hingegen werden unter single turnover- Bedingungen in Bezug auf dNTP und Primer-Templat-Komplex durchgeführt.
Typische Methoden zur Untersuchung solch kurzlebiger Intermediate sind die sogenannten stopped flow und quensched flow Messtechniken. Durch sehr kurze Reaktionszeiten von bis unter 1µs kann die Katalysegeschwindigkeit betrachtet werden, ohne dass die Einflüsse von Enzymassoziation und Dissoziation einwirken.
Dabei wird die Dissoziationskonstante die KBDB des dNTPs und die maximale Katalysegeschwindigkeit kBpolB ermittelt.[47] Die in der vorliegenden Arbeit
beschriebenen kinetischen Daten wurden ausschließlich durch steady-state- kinetikmessungen ermittelt.
1.2.3. Die Genauigkeit von DNA-Polymerasen
Um bei der Replikation in vivo die genetische Information korrekt weiter zu geben, müssen beim Menschen annähernd 3 Milliarden Basenpaare fehlerfrei kopiert werden. Die DNA-Polymerasen, welche die Vervielfältigung des Genoms ausführen, erreichen in Bakterien eine Gesamtgenauigkeit von einem Fehler pro 10P8P bis10P10P kopierten Basen. In eukaryotischen Systemen werden sogar Genauigkeiten >10P10P/bp erreicht. In Untersuchungen mit exonukleasedefizienten DNA-Polymerasen konnte der Anteil der DNA-Synthesegenauigkeit ohne den Einfluss der Korrekturlesefunktion untersucht werden. Solche Untersuchungen sind für die bakteriellen DNA- Polymerasen I und III und auch für die T4- und T7-DNA-Polymerasen beschrieben.
Unter den eukaryotischen DNA-Polymerasen sind δ, ε und γ in vergleichbaren Experimenten untersucht worden. Es wurden Fehlerraten von einem Fehler pro 10P8P eingebauten Nukleotiden gefunden.[12, 13]
Der Anteil der Korrekturlesefunktion an der Gesamtgenauigkeit liegt somit bei 10P-2P/bp.
1.2.4. 4’-C-modifizierte-Desoxyribonukleotidtriphosphate
Aus Kristallstrukturen von DNA-Polymerasen ist bekannt, dass es im aktiven Zentrum des Enzyms zu einem engen Kontakt zwischen der DNA-Polymerase und dem DNA-Doppelstrang kommt.[48-51] Ein besonders enger Kontakt konnte zur 4’- Desoxyriboseposition des eintretenden Nukleosidriphosphates gezeigt werden.
Durch chemische Veränderung in dieser Position des Nukleosides und anschließender Verwendung dieser Bausteine als Substrate für DNA-Polymerasen könnten somit interessante Einblicke in die Prozesse der DNA- Polymerasengenauigkeit resultieren (269HAbbildung 2). Summerer und Marx zeigten unter Verwendung derart modifizierter Substrate, dass durch eine Methylmodifikation in der 4’-C-Position des eintretenden Nukleosidriphosphates starke Effekte auf die Selektivität der DNA-Polymerase erreicht werden können.
Abbildung 2: Chemisch modifizierte Substrate wie sie von Summerer und Marx zur untersuchung der Interaktion von DNA-Polymerasen und deren Substrate eingesetzt wurden. (1) modifiziertes Nukleosidtriphosphat, (2) modifiziertes Templatnukleotid.
Die Fähigkeit, der von ihnen untersuchten DNA-Polymerase, das exonukleasedefiziente Klenow Fragment (KFP-P) der E.coli DNA-Polymerase I, den Einbau fehlgepaarter Nukleotide zu diskriminieren, wurde um den Faktor 100 erhöht.[52] Diese sterischen Sonden sollen in der vorliegenden Arbeit genutzt werden, um Einblicke in den dynamischen Prozess der DNA-Polymerasenselektivität von HIV-1 RT und einer ihrer auftretenden Mutationsvarianten zu erlangen.[52-54]
1.2.5. Interaktionen zwischen eintretendem dNTP und dem aktiven Zentrum der DNA-Polymerase
Über lange Zeit herrschte die Modelvorstellung vor, dass, dass die Auswahl des entsprechenden Watson-Crick-dNTPs durch die DNA-Polymerase ausschließlich aufgrund von informativen Wechselwirkungen zum Wasserstoffbrückenmuster an der Watson-Crick-Seite stattfindet. Wie sich mittlerweile jedoch belegen lässt, kann diese Vorstellung nicht als einziges Unterscheidungskriterium zwischen korrektem und fehlgepaartem Einbau herangezogen werden. Vielmehr wird vermutet, dass sich in Abhängigkeit des Templatnukleotides eine rigide dNTP-Bindungstasche ausbildet, die ausschließlich zum jeweils kanonischen Substrat formkomplementär ist.[48, 55-57]
Bei der Bindung von nicht kanonischen Nukleotiden treten sterische Spannungen auf, die den Einbau verhindern. Um zu untersuchen wie hoch der Anteil der Wasserstoffbrückenmuster an der DNA-Synthese-Selektivität ist, synthetisierten Kool et al. isostere Basenanaloga, die nicht die Fähigkeit zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken besitzen (Z und F, Abbildung 3).
