Studien zum Substratspektrum von DNA-Polymerasen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) an der Universität Konstanz
Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie
Vorgelegt von Dipl.-Chem. Ilka Detmer
aus Ladenburg
Konstanz 2007
Erstgutgachter: Prof. Dr. A. Marx Zweitgutachter: Prof. Dr. M. Scheffner Erstgutgachter: Prof. Dr. A. Marx Zweitgutachter: Prof. Dr. M. Scheffner
Tag der mündlichen Prüfung: 28. September 2007
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in:
• M. Strerath, I. Detmer, J. Gaster, A. Marx "Modified oligonucleotides as tools for allele-specific amplification" Methods Mol. Biol. 2007, in press.
• D. Summerer, N. Z. Rudinger, I. Detmer, A. Marx “Enhanced DNA
Polymerase Mismatch Extension Fidelity by Directed Combinatorial Enzyme Design” Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 4712-4715 (Angew. Chem.
2005, 117, 4791-4794)
• Review: A. Marx, I. Detmer, J. Gaster, D. Summerer, "Probing DNA Polymerase Function with Synthetic Tools", Synthesis 2004, 1-14.
• I. Detmer, D. Summerer, A. Marx, "Substrates for Investigation of DNA Polymerase Function: Synthesis and Properties of 4’-C-Alkylated
Oligonucleotides" Eur. J. Org. Chem. 2003, 1837-1846.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 1
1.1 DNA – Träger der Erbinformation ...1
1.1.1 Nukleinsäuren als funktionale Werkzeuge...2
1.2 DNA-Polymerasen ...4
1.2.1 DNA-Polymerasen als funktionale Werkzeuge ...4
1.3 Biologische Funktion der DNA-Polymerasen...6
1.4 Strukturelle und funktionale Basis der DNA-Replikation...7
1.4.1 Protein-DNA-Interaktion im aktiven Zentrum ...8
1.4.2 Selektive Substratwahl ...10
1.4.3 Stereochemische Kontrolle der DNA-Biosynthese ...12
1.5 Gerichtete Evolution – Entwicklung von Proteinen mit neuen Eigenschaften ...14
2 Aufgabenstellung ... 18
3 Ergebnisse... 19
3.1 Einbau artifizieller Nukleotide durch DNA-Polymerasen...19
3.1.1 Einleitung ...19
3.1.1.1 Erweitertes Substratspektrum von DNA-Polymerasen ...19
3.1.1.2 L-Oligomere ...19
3.1.1.3 Therminator DNA-Polymerase...20
3.1.1.4 Pfu DNA-Polymerase...22
3.1.2 Ergebnisse...25
3.1.2.1 Synthese von Beta-L-2´-Thymidintriphosphat...25
3.1.2.2 Synthese modifizierter DNA-Oligonukleotide...25
3.1.2.3 Einbau von β-L-TTP...26
3.1.2.4 Stereospezifität der Therminator DNA-Polymerase...30
3.1.2.5 Modifikation der Pfu DNA-Polymerase ...34
3.1.2.6 Expression und Reinigung der Pfu DNA-Polymerase exo¯ A486Y...36
3.1.2.7 Substratspektrum der Pfu DNA-Polymerase exo- A486Y ...37
3.1.2.8 Konstruktion einer Mutantenbibliothek der Pfu DNA-Polymerase ...38
3.1.2.9 Screening der Mutanten-Bibliothek...43
3.1.3 Diskussion ...47
3.2 In vitro Kompartimentierung ...51
3.2.1 Einleitung ...51
Inhaltsverzeichnis
3.2.2 Ergebnisse...53
3.2.2.1 Reproduzierbare Herstellung der Kompartimente ...55
3.2.2.2 Expression der KF DNA-Polymerasen exo- durch das in vitro Transkriptions/Translations-System...57
3.2.2.3 Synthese des Selektionskonstrukts ...60
3.2.2.4 Aufbau eines sensitiven Selektions-Systems ...61
3.2.3 Diskussion ...63
3.3 Hybridisierung von DNA-Strängen mit artifiziellen Nukleotiden...66
3.3.1 Einleitung ...66
3.3.1.1 Schmelzpunktmessungen...66
3.3.1.2 Circular Dichroismus...66
3.3.1.3 4’-C-modifizierte Thymidinanaloga ...68
3.3.2 Ergebnisse...71
3.3.2.1 Schmelzpunktmessungen der Positionseffekte ...71
3.3.2.2 CD-spektroskopische Untersuchungen ...72
3.3.3 Diskussion ...73
3.4 Protein-DNA-Wechselwirkung von modifizierter Klenow-Fragment DNA- Polymerase exo¯...75
3.4.1 Einleitung ...75
3.4.2 Ergebnisse...77
3.4.3 Diskussion ...80
4 Zusammenfassung und Ausblick ... 81
5 Materialien ... 84
5.1 Chemikalien...84
5.2 Nukleotide und Radiochemikalien ...86
5.3 Standards und Kits ...86
5.4 Enzyme und Proteine ...86
5.5 Bakterienstämme...87
5.6 Plasmide...87
5.7 Medien und Zellkulturpuffer ...88
5.8 Oligonukleotide...89
5.9 Verbrauchsmaterialien...89
5.10 Geräte...89
Inhaltsverzeichnis
Allgemeine Methoden ...91
6.1 Reinigung und Quantifizierung von DNA...91
6.1.1 Agarose-Gelelektorphorese...91
6.1.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese...92
6.1.3 Isolierung von DNA aus Agarosegelen...92
6.1.4 Isolierung von DNA aus Polyacrylamidgelen ...93
6.1.5 Ethanolpräzipitation ...93
6.1.6 Quantitative Nukleinsäure Bestimmung...93
6.2 Enzymatische Reaktionen ...94
6.2.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)...94
6.2.2 5’-Phosphorylierung mit 32P ...95
6.2.3 DNA Sequenzierung ...95
6.3 Bakterienkulturen...96
6.3.1 Plattenkulturen...96
6.3.2 Flüssigkultur...96
6.3.3 Stammkulturen...96
6.3.4 Plasmidisolierung...96
6.3.5 Herstellung elektrokompetenter E. coli...97
6.3.6 Elektrotransformation von E. coli mit Plasmid DNA...97
6.3.7 Glycin SDS-PAGE Gelelektrophorese...97
6.3.8 Coomassie Färbung von SDS-PAGE Gelen ...99
6.3.9 Silberfärbung von SDS-PAGE Gelen ...99
6.4 Aktivitätsuntersuchungen von DNA-Polymerasen ...101
6.4.1 Primerverlängerungsreaktionen mit radiometrischer Produktanalyse ...101
6.4.2 Kinetische Untersuchungen mit radiometrischer Produktanalyse...101
6.5 Methoden Kapitel 3.1...102
6.5.1 Organische Synthese: L-Thymidin Triphosphat...102