Kool zeigte in diesen Studien, dass die artifiziellen Nukleotide sowohl gegenüber natürlichen Templatbasen als auch gegenüber artifiziellen Basen mit hoher Selektivität und Effizienz eingebaut werden.[58-60] Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass das Wasserstoffbrückenmuster nur einen Teil der Substraterkennung ausmachen kann und unterstützen ein sterisches Model der DNA- Polymeraseselektivität. Im sterischen Model (Abbildung 4) wird die Differenzierung zwischen dem richtigen und dem falschen Nukleosidtriphosphat über deren Größe und Form erreicht.[61-63]
Abbildung 4 A) Model der sterischen Spannung am Beispiel eines korrekten und eines fehlgepaarten Einbaus.
B) Durch Einführen eines raumbeanspruchenden Restes wird die sterische Spannung im Fehlpaarungsfall erhöht und der Einbau erschwert.
Abbildung 3 Isostere Nukleosidsonden zur Untersuchung des Beitrages der Wasserstoffbrücken an der Gesamtselektivität der DNA-Polymerasereaktion.
Bei diesem Model bildet die DNA-Polymerase ein katalytisches Zentrum aus, in das nur das richtige dNTP passt. Soll ein falsches Nukleotid eingebaut werden, muss dieses nicht optimale Ausrichtung annehmen. Dadurch treten sterische Spannungen im aktiven Zentrum des Enzyms auf. DNA-Polymerasen mit hoher Genauigkeit weisen ein sehr rigides Zentrum auf, das die mit der Fehlpaarung verbundene Konformationsänderung verhindert. Ungenaue DNA-Polymerasen hingegen haben ein sehr flexibles aktives Zentrum und ermöglichen so den vermehrten Einbau von fehlgepaarten dNTPs.
Durch die oben beschriebenen Studien von Summerer und Marx wurde eine Möglichkeit geschaffen, den Einfluss von sterischen Spannungen auf den Mechanismus der DNA-Polymeraseselektivität zu untersuchen. Durch das Einführen von Alkylgruppen in der 4’-C-Position der 2’-Desoxyriboseeinheit kommt es zu zusätzlichen Wechselwirkungen zwischen Enzym und eintretendem Nukleosidtriphosphat. Diese nehmen stark zu, wenn ein fehlgepaartes Nukleotid im aktiven Zentrum des Enzyms gebunden ist und eine nicht kanonische Ausrichtung einnehmen muss, um in den naszierenden Strang eingebaut zu werden. Dieses wird darauf zurückgeführt, dass durch den sterischen Anspruch der Alkylmodifikation im kanonischen Fall nur geringe zusätzliche Spannungen auftreten (Abbildung 4a).
Wenn eine Fehlpaarungssituaion auftritt wird die Modifikation durch die Konformationsänderung des Bausteines aber in eine verstärkte Spannungssituation gedrängt und der Einbau somit verhindert (Abbildung 4b).
1.2.6. Wechselwirkungen zwischen DNA-Polymerase und Primer-
TTemplat-Komplex
Die Protein-Substrat-Wechselwirkungen im ternären Komplex gehen weit über das eigentliche katalytische Zentrum des Enzyms hinaus. Aus Kristallstrukturen und chemischen Footprint Experimenten ist bekannt, dass z.B. das Klenow Fragment Wechselwirkungen mit dem Primer-Templat-Komplex eingeht. Diese Wechselwirkungen reichen bis zu fünf bis acht Basenpaare distal zum aktiven Zentrum.[64] Die Kontakte finden vorrangig über die kleine Furche der DNA statt und werden von der Daumendomäne der DNA-Polymerase eingegangen.[51, 55, 56] Andere Wasserstoffbrücken, zwischen Donorpositionen im Enzym und Akzeptorpositionen an den Nukleobasen, variieren zwischen den verschiedenen Sequenzfamilien von
DNA-Polymerasen. Diese haben jedoch gemein, dass die Wechselwirkungen zu den N(3)- und O(2)-Positionen der Purine und Pyrimidine eingegangen werden. Die Interaktionen reichen bis zum vierten Basenpaar ausgehend vom Primerterminus.
Durch eine Aufweitung der kleinen Furche werden die Akzeptorpositionen der DNA freigelegt und die Wasserstoffbrückenbildung erleichtert. Ähnliche Interaktionen werden in allen DNA-Polymerasen der verschiedenen Sequenzfamilien gefunden.
Sie variieren jedoch in der Anzahl der an der Wechselwirkung teilnehmenden Nukleotide.[57, 65, 66]
1.3. Detektierung von Genvarianten
1.3.1. Methoden zur Detektierung von Genvarianten in geschlossenen Gefäßen
In der Gesamtheit des aus 3 Milliarden Basenpaaren bestehenden menschlichen Genoms, unterscheiden sich einzelne Individuen in ungefähr 0,1 Prozent ihrer Nukleotidsequenz.P[67, 68] Die häufigste unter diesen 3 Millionen Nukleotidvariationen sind sogenannte Single Nucleotide Polymorphisms (Einzelnukleotid Polymorphismen) SNPs.[4-6] Als SNPs sind solche Stellen im Genom definiert, an denen die seltener auftretende Allelvariante bei mehr als 1% der Bevölkerung vorkommt. Zwischen diesen Variationen und bestimmten Krankheiten besteht ein direkter Zusammenhang, der in der „Pharmakogenomik“ untersucht wird. Außerdem konnten unterschiedliche Arzneimittelverträglichkeiten bei Patienten direkt mit bestimmten SNPs in Verbindung gebracht werden.[5, 6, 69]PP Viele Forschungsschwerpunkte konzentrieren sich deshalb auf das Auffinden neuer SNPs und der Aufklärung deren Verbindungen zu verschiedenen Phänotypen. Bis heute konnten, durch eine Vielzahl von Methoden, 1,8 Millionen SNPs identifiziert und charakterisiert werden. In einem ersten Schritt werden Methoden benötigt, durch die unbekannte Nukleotidvariationen zunächst identifiziert werden, um dann auf ihre medizinische Relevanz hin untersucht werden zu können. Nachdem der exakte Sequenzkontext bekannt ist, werden andere Methoden benutzt, die das Durchmustern von Bevölkerungsgruppen nach bekannten SNPs oder die Analyse von Individuen nach SNP Mustern ermöglichen. Dafür sind Analysemethoden notwendig, die eine zeit- und kosteneffektive Untersuchung von Nukleotidvariationen in der täglichen Laborpraxis ermöglichen.[28, 70-76] Die Zuverlässigkeit dieser
Methoden ist entscheidend für grundlegende Fortschritte in der Pharmakogenomik, die es in Zukunft ermöglichen soll eine Therapie an die genetische Ausstattung des Patienten anzupassen. Behandlungen mit Wirkstoffen, die ineffektiv sind oder Nebenwirkungen verursachen, sollen somit verhindert werden.
Wie oben erwähnt, sind die Anforderungen, die an diese Methoden gestellt werden, eine hohe Zeit-, Arbeits- und Kosteneffektivität. Bis heute sind bereits einige Methoden bekannt, von denen sich aber bislang keine durchsetzen konnte.P[28, 71-76]
Ein wichtiger Fortschritt in der Entwicklung dieser Methoden wäre die Verringerung der Arbeitsschritte auf ein Minimum. In den meisten Fällen erfolgt eine Voramplifikation der genomischen Zielsequenz durch die Polymerasen Kettenreaktion (PCR) vor dem eigentlichen analytischen Detektierungsschritt. Diese Methoden können als Zweischrittmethoden bezeichnet werden.[28, 70-75]
P Methoden, die keine Voramplifizierung einsetzen, sollten besser für die oben beschriebene Anwendung geeignet sein. Im Folgenden sollen einige solcher Methoden, die keine PCR-Voramplifizierung der Zielsequenz einsetzen, beschrieben werden. Bei diesen Methoden erfolgt Amplifizierung und Analyse direkt in einem geschlossenen Gefäß.
Für einen umfassenderen Überblick über Methoden, die in der DNA Diagnostik eingesetzt werden, soll auf kürzlich veröffentlichte Übersichtsartikel verwiesen werden.P[28, 70-76]
1.3.2. Sequenzspezifische invasive Spaltung von Oligonukleotiden: Der Invader Assay
Der Invader Assay kann in zwei Reaktionen unterteilt werden.[77, 78] Zuerst werden zwei als „Signalsonde“ und „Invasivsonde“ bezeichnete Oligonukleotide gleichzeitig an die genomische Ziel-DNA angelagert. Die Sequenzen beider Sonden sind in der Art gestaltet, dass sie eine charakteristische Struktur ausbilden, wenn sie an die Zielsequenz gebunden sind (Abbildung 5A).