6.5.2 Synthese modifizierter Oligodesoxynukleotide ...103
6.5.3 Error-Prone PCR ...104
6.5.4 Restriktionsverdau doppelsträngiger DNA...105
6.5.5 Dephosphorylierung des geschnittenen Vektors ...106
6.5.6 Ligation doppelsträngiger DNA...106
6.5.7 Kolonie PCR ...107
6.5.8 Expression und Reinigung von Pfu DNA-Polymerase exo-...107
6.5.8.1 Expression ...107
6.5.9 SYBR Green Assay für Präselektion ...107
6.6 Methoden Kapitel 3.2...108
Inhaltsverzeichnis
6.6.1 Emulsion ...108
6.6.2 In vitro Expression KF ...108
6.6.3 Aktivitätstest ...109
6.6.4 Eintopfreaktion ... 111
6.6.5 Ligations-Reaktion von KF-Gen und Haarnadelschlaufe ... 112
6.6.6 Immobilisierung Biotin Streptavidin ... 112
6.7 Methoden Kapitel 3.3...110
6.7.1 Circulardichroismus-Spektroskopie ...110
6.7.2 Thermische Denaturierungsstudien mit doppelsträngiger DNA...111
6.8 Methoden Kapitel 3.4...111
6.8.1 Bindungsstudien ...111
6.8.2 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese...111
7 Literaturverzeichnis ...113
8 Anhang...123
8.1 Oligonukleotidsequenzen ...123
8.2 Vektorkarten und Sequenzenz ...126
8.2.1 pET Pfu Expressions-Plasmid ...126
8.2.2 pASK Pfu Expressions-Plasmid...126
8.2.3 Pyrococcus furiosus DNA-Polymerase exo- A486Y, DNA- und Protein- Sequenz...127
8.2.4 pQKF Expressions Plasmid ...129
8.2.5 E. coli DNA-Polymerase I Klenow Fragment exo- DNA- und Protein-Sequenz ...129
8.3 Nomenklatur der natürlichen Aminosäuren ...132
8.4 Abkürzungen ...133
8.5 Danksagung ...137
8.6 Eidesstattliche Erklärung ...139
Einleitung
1 Einleitung
1.1 DNA – Träger der Erbinformation
Die Grundlage des Lebens beruht auf der Weitergabe der Erbinformation von einer Generation zur anderen. Dabei ist das gesamte Erbmaterial, das die Informationen für die Entwicklung und Fortpflanzung von Lebewesen enthält, in Form eines Polymers gespeichert, der Desoxyribonukleinsäure (DNA). Die Aufklärung der Doppelhelixstruktur der DNA im Jahre 1953 durch Watson und Crick1 führte zu ganz neuen Einsichten in die biologischen Vorgänge des Lebens und war ein entscheidender Schritt auf dem Weg zur Beantwortung der Frage „Wie funktioniert Leben?“. Rückblickend wurde mit dieser Entdeckung für viele Wissenschaftler das Zeitalter der molekularen Genetik eröffnet.
Die Doppelhelixstruktur der DNA besteht aus zwei Einzelsträngen, die sich umeinander winden. Jeder Einzelstrang ist aus zahlreichen aneinandergeknüpften Nukleotid-Bausteinen aufgebaut, die aus einer 2’-Desoxyribose-Einheit, einer Purin- oder Pyrimidin-Base und einer Phosphatgruppe bestehen. Natürliche DNA verwendet nur vier verschiedene Bausteine, Adenosin (A), Thymidin (T), Guanosin (G) und Cytidin (C), die sich ausschließlich in der Base unterscheiden. Die einzelnen Bausteine sind über eine Phosphodiesterbrücke miteinander verbunden. Die Zuckerphosphate bilden dabei das Rückgrat der DNA, während die Basen in das Innere der Helix zeigen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der DNA-Doppelhelix. Die beiden Stränge der DNA verlaufen ‚antiparallel’
und sind über Wasserstoffbrücken zwischen den Watson-Crick-Basenpaaren A-T und CG verbunden. Kugel = 2’- desoxy-Riboseeinheit
Einleitung
Die beiden Einzelstränge der Helix sind über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den gegenüberliegenden Basenpaaren verbunden. Dabei steht ein A immer einem T gegenüber und ein C immer einem G.
Die primäre Funktion der DNA besteht in der Speicherung der genetischen Information.
Diese ist durch die Reihenfolge (Sequenz) der Basen in den DNA-Strängen verschlüsselt.
Ein Block von drei Nukleotiden auf der DNA steht für eine Aminosäure im Protein und wird als Triplett oder Codon bezeichnet. Aus vier unterschiedlichen Nukleotiden lassen sich 43 = 64 Dreierkombinationen bilden, die die 20 natürlichen Aminosäuren kodieren.
Die Zuordnung, welches Triplett für welche Aminosäure kodiert, wurde in den sechziger Jahren des letzten Jahrhunderts geleistet. Durch die Entwicklung der chemischen Synthese von Nukleinsäuren durch Todd et al.2 gelang es Khorana et al. mit seinem Phosphodiesterverfahren, definierte Trimerblöcke und davon abgeleitete kurze repetitive DNA-Sequenzen zu synthetisieren, mit deren Hilfe die Entschlüsselung des genetischen Codes ermöglicht wurde3,4. Der experimentelle Durchbruch zur Beantwortung dieser Frage gelang 1961 durch Matthaei und Nirenberg, die das erste Codon (UUU → Phenylalanin) aufklären konnten5,6. Die vollständige Identifizierung aller 64 möglichen Tripletts stellte einen weiteren signifikanten Fortschritt in der Molekularbiologie dar.
Die Gesamtheit der DNA eines Organismus, das Genom, enthält den vollständigen Bauplan jedes Lebewesens. Die exakte Weitergabe der genetischen Information von Zelle zu Zelle und von Generation zu Generation ist daher von zentraler Bedeutung. Dieser
„Kopiervorgang“ des gesamten Erbmaterials wird als Replikation bezeichnet und erfolgt durch sukzessive, templatabhängige DNA-Synthese aus den vier natürlichen 2’- Desoxynukleotidtriphosphaten nach den Basenpaarungsregeln von Watson und Crick. Das für diesen Prozess verantwortliche Enzym wird als DNA-Polymerase bezeichnet.