Die Signalsonde besteht aus zwei Regionen. Eine Region ist komplementär zur Zielsequenz, die andere, die 5’-Arm Region ist weder zur Zielsequenz noch zur Invasivsonde komplementär. Die gebildete Struktur wird durch bestimmte 5’-3’- Nukleasen z.B. Archaeoglobus fulgidus Flap-Endonuklease I oder der Thermus aquaticus DNA-Polymerase, die eine 5’-3’-Exonukleaseaktivität trägt, erkannt. Die Signalsonde wird durch diese Exonukleasefunktion an der markierten Position gespalten und entlässt ein Oligonukleotid.P[79] Dieses besteht aus der 5’-Arm Region und einem Nukleotid aus der spezifischen Zielsequenzregion. Bemerkenswert ist, dass durch die Anwesenheit der Invasivprobe die Spaltungsrate signifikant erhöht wird.P[78, 79] Darüber hinaus ist es für die Spaltung entscheidend, dass die Signalsonde gegenüber der Zielsequenz an der Stelle des SNPs vollständig komplementär ist. Die Fähigkeit des Enzyms, selektiv kanonische Zielsequenz-Signalsonde-Komplexe zu spalten, bewirkt somit die Unterscheidung zwischen Einzelbasenvariationen im
Abbildung 5 Genotypisierung durch den Invader Assay. Durch das Anlagern von zwei Oligonukleotidsonden (Signal- und Invasivsonde) wird an der zu untersuchenden Position eine Triplexstruktur ausgebildet. A) Im Fall des kanonischen Triplexes wird die Signalsonde an der markierten Position durch eine Flap-Endonuklease geschnitten und der 5’-Arm der Sonde wird frei. Der freie 5’-Arm dringt sequenzspezifisch in eine FRET-Kassette ein und katalysiert somit deren Restriktion durch die Flap-Endonuklease. Durch die Restriktion tritt eine räumliche Trennung von Fluorophor- (F1) und Quenchermolekül (Q) ein und ein Fluoreszenzsignal wird generiert. B) Wird aufgrund einer Einzelbasenvariation ein nicht perfekt kanonischer Triplex ausgebildet, so wird eine effektive Spaltung der Struktur verhindert. Daraus folgt, dass die Spaltung der FRET-Kassette nicht katalysiert wird und das Fluoreszenzsignal weiter unterdrückt bleibt.
Invader Assay. Einzelbasenvariationen in der Zielregion, z.B. durch das Vorhandensein eines Einzelnukleotidpolymorphismusses, führen zu einem fehlgepaarten Komplex, der mit deutlich geringerer Effizienz gespalten wird. Werden die Reaktionen bei erhöhten Temperaturen und mit einem Überschuss der Signalsonde durchgeführt, so kann das generierte Fluoreszenzsignal amplifiziert werden. Dies erfolgt durch die Dissoziation der geschnittenen Sonde und das wiederholte Anlagern einer ungeschnittenen Signalsonde (Abbildung 4B).P[78] Durch einen angeschlossenen zweiten Reaktionsschritt kann das Signal noch weiter vervielfältigt werden. In diesem Schritt lagert sich der geschnittene Strang der Signalsonde an eine Fluoreszenzenergietransfer (FRET) Kassette an und dringt in eine kurze Haarnadelstruktur ein, die an ihrem 5’-Ende ein Fluorophor-Quencher- Paar trägt. Die Spaltung des Konstruktes an der markierten Position wird erneut durch die 5’-3’-Nukleasefunktion der oben beschriebenen Enzyme bewirkt. Die Spaltung führt zur Generierung eines Fluoreszenzsignals durch die Trennung von Fluorophor und Quencher. Die gespaltene Signalsonde katalysiert also die Spaltung der FRET-Kassette und führt im zweiten Schritt des Invader Assays zum Freiwerden des Fluorophors.[80] In der Praxis werden beide Reaktionen im selben Reaktionsgefäß durchgeführt und es wird eine 10P7P-fache Vervielfältigung des Signals innerhalb von 4 Stunden erziehlt. Eine direkte SNP Analyse kann von Proben die 10-100ng genomische DNA enthalten durchgeführt werden.P[81]
1.3.3. Genotypisierung durch die 5’-3’-Exonukleaseaktivtät von DNA- Polymerasen: Der TaqMan Assay
Im TaqMan Assay wird die 5’-3’-Nukleasefunktion der Thermus Aquaticus DNA- Polymerase ausgenutzt.P[82] Die charakteristischen Schritte dieses Ansatzes sind eine DNA-Synthese durch die DNA-Polymerase, ein teilweises Verdrängen des Doppelstranges und die Spaltung einer FRET-DNA-Sonde durch das Enzym. Durch diese Spaltung werden Fluorophor und Quencher getrennt und ein Fluoreszenzsignal generiert (Abbildung 6).P[82-85]