1.1.1 Nukleinsäuren als funktionale Werkzeuge
In den letzten Jahren wurden die Bemühungen intensiviert, Nukleinsäuren für diagnostische und therapeutische Zwecke zu nutzen. Die Synthese von DNA-Molekülen, die an regulatorischen Sequenzen innerhalb des Genoms binden können und somit die Expression bestimmter Gene verhindern, bietet die Möglichkeit der Entwicklung neuer Medikamente für Krankheiten, bei denen ein einzelnes Protein maßgeblich an der Entstehung einer Erkrankung beteiligt ist. Aber auch die Möglichkeit, auf diese Weise die Expression von Virus-DNA im menschlichen Organismus zu unterbinden, eröffnet einen neuartigen Ansatz zur Behandlung vieler Viruserkrankungen. Der Einsatz kurzer DNA-Fragmente als
Einleitung
Therapeutika findet bereits in der Antigen- und Antisense-Therapie7 Anwendung, sowie in der Aptamer-Technologie8.
Die Expression von Proteinen erfolgt über zwei Schritte. Im ersten Schritt wird die DNA in mRNA transkribiert und im zweiten Schritt wird die mRNA in ein Protein translatiert.
Bei der Antigen-Strategie bindet ein von außen zugegebenes Oligonukleotid selektiv an einem Ziel-Gen und blockiert dadurch die Transkription der mRNA. Dadurch kann die Expression eines bestimmten Proteins verhindert werden. Bei der Antisense-Technologie erfolgt die Blockade auf RNA-Ebene. Ein von außen zugegebenes Oligonukleotid bindet selektiv an eine Ziel-mRNA und verhindert die Translation des dazugehörigen Proteins.
Auf diese Weise besteht prinzipiell die Möglichkeit jedes pathogene Molekül durch maßgeschneiderte DNA-Moleküle auszuschalten. Erste Medikamente, die auf dem Antisense-Ansatz beruhen, sind bereits auf dem Markt, beispielsweise gegen den viralen Erreger der Netzhautentzündung9.
Bei Aptameren handelt es sich um kurze, dreidimensional gefaltete DNA- oder RNA- Moleküle, die andere Nukleinsäuren oder Proteine, aber auch kleine organische Moleküle oder Metallionen hochspezifisch erkennen und daran binden können10-12.
Der Vorteil dieser Technologien besteht in der Möglichkeit des rationalen Designs der Oligomere, gemäß den Watson-Crick-Basenpaarungsregeln. Darüber hinaus sind Nukleinsäuren sehr einfach verfügbar und können mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit durch automatisierte Prozesse synthetisiert werden.
Wichtige Faktoren für die effektive Verwendung von therapeutischen Oligomeren sind Nukleaseresistenz. Das Problem bei der Nutzung natürlicher Oligomere in Zellen besteht im metabolischen Abbau. Um die Halbwertszeit der Oligonukleotide in vivo zu erhöhen, wird oftmals mit modifiziertem Phosphodiesterrückgrat (Thiophosphate, PNA, LNA) oder modifizierten Nukleosiden gearbeitet. Eine Alternative dazu bietet die Verwendung von L- Oligomeren, die durch ihren spiegelbildlichen Aufbau gegen den enzymatischen Abbau resistent sind. Dieser Ansatz wird in der Aptamer-Technologie bereits verfolgt13,14.
Auch von Seiten der Materialwissenschaften wuchs in den letzten Jahren das Interesse an DNA-Molekülen. Die flexible Struktur der DNA findet Anwendung in der Nanotechnologie15,16. Auf diesen Bereich wird jedoch in dieser Arbeit nicht weiter eingegangen.
Einleitung
1.2 DNA-Polymerasen
Die gesamte, in der Natur vorkommende DNA-Synthese wird durch DNA-Polymerasen katalysiert. Seit der Entdeckung der DNA-Polymerase durch A. Kornberg17 1958, sind eine stetig wachsende Zahl an strukturell und funktional unterschiedlichen DNA-Polymerasen, aus den drei großen Domänen des Lebens (Eukarya, Bakteria und Archaea), beschrieben worden18,19. Auf Basis von Sequenzhomologien wurden die bisher identifizierten DNA- Polymerasen domänenübergreifend in sieben verschiedene Familien unterteilt: A, B, C, D, X, Y und Reverse Transkriptasen20. Zwischen den sieben Hauptgruppen konnten unterschiedliche Aufgabenbereiche der Polymerasen zugeordnet werden. So scheinen DNA- Polymerasen der Familie B, C und D an der Replikation chromosomaler DNA beteiligt zu sein, während Familie A DNA-Polymerasen die Replikation mitochondrieller DNA katalysieren20,21. Mitglieder der Familie Y zeichnen sich dadurch aus, dass sie über DNA- Schäden im Templatstrang hinwegsynthetisieren können.
Die intrinsische Genauigkeit (Selektivität) bezüglich der Substratwahl nach der Watson- Crick-Basenpaarung dieser Enzyme, ist von essentieller Bedeutung für die genaue Replikation der DNA17,22 und damit auch für die korrekte Weitergabe der Erbinformation. Es konnten DNA-Polymerasen mit sehr hohen Genauigkeiten (ein Fehler pro eine Million synthetisierter Basenpaare) bei replikativen DNA-Polymerasen gefunden werden, genauso wie Enzyme mit extrem hohen Fehlerraten bei verschiedenen Reparatur-DNA-Polymerasen.
Trotz der Bemühungen vieler Wissenschaftler aus unterschiedlichen Bereichen, die Selektivitätsmechanismen dieser Enzyme zu entschlüsseln, wird der molekulare Mechanismus der hohen Substrat-Selektivität von DNA-Polymerasen, aber auch die großen Unterschiede in dieser Selektivität zwischen den einzelnen Polymerase-Familien immer noch diskutiert23-26.
Bisher gewonnene Erkenntnisse über die Mechanismen und Selektivität von DNA- Polymerasen haben zur Entwicklung zahlreicher molekularbiologischer Techniken beigetragen, durch deren Hilfe die Produktion, Modifikation und Analyse von DNA möglich wurde. Durch den Einsatz von DNA-Polymerasen in molekularbiologischen Methoden, wie beispielsweise der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)27 und der DNA-Sequenzierung28, sind diese Enzyme zu Schlüsselenzymen in der Biotechnologie geworden.
1.2.1 DNA-Polymerasen als funktionale Werkzeuge
Die Fertigstellung der Projekte zur Entschlüsselung der Rohsequenz des menschlichen
Einleitung
Doppelhelixstruktur und der Identifizierung des genetischen Codes einen weiteren Meilenstein in der Wissenschaft des Lebens dar. Ermöglicht wurde dieser Erfolg erst durch die Entwicklung zweier auf DNA-Polymerasen basierender Methoden. Zum einen auf der Vervielfältigung von DNA-Fragmenten und zum anderen auf der Analyse von DNA- Fragmenten.