Mehrere Faktoren ermöglichen es, in diesem Ansatz zwischen Einzelnukleotidvariationen zu unterscheiden. Zum einen formen komplementäre Sonden Duplexe mit der Zielregion, die deutlich stabiler sind als Duplexe, die Fehlpaarungen enthalten.P[83] Folglich können durch sorgfältiges Anpassen der Anlagerungs- und Verlängerungstemperatur in der PCR solche Bedingungen geschaffen werden, unter denen die Ausbildung der perfekt gepaarten Duplexe gegenüber einfach fehlgepaarten Duplexen bevorzugt ist. Die Duplexstruktur ist zwingend notwendig für die 5’-3’-Nukleasefunktion der DNA-Polymerase, die am gegabelten Ende der Duplexstruktur stattfindet. Dafür müssen ein bis drei Nukleotide am 5’-Ende der Sonde abgelöst werden, bis eine Spaltung der Sonde stattfinden kann.P[83] Fehlgepaarte Konstrukte werden durch das Ablösen weiter destabilisiert, wodurch eine Dissoziation der Sonde resultiert und eine Spaltung somit verhindert wird. Dadurch bleibt die Generierung des Fluoreszenzsignals aus. Ein wesentlicher Parameter für den Erfolg dieses Ansatzes ist die Gestaltung der Sonde. Die Sonde muss lang genug sein, um bei der Verlängerungstemperatur der PCR (~70°C) einen stabilen Duplex auszubilden. Gleichzeitig muss sie aber auch kurz genug sein, um bei Einzelbasenvariation in der Zielregion eine ausreichende Destabilisierung zu bewirken, die die Sondenspaltung verhindert.
Abbildung 6 Der TaqMan Assay. A) Der Sequenzraum der Zielregion wird in einer PCR durch Taq-DNA- Polymerase, die eine 5’-3’-Nukleaseaktivität aufweist, amplifiziert. Die Sondensequenz ist komplementär zu einer Allelvariante. Im Fall eines anderen Allels bildet sich ein fehlgepaarter Komplex aus (siehe B). Der perfekt kanonisch gepaarte Hybrid A) ist thermodynamisch stabil. Der einfach fehlgepaarte Hybrid B) ist bei den angewendeten Temperaturen thermodynamisch instabiler. Wenn die Strangverlängerung voranschreitet spaltet die 5’-3’-Nuklease Aktivität der Taq DNA-Polymerase kanonisch gebundene Sonden und setzt ein Fluorophor frei.
Daraus resultiert ein Fluoreszenzsignal. Im Fall des nicht kanonischen Sonde-Zielseqenz–Komplexes wird dadurch, dass die DNA-Polymerase einen Teil der Sonde verdrängt die thermodynamische Stabilität weiter reduziert und die Sonde dissoziiert ab. Dadurch wird eine Spaltung verhindert und es wird kein Fluoreszenzsignal erzeugt.
Der ganze Ansatz findet in einem geschlossen Reaktionsgefäß statt, der keine weitere Prozessierung nach der PCR erfordert. Außerdem kann die Analyse in Echtzeit durchgeführt und verfolgt werden. Diese Methode ist sehr empfindlich und es werden kleinste Mengen genomische DNA (2-20ng) benötigt.[86]
1.3.4. Genotypisierung durch Verwendung der DNA-Polymerase- Selektivität: Allel-Spezifische Amplifikation
Ein konzeptionell sehr einfacher Ansatz um Allelvarianten zu identifizieren ist in der allelspezifischen Amplifikation (ASA) verwirklicht. Ein PCR-Primerpaar wird in der Art entworfen, dass das 3’-Ende eines Primers komplementär zu einer Allelvariante ist (Abbildung 7).
Im Idealfall sollte die Verlängerung eines fehlgepaarten Primerendes durch die DNA- Polymerase diskriminiert werden. In diesem Fall ist die exponentielle Produktbildung in der PCR verhindert.[87-93]
Die Produktbildung kann durch Gelchromatographie, aber auch in Echtzeit kontrolliert werden. Dabei wird ein spezifisch an die kleine Furche von doppelsträngiger DNA bindender Fluoreszenzfarbstoff (z.B. SybrGreen I) verwendet, der nach einer sequenzunabhängigen Bindung an DNA fluoresziert.P[94, 95] Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass keine teuren sequenzspezifischen Fluoreszenzsonden verwendet werden müssen. Da nur die Zunahme an doppelsträngigen PCR-
Abbildung 7 Allelspezifische Amplifizierung. Das PCR-Primerpaar wird in der Art gestaltet, dass ein Ausschnitt der interessierenden genomischen DNA amplifiziert wird. Das 3’-Ende eines Primers ist so positioniert, dass es gegenüber der SNP-Position liegt. Daraus resultiert ein kanonisch gepaarter A) oder ein einfach fehlgepaarter B) Komplex in Abhängigkeit des Nukleotides in der Zielsequenz. Im Fall des kanonischen Hybrides ist die DNA- Polymerase in der Lage den Primer zu verlängern. Daraus ergibt sich eine exponentielle Amplifikation. Die Verlängerung des fehlgepaarten Primers findet nur stark gehemmt statt und die Bildung eines PCR Produktes wird verhindert.