Das von Sanger 1977 entwickelte Verfahren zur Sequenzierung von DNA beruht auf dem Einbau von 2’-3’-Didesoxynukleosidtriphosphaten (ddNTP) durch DNA-Polymerasen. Durch rationales Design konnten DNA-Polymerase-Varianten mit drastisch erhöhter Einbaueffizienz, der für die Methode benötigten ddNTPs, selektiert werden, die die schnelle Sequenzierung humaner und anderer Genome ermöglichen31,32.
Die von Mullis im Jahre 1983 entwickelte Polymerase-Kettenreaktion (PCR) stellt heute eine unverzichtbare Methode in Molekularbiologie und Gendiagnostik dar. Mit ihrer Hilfe lassen sich geringe Mengen DNA in kürzester Zeit so stark vervielfältigen, dass sie problemlos nachweisbar, analysierbar und/oder weiterverwendbar sind. In den letzten Jahren ist diese Methode in vielfältiger Weise weiterentwickelt worden und es sind neue Anwendungen zu der ursprünglichen einfachen Vervielfältigung hinzugekommen. Dazu gehört, unter anderem, die Diversifizierung von Genen für die Erstellung von Proteinmutantenbibliotheken33, oder die Quantifizierung von Erreger-DNA in klinischen Proben34,35. Ein großer Bereich der Anwendung der PCR-Methode stellt die Gen-Diagnostik dar. Das reicht von der Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen (Populationsgenetik, Vaterschaftstests) bis hin zur Erstellung von DNA-Fingerabdrücken in der Forensik36.
In den letzten Jahren hat besonders die Identifizierung von Einzelnukleotidpolymorphismen (single nucleotide poymorphisms, SNP)37,38 an Bedeutung gewonnen. Dabei handelt es sich definitionsgemäß um Abweichungen der Genomsequenz, die in mehr als 1 % der Bevölkerung auftreten. Im Humangenomprojekt wurden ungefähr 1,4 Millionen SNPs identifiziert, von denen bereits viele mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden konnten.
Ein bekanntes Beispiel ist die Sichelzellenanämie, die in weiten Teilen Afrikas auftritt.
Darüber hinaus stehen SNPs im Zusammenhang mit unterschiedlichen Verträglichkeiten von Arzneimitteln durch Patienten. Unter den Techniken zur Identifizierung von SNPs finden sich auch wieder zahlreiche Methoden, die auf der Verwendung von DNA-Polymerasen beruhen.
Neben den PCR-Methoden wie Light-Cycler und TaqMan-Assay befinden sich auch Techniken die auf der selektiven Primerverlängerung beruhen. Beispiele dafür sind Minisequencing39,40, Pyrosequencing41 oder die allelspezifischen Amplifikation (ASA)42,43.
Einleitung
Darüber hinaus werden Enzyme für biotechnologische, therapeutische oder industrielle Anwendungen weiter optimiert, wie beispielsweise für den Einsatz bei Sequenzierungen oder bei der in vitro Mutagenese44-48.
1.3 Biologische Funktion der DNA-Polymerasen
Die in der Natur vorkommende DNA-Synthese wird ausschließlich von DNA-Polymerasen katalysiert, erfolgt aber im Zusammenspiel mit einer Vielzahl zusätzlicher Proteine. DNA- Synthese durch Polymerasen findet man bei drei zentralen Prozesse, der DNA-Replikation, der DNA-Reparatur und der DNA-Rekombination17.
Anhand des gut untersuchten bakteriellen Organismus Escherichia coli (E. coli) soll die DNA- Replikation exemplarisch dargestellt werden. In Bakterienzellen gibt es fünf verschiedene DNA-Polymerasen (DNA-Polymerase I, II, III, IV und V) mit unterschiedlichen Strukturen und Funktionen49. Für die replikative DNA-Synthese, durch einen multimeren Protein Komplex, dem Replisom50, ist hauptsächlich die DNA-Polymerase III verantwortlich. Nach Beginn der Entwindung der DNA-Doppelhelix am Replikationsursprung oriC, entwindet die ATP- getriebene DNA-Helikase (DnaB) den Duplex in beide Richtungen51. Durch die einzelstrang- bindenden SSB-Proteine (single strand binding protein) wird die entwundene DNA stabilisiert und beide Stränge können als Matrize dienen. Zur Einleitung der DNA-Synthese auf diesen Einzelsträngen, wird ein komplementärer RNA-Primer benötigt. Dieser wird durch eine Kombination aus DnaB und einer Primase synthetisiert, dem Primosom. Ausgehend von diesen Primern verläuft die Synthese durch das Replisom in 5’-3’ Richtung, wobei die Replikationsgabel entsteht. Das Replisom umfasst zwei multimere DNA-Polymerase III Komplexe, die Leit- und Folgestrang replizieren, während gleichzeitig die SSB-Proteine verdrängt werden.
Die hohe Prozessivität des Holoenzyms beruht auf der β-Untereinheit (β-sliding clamp) (siehe Abbildung 2). Dabei handelt es sich um ein ringförmiges Proteindimer, das den DNA- Duplex umgreift und auf diese Weise die Affinität der DNA-Polymerase zur DNA erhöht. Das führt zu einer gesteigerten Prozessivität von 10-15 auf über 5000 Nukleotide. Am Folgestrang löst sich der Komplex nach Bildung eines Okazaki-Fragments von der DNA und kann erst dann mit einem neuen Primer/Templat-Komplex reassoziiert werden. Das wird durch den γ-clamp loader ermöglicht, der die β-Untereinheit öffnet und wieder mit einem neuen Primer/Templat-Komplex belädt50.
Die Synthese des Leitstrangs erfolgt kontinuierlich in 5’-3’ Richtung, wohingegen sich der Folgestrang hinter der Replikationsgabel erstreckt und daher diskontinuierlich aus so
Einleitung
genannten Okazaki-Fragmenten erfolgt. Die Synthese der einzelnen Okazaki-Fragmente wird auch wieder durch RNA-Primer eingeleitet.
Abbildung 2.Schematische Darstellung der Replikationsgabel mit beteiligten Proteinen während der in E. coli stattfindenden DNA-Replikation. Die Abbildung wurde Referenz52 entnommen.
Nach der DNA-Synthese werden die RNA-Primer durch die 5’-3’ Exonukleaseaktivität der E.
coli DNA-Polymerase I entfernt. Die entstandenen Lücken im Tochterstrang werden dann von der Polymeraseaktivität des Enzyms aufgefüllt. DNA-Ligasen katalysieren abschließend die Verknüpfung der einzelnen Fragmente.
Die DNA-Synthese in Eukarya und Archaea unterscheidet sich in einigen Punkten von denen der Bakteria und ist insgesamt komplexer. In Eukaryonten sind bis heute sechzehn Polymerasen bekannt. Mindestens vier davon sind an der Replikation beteiligt (Pol α, δ, ε und γ (mitochondrial)). In den grundlegenden Mechanismen erfolgt aber die Polymerisation von Nukleotiden in Eukarya und Archaea nach dem gleichen Schema und wird daher in diesem Rahmen nicht weiter erläutert.
1.4 Strukturelle und funktionale Basis der DNA-Replikation
Die Bindung von Polymerasen an DNA spielt eine zentrale Rolle in allen Aspekten der genetischen Aktivität innerhalb eines Organismus, wie beispielsweise bei der Transkription
Einleitung
einzelner Gene, der Reparatur beschädigter Sequenzen oder der Replikation kompletter Genome. Die Spezifität der Bindung erfolgt dabei auf atomarer Ebene durch Interaktionen bestimmter Seitenketten des Proteins mit den Nukleotiden der DNA. Durch Kristallstrukturanalysen von ternären und quaternären Komplexen aus DNA-Polymerasen, Primer/Templat-Komplex und dNTPs53-59, sowie aus funktionalen Studien60 konnte in den letzten Jahren bedeutende Fortschritte im Verständnis der Replikationsmechanismen von DNA-Polymerasen erzielt werden.
1.4.1 Protein-DNA-Interaktion im aktiven Zentrum
Die Katalyse der Phosphodiesterbindung zwischen der 3’-Hydroxylgruppe des Primerendes und dem eintretenden Triphosphat erfolgt über einen Zwei-Metallionen-Mechanismus. Die DNA-Polymerase katalysiert sukzessive die Verknüpfung von einem der vier natürlichen dNTPs an die 3’-OH-Gruppe des Primers durch nukleophile Substitution. Dabei wird ein Pyrophosphat freigesetzt. Die durch die Carboxylatreste der DNA-Polymerase koordinierten Magnesiumionen bewirken eine Erhöhung der Elektrophilie der α-Phosphatgruppe des eintretenden dNTPs15. Dabei wird ein SN2-typischer Übergangszustand angenommen (Abbildung 3), der durch die beiden Metallionen stabilisiert wird.
O P
O O
O O C
O
O O T
HO P
O O
G O
P
O O
O P O O
O O
A O
P O O
O
P O O
O O
O O O
O O O O
O H OH
Mg2+
Mg2+
dNTP Primer
Templat
Abbildung 3. Schematische Darstellung des Zwei-Metallionen-Mechanismus bei der DNA-Synthese. Gezeigt wird das aktive Zentrum, in dem zwei zweiwertige Metallionen von den katalyse-essentiellen Carboxylatresten der DNA-Polymerase, der 3’-OH-Gruppe des Primerendes und der drei Phosphatgruppen des eintretenden dNTPs koordiniert werden. Auf diese Weise stabilisieren die Metallionen den Übergangszustand, und die 3’-OH-Gruppe des Primers wird für den nukleophilen Angriff auf die α-Phosphatgruppe des dNTP aktiviert. Die Abbildung wurde Referenz15 entnommen.
Unabhängig von ihrer sequenzbasierten Einteilung in unterschiedliche Polymerase-Familien, folgen die meisten bisher bekannten DNA-Polymerasen einem gemeinsamen Schema des funktionalen Aufbaus. Dieser lässt sich mit einer rechten Hand vergleichen, die den DNA- Duplex umgreift. Der Aufbau besteht aus drei Untereinheiten, der Handflächen-, Finger- und
Einleitung
Daumen-Domäne, die eine Bindungsspalte für die DNA bilden (Abbildung 4). Die Untereinheiten sind sowohl an der Bindung des Primer/Templat-Komplexes, als auch der eintretenden dNTPs beteiligt. Dabei kommt es zu intensiven Kontakten zwischen der Daumen-Untereinheit und der kleinen Furche der DNA. Die Aufgabe des Daumens scheint in der Positionierung des DNA-Duplexes und in der Prozessivität der Polymerase zu liegen. Die Funktion der Finger-Domäne scheint hauptsächlich in der Wechselwirkung mit dem eintretenden dNTP und der Templatbase zu bestehen. Das aktive Zentrum der Polymerase setzt sich aus der Finger- und Handflächen-Untereinheit zusammen. In Abwesenheit von dNTPs liegt das Enzym zusammen mit der DNA-Matrize in einer offenen Konformation vor, wodurch das aktive Zentrum vom 3’-Ende des Primers abgewendet ist. Während die Handflächen-Domäne, bestehend aus einer β-Faltblatt Struktur, unter den Polymerase- Familien eine sehr große Homologie aufweist, unterscheiden sich die Finger- und Daumen- Untereinheiten sehr stark zwischen den einzelnen Familien61-63. Das aktive Zentrum weist drei hoch konservierte Strukturmotive auf (A, B und C), die sich in allen replikativen DNA- und RNA-abhängigen Polymerasen wieder finden. Motiv A und C präsentieren unter anderem die für die Katalyse essenziellen Aspartat-Reste.
Einleitung
B
A C
Abbildung 4. Struktur der offenen Konformation von Bst (Bacillus stearothermophilus) DNA-Polymerase im Komplex mit dem Primer- und Templatstrang (PDB-Eintrag 2BDP)64. Die DNA ist als Connolly Solvenszugänglichkeitsoberfläche mit einem Sondenradius von 1.4 Å für Wasser dargestellt, der Templatstrang ist gelb gezeigt, der Primerstrang ist orange gefärbt. Das Protein ist als graue Ribbon-Darstellung dargestellt, mit den drei hochkonservierten Motiven (Motive A, B und C) in rot. Das aktive Zentrum befindet sich am Ende des blauen Pfeils. Im unteren Bereich befindet sich die Handflächendomäne, Daumen- und Fingerdomäne befinden sich jeweils links und rechts der DNA.
1.4.2 Selektive Substratwahl
Die DNA-Polymerase katalysiert die Bildung einer Phosphodiesterbrücke bevorzugt, wenn die Base des neuen Nukleotids zu der Base auf dem Elternstrang komplementär ist, d.h. der Watson-Crick-Paarung entspricht. Seit Watson und Crick die Doppelhelixstruktur der DNA aufgeklärt haben, wurde allgemein angenommen, dass die Ausbildung eines bestimmten Musters an Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen entscheidend für die Selektivität der DNA-Polymerasen ist. Verschiedene Studien in den letzten Jahren haben untersucht, ob es sich dabei um das einzige Unterscheidungskriterium für den Einbau von kanonischen oder nicht kanonischen Triphosphaten handelt. Dabei wurde das Modell des sterischen Ausschlusses entwickelt65. Danach ist das aktive Zentrum der DNA-Polymerase relativ starr und weist eine Bindungstasche von spezifischer Größe und Form auf (Abbildung 5).