Produkten ohne eine Sequenzspezifität beobachtet wird, werden Produkte aus unspezifischen Amplifikationen wie z.B. Primerdimere falsch positiv interpretiert. Um dies zu vermeiden und somit die Detektierung von Fehlamplifikaten zu verhindern, werden FRET-Sonden, wie beispielsweise molecular beacons, die sequenzspezifisch an das Amplifikat binden und dadurch ein Fluoreszenzsignal erzeugen, eingesetzt.P[96]
Solche Sonden verbinden die Signalerzeugung sequenzspezifisch mit der Vervielfältigung des Zielsequenzraumes. In vielen Fällen ist bei dieser Methode aber eine zeit- und kostenintensive Optimierung der Reaktionsbedingungen notwendig.
Alle Entwicklungen, die einen positiven Einfluss auf die Selektivität und die Zuverlässigkeit der allelspezifischen-PCR haben, haben also auch einen wichtigen Einfluss auf die Zuverlässigkeit und die Robustheit der direkten SNP-Detektierung durch ASA.
Sogenannte Multiplexreaktionen, bei denen die Unterscheidung beider Allelvarianten in einem Reaktionsgefäß stattfindet, können durch Einführen einer spezifischen 5’- Überhangsequenz zu jedem allelspezifischen Primer realisiert werden (Abbildung 8).
Dadurch wird die Signalerzeugung direkt an die Verwendung eines der allelspezifischen Primer in der PCR-Amplifikation geknüpft. Als Überhang werden zwei Haarnadel-FRET-Strukturen mit in verschiedenen Wellenlängen fluoreszierenden Fluorophoren verwendet.P[96]
Während der PCR wird der Überhang doppelsträngig und dadurch die Haarnadelstruktur geöffnet. Daraus resultiert ein für ein Allel spezifisches Fluoreszenzsignal.
Abbildung 8 Parallele allelspezifische Amplifikation. Jeder der allelspezifischen Primer ist mit einem spezifischen Oligonukleotid verbunden, das nicht zur Zielsequenz komplementär ist und eine Schlaufenstruktur ausbildet. Jede dieser Strukturen trägt ein Fluorophor–Quencherpaar. Während der PCR wird der allelspezifische Primerstrang verlängert und die Schlaufenstruktur linearisiert. Das führt zu einer Trennung von Fluorophor und Quencher und ein Fluoreszenzsignal wird generiert. Dabei ist die Wellenlänge des Konstruktes an die Allelvariante gekuppelt wie es exemplarisch für den Genotyp A – Signal F1 in A) und für Genotype G – Signal F2 in B) gezeigt ist.
In einem anderen Ansatz wird eine einfache lineare Überhangsequenz eingefügt, die dann durch einen zweiten, wie oben beschriebenen Überhangprimer detektiert wird (Abbildung 9) [97] Dieses Vorgehen hat den Vorteil, dass die Primer, die die Überhang-FRET-Struktur tragen unabhängig von der Zielsequenz und somit universell einsetzbar sind.
Dasselbe FRET-Primerpaar kann demnach in jedem Sequenzkontext eingesetzt werden und lediglich die einfach zu synthetisierenden allelspezifischen Primer variieren. Die Unterscheidung zwischen Allelvarianten kann mit 40ng genomischer DNA erreicht werden.
Methoden in der DNA-Diagnostik, die keine fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden verwenden, sind sehr vielversprechend für die weitere Entwicklung von hoch selektiven und robusten Analysemethoden, da kostspielige Fluoreszenzsonden in der PCR durch Standard Primerstränge ersetzt werden könnten.
Abbildung 9 Parallele allelspezifische Amplifikation. Jeder allelspezifische Primer trägt eine spezifische, nicht zur Zielsequenz komplementäre Überhangsequenz. Während der PCR wird der allelspezifische Primer verlängert und die Überhangsequenz an das PCR-Produkt angehängt. Ein zur eingeführten Überhangsequenz komplementärer Primer, der selbst eine Überhangsequenz trägt wird eingesetzt. Der Überhang bildet eine Schlaufenstruktur aus. Während der fortschreitenden PCR wird diese Schlaufenstruktur liniarisiert und ein Fluoreszenzsignal resultiert. Dabei ist die Wellenlänge des Konstruktes an die Allelvariante gekuppelt wie es exemplarisch für den Genotyp A – Signal F1 in A) und für Genotyp G – Signal F2 in B) gezeigt ist.