Einleitung
Abbildung 5. Darstellung sterischer Kollisionen im aktiven Zentrum. Die DNA-bindende Spalte in der Polymerase umfasst den Templatstrang sehr eng und lässt nur eine Aussparung für das Triphosphat, die durch die Polymerase und die Templatbase bestimmt wird. Abbildung aus Referenz15 entnommen.
Diese Tasche kann vier unterschiedliche Formen habe, da sie durch die Struktur der Polymerase und der Basen des Templatstrangs definiert wird. Die vier natürlichen dNTPs unterscheiden sich in Gesamtgröße und ~geometrie, so dass die DNA-Bindungstasche ausschließlich zum jeweils kanonischen Substrat formkomplementär ist55,56,66-69. Das Eintreten von nicht kanonischen Nukleotiden führt zu sterischen Spannungen in der Bindungstasche, die den Einbau verhindern. Von Kool durchgeführte funktionale Untersuchungen sollten klären, in welchem Maße die Ausbildung von Wasserstoffbrücken und die Selektion der dNTP-Gesamtgeometrie zur Einbauselektivität von DNA-Polymerasen beitragen. Dafür wurden unpolare Nukleosid-Isostere synthetisiert, die die Größe und Form der natürlichen Nukleoside und Nukleotide so gut wie möglich imitieren, aber nicht in der Lage sind, Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden15,70,71 (Z, F, Abbildung 6A). Diese Nukleotid-Analoga ermöglichen eine Bewertung der polaren Wechselwirkungen ohne oder mit nur geringfügiger Störung durch sterische Effekte. Es konnte gezeigt werden, dass das Thymidin-Isoster mit hoher Effizienz und Selektivität von einigen DNA-Polymerasen gegenüber einem kodierenden A eingebaut wird und umgekehrt auch als Templatbase für den effizienten und selektiven Einbau des natürlichen dATP kodiert72.
Auf der Suche nach einem dritten Basenpaar zur Erweiterung des genetischen Codes, haben auch Schultz und Romesberg eine Vielzahl von Nukleosidanaloga entwickelt, die nicht zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken befähigt sind, aber trotzdem hybridisieren und effizient eingebaut werden können73-76. Besonders das Propinylcarbostyryl-Basenanalogon (PICS) konnte von dem Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I (exo-) selektiv und effizient gegenüber einem anderen PICS eingebaut werden (Abbildung 6B).
Einleitung
Abbildung 6. Schematische Darstellung von Nukleosidsonden zur Untersuchung des Beitrages der Wasserstoffbrücken an der Erkennung der dNTPs zur Selektivität der enzymatischen DNA-Polymerisation.
Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht ausschließlich das Wasserstoffbrückenmuster für die Substraterkennung verantwortlich ist. Unterstützt wird die selektive Substratwahl durch eine sterische Vorgabe, bestehend aus einer Bindungstasche, die von der DNA-Polymerase und Templatbase gebildet wird.
1.4.3 Stereochemische Kontrolle der DNA-Biosynthese
1848 entdeckt Louis Pasteur in Paris das Phänomen von Bild und Spiegelbild in der Chemie bei der Untersuchung von Weinsäure. Er erkannte, dass die Chemie des Lebens eine bevorzugte Händigkeit (Chiralität) besitzt und äußerte vor der französischen Akademie der Wissenschaft die Vermutung: „L’Univers est dissymétrique“77. Seine Vermutung erwies sich als wahr in einem größeren Ausmaß als er es sich hätte vorstellen können. Wie uns heute bekannt ist, erstreckt sich diese Dissymmetrie vom subatomaren bis hin zu makroskopischen Bereichen. Diese Erkenntnis hat weit reichenden Einfluss bis in unsere Zeit. Dieser zeigt sich unter anderem in der Entwicklung von Arzneimitteln.
Auch auf molekularbiologischer Ebene spielt Chiralität eine große Rolle. Die in der Natur vorkommenden „Moleküle des Lebens“ bestehen aus homochiralen Bausteinen. DNA und RNA sind aus D-Ribosezuckern aufgebaut und nicht aus den L-Zuckern. Proteine bestehen aus L-Aminosäuren. Warum sich in diesem Bereich eine bestimmte Chiralität durchgesetzt hat, ist unklar, aber sie wird sehr konsequent eingehalten. Eine allgemeingültige Regel besagt, dass Enzyme nur mit einem Enantiomer chiraler Substrate arbeiten und nur eine der enantiomeren Formen der chiralen Moleküle effektiv an der katalytischen Stelle gebunden wird77.
Einleitung
Die DNA bildet eine Doppelhelixstruktur bestehend aus Desoxyribonukleinsäuren. Die Zuckereinheit dieser Bausteine kann in zwei enantiomeren Formen vorkommen, die zueinander wie Bild und Spiegelbild sind (Abbildung 7). In lebenden Organismen wird allerdings nur eines der beiden Enantiomere verwendet, die β-D-Ribose.
Abbildung 7. Schematische Darstellung der beiden stereoisomeren Thymidine, die sich durch die Chiralität der Riboseeinheit unterscheiden. In der Natur kommt nur ein Enantiomer vor, dabei handelt es sich um den D- Desoxyribose Zucker.
Die Frage nach dem Ursprung der stereochemischen Kontrolle der DNA-Biosynthese, d.h.
wie die Natur die Homochiralität der DNA-Biosynthese während der Evolution erreicht und beibehalten hat, und auf welcher Stufe der Evolution die Homochiralität eingeführt wurde, konnte bisher jedoch noch nicht geklärt werden78. Auch der Grund, warum sich D-Zucker und L-Aminosäuren in der Evolution durchgesetzt haben, ist nicht bekannt. Es gibt keinen chemischen Grund, warum L-Nukleinsäuren oder D-Aminosäuren weniger effizient sein sollten als ihre Spiegelbilder, da Enantiomere nahezu dieselben physikochemischen Eigenschaften besitzen77. Es wurden bisher aber noch keine Organismen entdeckt, die das stereoisomere DNA-Analogon verwenden. Die Synthese von L-DNA durch bekannte, in der Natur vorkommende DNA-Polymerasen erscheint aber auch unwahrscheinlich. Zu den Hauptgründen dafür zählt sicher die Notwendigkeit der Korrespondenz zwischen den Geometrien der aktiven Zentren von DNA-Polymerasen und den 2’-deoxy-β-D-Riboseresten der dNTPs. Da die korrekte Replikation der Nukleinsäuren von der Enzymaktivität abhängig ist, scheint die relative Chiralität von Proteinen und Nukleinsäuren eng miteinander verknüpft zu sein.
Abgesehen von dem mechanistischen Interesse an der enzymatischen Synthese von L- Oligomeren, besteht auch ein anwendungsbezogenes Interesse an L-DNA. Diese zeichnet sich durch außerordentliche Resistenz gegen den Abbau durch Nukleasen aus79. Daher erscheinen diese Moleküle als vielversprechende Reagenzien für viele pharmazeutische Anwendungen, wie beispielsweise in der Antisense- oder Antigen-Technologie. Bisher ist nur
Einleitung
wenig bekannt über die strukturellen und thermodynamischen Eigenschaften von DNA aus solchen modifizierten Nukleotiden.
1.5 Gerichtete Evolution – Entwicklung von Proteinen mit neuen Eigenschaften
Die materielle Basis natürlicher Evolution ist die Ebene der DNA. Zufällig auftretende Fehler während des Vorgangs der DNA-Replikation führen zu einer Veränderung der Genomsequenz. Durch diese Mutationen entstehen unterschiedliche Varianten des Genoms, die veränderte oder neue Merkmale bewirken. Diese können sowohl positiven als auch negativen Einfluss auf die evolutionäre „Fitness“ des entsprechenden Organismus haben80,81. In der Natur setzen sich allerdings nur die Varianten durch, die zu einem Vorteil gegenüber der Konkurrenz führen und sich somit positiv auf die evolutionäre Fitness auswirken.
Im Labor dagegen besteht die Möglichkeit einer zielgerichteten Evolution, die nicht mehr auf das Überleben eines Organismus angelegt ist, sondern darauf, die Eignung von Enzymen für spezielle Anwendungen zu optimieren. Dabei werden besonders zentrale Eigenschaften, wie Substratspezifität (auch von unnatürlichen Substraten), Katalysemechanismen oder Temperaturstabilitäten gezielt modifiziert. Die Wertung, ob eine vor- oder nachteilige Mutation stattgefunden hat, basiert hier nicht mehr auf den besseren „Überlebenschancen“
eines Organismus in seiner natürlichen Umgebung82, sondern wird durch den Experimentator festgelegt.
Durch die stetig wachsende Anwendung von Enzymen in molekularbiologischen Methoden, in der Gen-Diagnostik und Biomedizin83 und in der chemischen Industrie als Biokatalysatoren82,84, haben sich die Anforderungen an die Enzyme in den künstlichen Umgebungen stark verändert und machen die Suche nach Zweck-optimierten Enzym- Varianten notwendig. Die Funktionsweise von Proteinen ist allerdings sehr komplex, so dass das Entwickeln neuer oder verbesserter Eigenschaften durch rationales Design von Protein- Mutanten sehr schwer ist. Alternativ wurde die gerichtete Evolution von Proteinen durch Randomisierung der gesamten Gensequenz als erfolgreiches Werkzeug zur Verbesserung von Eigenschaften wie Stabilität, Aktivität und Selektivität in Enzymen entwickelt82.
Bei der gerichteten Evolution handelt es sich um eine Kombination aus Mutagenese, Expression tausender Enzym-Mutanten und Hochdurchsatz-Testsystem. Im ersten Schritt muss eine Mutanten-Bibliothek erzeugt werden. Durch die Fortschritte in der Molekularbiologie ist es einfacher geworden, Proteinvarianten auf DNA-Ebene zu erzeugen und damit die notwendige Diversität für Enzymbibliotheken sicherzustellen. Die DNA-
Einleitung
Sequenz des gewünschten Proteins wird randomisiert. Als nächstes folgt die Expression der Mutanten. Dabei ist es wichtig, dass jede einzelne Proteinmutante ihrer DNA-Sequenz zugeordnet werden kann. Auf Protein-Ebene werden die Mutanten dann auf die gewünschten Eigenschaften hin untersucht. Positiv getestete Proteine werden selektiert und die dazugehörige DNA-Sequenz entweder charakterisiert oder in einer weiteren Evolutionsrunde eingesetzt (Abbildung 8).
Abbildung 8. Schematische Darstellung der allgemeinen Strategie zur Analyse geänderter Proteinfunktionen in großem Maßstab.
Diese Methode hat sich als sehr viel versprechendes Verfahren für die Evolution von Enzymen etabliert, ohne dass strukturelle oder mechanistische Informationen über das Enzym notwendig sind. Auf diese Weise konnten bereits eine Reihe von Enzym-Varianten mit verbesserter Substratselektivität, katalytischer Eigenschaft, Stabilität, pH-Optimum, Aktivität und erweitertem Substratspektrum unter verschiedenen physikalischen und chemischen Bedingungen identifiziert werden.
Für den Aufbau eines erfolgreichen Evolutions-Systems sind mehrere Punkte von essentieller Bedeutung: a) Gen–Diversifizierung85, b) die Verknüpfung des Genotyps mit dem Phänotyp, c) ein gutes Expressions-System und d) ein sensitives Hochdurchsatz-Testsystem (oder Selektionssystem).
Der erste Schritt in der gerichteten Evolution besteht in der Diversifizierung. Diversität kann erzeugt werden durch Einführung von Mutationen und/oder durch Rekombination. Die Einführung von Mutationen erfolgt durch die Anwendung geeigneter Mutagenese-Methoden.
Für Zufallsmutationen, wie beispielsweise Punktmutationen Deletionen, Insertion in einem ausgewählten Bereich oder innerhalb des gesamten Gens, hat sich in den letzten Jahren die error-prone PCR Methode etabliert. Des weiteren findet die von Stemmer beschriebene Rekombination von DNA-Sequenzen durch das sogenannte „DNA-shuffling“ Anwendung86,87. Die sorgfältige Anpassung der Mutationsraten in Kombination mit der Bibliotheksgröße ist
Einleitung
entscheidend für die Qualität der Bibliothek. In der Literatur beschrieben sind die Mutabilitäten für verschiedene DNA-Polymerasen88-90, wobei in den meisten Fällen die Aufmerksamkeit auf ein spezielles Motiv gerichtet ist.
Im zweiten Schritt muss eine Verknüpfung des Proteins mit seiner spezifischen DNA- Sequenz erreicht werden91. In den letzten beiden Jahrzehnten wurden einige Methoden entwickelt, um jede Protein-Variante mit seiner DNA-Sequenz zu verknüpfen. Diese basieren auf direkter Verknüpfung von DNA und Protein, auf räumlicher Zuordnung oder auf Kompartimentierung (das Protein und die dazugehörige DNA werden in einer Zelle, die gleichzeitig auch als Reaktionsraum dient, eingeschlossen).
Im Anschluss daran muss ein Testsystem entwickelt werden, das mit der Verknüpfung von Protein und DNA kompatibel ist und die gewünschte Eigenschaft auch detektieren kann.