1.3.5. Isotherme Genotypisierung durch zirkularisierte Oligonukleotidsonden: Padlock Probes und Rolling Circle Amplification (RCA)
Bei Padlock-Sonden handelt es sich um einzelsträngige Oligonukleotide, bestehend aus 70 bis 110 Nukleotiden. Sie werden in einer offen zirkulären Form entworfen, die an jedem Ende eine zur Zielsequenz komplementäre Region enthält (Abbildung 10).P[98]
In Gegenwart einer komplementären Zielsequenz bildet sich zunächst eine offen zirkulären Form durch Anlagerung der beiden Enden aus, welche dann von einer
Abbildung 10 Rolling Circle Amplification (RCA). A) In einem ersten Schritt lagert sich die offen zirkuläre Sonde, mit den beiden zur Zielsequenz komplementären Teilen, an die Zielsequenz an. Beide Enden liegen sich gegenüber und formen eine, einem Strangbruch ähnelnde Lücke aus. Im Fall einer Allelvariante bildet sich am 3’-Ende ein perfekt kanonischer Hybrid aus A). In den anderen Fällen kommt es zu einer Fehlpaarung B).
Die kanonisch gepaarten Enden werden durch eine DNA-Ligase ligiert wodurch eine zirkuläre Sonde gebildet wird. Im Fall des fehlgepaarten Komplexes unterbleibt die Ligation durch die Ligase. Die Reaktionslösung enthält außerdem ein Oligonukleotid, das komplementär zu einem Teil der Sondensequenz ist und somit als Primer dienen kann. Eine DNA-Polymerase verlängert diesen Primer und stoppt an der Stelle der nicht ligierten Lücke (siehe B)). Wurde die Sonde durch die DNA-Ligase zirkularisiert so kann die Primerverlängerung fortschreiten. (siehe A)). Nachdem die Verlängerung die komplette zirkuläre Sonde umlaufen hat, wird der schon an die Sonde hybridisierte DNA-Strang durch die DNA-Polymerase verdrängt. Hieraus resultiert ein DNA-Einzelstrang, bestehend aus tausenden verknüpften Kopien der Sondenkomplementärsequenz.
DNA-Ligase kovalent zur geschlossen zirkulären Padlock-Sonde verknüpft wird.
Offen zirkuläre Sonden, die nicht ligiert wurden, da keine vollständig komplementäre Zielsequenz vorhanden war, können anschließend durch Exonukleasen abgebaut werden. Geschlossene Sonden werden jedoch nicht gespalten. In vielen Anwendungen folgt auf die Verknüpfung zur zirkulären Padlock-Sonde eine isotherme Amplifikation, bei der ein Primer eingesetzt wird, dessen Sequenz aus der zentralen Region der Padlock-Sonde abgeleitet ist. Daraus resultieren hunderte kovalent verknüpfte Kopien der Padlock-Sonde. Für diesen Kopiervorgang, der als rolling circle amplification (RCA) bezeichnet wird,[99] wird eine DNA-Polymerase benötigt, die in der Lage ist doppelsträngige DNA aufzuschmelzen. Oft wird zu diesem Zweck die DNA-Polymerase Φ29 eingesetzt, doch es sind auch Anwendungen beschrieben, die thermostabile DNA-Polymerasen einsetzen.P[100, 101]
Die bekanntesten Anwendungen von Padlock-Sonden auf dem Gebiet der Alleldetektierung benutzen die fehlpaarungsdiskriminierenden Eigenschaften von verschiedenen Enzymen. Oft werden auch Hybridisierungssonden in Kombination eingesetzt.
Im Fall der DNA-Ligase basierten Methoden ist die offen zirkuläre Sonde in der Art gestaltet, dass sich in Abhängigkeit von der Zielsequenz ein perfekt kanonisch gepaartes 3’-Ende ausbildet, oder aber eine Fehlpaarung auftritt.[99] Bedingt durch die fehlpaarungsdiskriminierenden Eigenschaften der eingesetzten DNA-Ligase wird die Sonde zirkularisiert, oder aber die Ligation findet aufgrund des fehlgepaarten Primer-Zielsequenz-Komplexes nicht statt.[102] Zusätzlich kann die Gestaltung der komplementären Enden in der Art ausfallen, dass der 5’-komplementäre Teil der Sonde fest an die Zielsequenz hybridisiert. Die 3’-Region hingegen befindet sich aufgrund einer, um ca. 10°C unter der Reaktionstemperatur von 60°C liegenden Dissotiazionstemperatur, in einem Assoziations/Dissoziations-Gleichgewicht.[103] Die Genauigkeit der Ligationsreaktion wird somit durch die bevorzugte Hybridisierung der perfekt kanonischen offen zirkulären Form an die Zielsequenz unterstützt. Im Anschluss an die Ligation kann eine lineare isotherme RCA durchgeführt werden, um festzustellen, ob die Sonde zirkularisiert wurde oder nicht. Ein weiterer Ansatz, der die Padlock-Sonden-Ligation mit anschließender RCA verwendet, nutzt die fehlpaarungsdiskriminierenden Eigenschaften von DNA-Polymerasen.[100] Hierbei wird die offen zirkuläre Form in der Art entworfen, dass sich eine Lücke, von üblicher Weise sieben Nukleotiden, zwischen den beiden zur Zielsequenz komplementären
Teilen ausbildet (Abbildung 11). Diese Lücke umfasst den Sequenzkontext, der die zu untersuchende Position in der Zielsequenz einfasst. In einem ersten Schritt wird eine DNA-Polymerase verwendet, um die Lücke in der offen zirkulären Sonde aufzufüllen. Dies geschieht durch Einkopieren des Zielsequenzkontextes. Nach dieser Auffüllreaktion wird eine DNA-Ligase benutzt, um die Sonde zu schließen.
Anschließend wird die zirkuläre Padlock-Sonde durch RCA amplifiziert.
Abbildung 11 Hyperbranched rolling circle amplification (HRCA). Die beiden Enden der offen zirkulären Sonde hybridisieren in der Art an die Zielsequenz, dass eine kurze Lücke ausgebildet wird. In einer Auffüllreaktion schließt eine DNA-Polymerase die Lücke, indem sie einen Teil der Zielsequenz in die Sondensequenz kopiert.
Anschließend wird die Sonde durch eine Ligase zirkularisiert. Im Anschluss findet eine rolling circle amplification, ausgehend von einem Primer P1, der in der Sonde hybridisiert, statt. Das einzelsträngige Produkt beinhaltet Wiederholungen des kurzen eingeführten Sequenzraumes, der die SNP-Position beinhaltet. Ein zweites, zu diesem Sequenzraum komplementäres Oligonukleotid lagert sich in der Art an, dass das 3’-Ende komplementär zu einer Allelvariante ist. In einer zweiten Reaktion dient dieses Oligonukleotid als Primer (P2).
Dieser kann nur dann verlängert werden, wenn ein kanonisches Primerende ausgebildet wird A), während im fehlgepaarten Fall keine Verlängerung stattfindet B). Das Produkt aus diesen Verlängerungsreaktionen besteht aus der originalen Sondensequenz. Dadurch kann der erste Primer P1 an diese neu synthetisierten Produkte binden und amplifiziert werden. Es resultiert die Amplifikation eines stark verzweigten Produktes.
Das lineare einzelsträngige Produkt trägt dann hunderte, miteinander verknüpfte Kopien der Padlock-Sonde mit dem eingefügten Sequenzkontext. Diese Sequenzabschnitte hybridisieren an einen allelspezifischen Primer (P2) und bilden entweder einen perfekt gepaarten Hybrid (Abbildung 11A), oder es bildet sich eine Fehlpaarung am 3’-Ende (Abbildung 11B) aus.
Im Anschluss werden die fehlpaarungsdiskriminierenden Eigenschaften von DNA- Polymerasen wie Vent (exoP-P) verwendet, um die möglichen Allele durch allelspezifische Amplifikation zu unterscheiden. Die Produkte dieses Amplifizierungsschrittes bilden wiederholte Kopien der ursprünglichen zirkulären Sonde. Diese Sequenzen tragen wiederum viele Bindestellen für den ersten RCA- Primer (P1). Durch die Verlängerung dieses Primers wird ein wiederholtes Muster aus doppelsträngiger DNA mit Verzweigungen generiert. Diese Methode wird deshalb hyperbranched RCA (HRCA) genannt. Im Gegensatz zur allelspezifischen PCR wird eine Fehlpaarungsverlängerung nicht propagiert, da die fehlgepaarte Base nur einmal in den Primer eingebaut und nicht wiederholt abgelesen wird. Von einer zirkulären Sonde können bis zu 10P9P Kopien in 90min generiert werden.[100]
2001 wurde von Qi et al. eine Anwendung vorgestellt, bei der es möglich ist, die Sondenligation und die anschließende RCA unter identischen Reaktionsbedingungen durchzuführen. Dadurch wurde die Durchführung in einem geschlossenen Format möglich.[101]