Tabelle 1 zeigt im Überblick mehrere Methoden der Verknüpfung von Genotyp und Phänotyp und dem damit verwendeten Testsystem.
Tabelle 1. Verknüpfungsmethoden von Genotyp und Phänotyp in verschiedenen Testsystemen.
Methode Verknüpfung zwischen
Genotyp und Phänotyp
Testsystem
(Selektion oder Screening) Phage-Display-Technik Phagenpartikel Bindung an Affinitätsmatrix Ribosom-Display-Technik Ribosomenkomplex Bindung an Affinitätsmatrix mRNA-Peptid-Fusion Peptid-mRNA-Fusion Bindung an Affinitätsmatrix Peptid am Plasmid Peptid-Plasmid-Komplex Bindung an Affinitätsmatrix
Zelloberflächen-Display-
Technik Zelle Fluoreszenz-aktivierte
Zellsortierung (FACS) In vitro
Kompartimentierung Wasser-in-Öl Tröpfchen Bindung an Affinitätsmatrix, PCR Genetisches Testsystem Zelle Komplementation,
kolorimetrische Tests Mikrotiterplatten und
Proteinchips Räumliche Adressierung Radiometrisch, UV/Vis- Absorption oder Fluoreszenz
Dieser evolutionäre Prozess kann wiederholt werden, bis das Ziel erreicht wurde oder keine weiteren Verbesserungen mehr möglich sind.
Weitere Fortschritte auf den Gebieten der Biotechnologie und bioorganischen Chemie ermöglichen neben dem umfassenderen Verständnis über DNA-Polymerasen auch die Entwicklung neuer, auf DNA-Polymerasen basierender Methoden. Gerade in Bereichen der
37,38
Einleitung
Polymerasen zur enzymatischen Synthese artifizieller Biopolymere92-94 von großem Nutzen und Interesse sein.
Aufgabenstellung
2 Aufgabenstellung
Um die enzymatische Synthese artifizieller L-DNA zu untersuchen, sollte ein Selektionssystem aufgebaut werden, das die Evolution von DNA-Polymerasen bezüglich dieser Eigenschaften ermöglicht. Mit Hilfe eines Hochdurchsatz-Testsystems, das den Einbau von L-Nukleotiden sensitiv und spezifisch anzeigen kann, soll eine aufgebaute Polymerasenbibliothek durchmustert werden. Auf diesem Wege sollen neue Einblicke in die Stereospezifität von DNA-Polymerasen erhalten und eine Erweiterung des Substratspektrums erreicht werden. Die Verwendung von L-Nukleotiden sollte am Beispiel von L-Thymidinen untersucht werden, da diese synthetisch am einfachsten zugänglich waren.
Zusätzlich sollten Untersuchungen zu Protein-DNA-Interaktionen durchgeführt werden. Um die Eignung 4’-C modifizierter Nukleotide als Werkzeug in funktionalen Studien von DNA- Polymerasen zu untersuchen, sollte der Einfluss von Modifikationen im DNA-Strang auf essentielle Eigenschaften wie Stabilität und Konformation des Duplex, und damit auf die Wechselwirkung mit der Polymerase untersucht werden.
Darüber hinaus sollte auch der Einfluss von Sequenzmodifikationen in Polymerasen auf die Affinität des Enzyms zum Substrat untersucht werden, um Rückschlüsse auf erhöhte Genauigkeit der Fehlpaarungsverlängerung von Polymerase-Mutanten ziehen zu können.
Ergebnisse
3 Ergebnisse
3.1 Einbau artifizieller Nukleotide durch DNA-Polymerasen
3.1.1 Einleitung
3.1.1.1 Erweitertes Substratspektrum von DNA-Polymerasen
Kristallstrukturen von DNA-Polymerasen ähneln der Form einer menschlichen Hand, bestehend aus drei Domänen. Dazu gehört die Fingerdomäne, die an der Bindung eintretender Nukleotide beteiligt ist und mit dem einzelsträngigen Templat wecheselwirkt. Es gibt die Handflächen-Domäne, die die katalytischen Aminosäurereste enthält und ebenfalls an der Bindung eintretender Nukleotide beteiligt ist, und es gibt die Daumen-Domäne, die die doppelsträngige DNA bindet95. Demnach haben zwei Domänen direkten Kontakt mit dem eintretenden Nukleotid und regulieren die Selektivität und das Substratspektrum von DNA- Polymerasen. Die Fingerdomäne besteht aus zwei α-Helices, die über eine Schlaufe miteinander verbunden sind. Dieser Bereich in der DNA-Polymerase ist dafür verantwortlich, dass nur korrekte Nukleobasen gegenüber den komplementären Nukleobasen im Templatstrang eingebaut werden96
3.1.1.2 L-Oligomere
Die stereochemische Kontrolle der DNA-Biosynthese im aktiven Zentrum der DNA- Polymerase konnte noch nicht geklärt werden. Aber aufgrund der interessanten Anwendungsmöglichkeiten von L-Polymeren aufgrund ihrer Resistenz gegen metabolischen Abbau, und der ungelösten Frage nach dem Mechanismus der stereochemischen Kontrolle gab es in den letzten Jahren viele Untersuchungen in diesem Bereich77,97,98. Anhand einiger Beispiele konnte gezeigt werden, dass mehrere Zucker-modifizierte β-L-ddNTPs durch das aktive Zentrum von DNA-Polymerasen gebunden werden und die entsprechenden L- Nukleotid-Reste am 3’-Ende des Primers mit ähnlichen kinetischen Konstanten eingebaut werden können wie die natürlichen β-D-dNTPs99,100. Ein Beispiel für effizienten Einbau ist (-)- β-L-2’,3’-didesoxy-3’-thiacytidine, ein Arzneimittel bei der Behandlung von AIDS Patienten101. Über den Einbau unmodifizierter L-dNTPs gab es dagegen zu Beginn dieser Arbeit kontroverse Aussagen78. Einige Autoren konnten eine Verlängerung des Primers um ein bis
Ergebnisse
drei modifizierte Nukleotide durch verschiedene DNA-Polymerasen beobachten102. Maga et al. konnten zeigen, dass die Reverse Transkriptase aus HIV-1 (human immunodeficiency virus-1) L-dTTP binden und in homopolymere Primer/Templat-Komplexe einbauen kann102. Andere Gruppen dagegen konnten diesen Einbau durch templatabhängige DNA- Polymerasen nicht beobachten103.
In Voruntersuchungen zu dieser Arbeit wurde die Eignung neun unterschiedlicher DNA- Polymerasen bezüglich der Akzeptanz unmodifizierter L-Nukleotiden getestet. Daraus ergab sich die Therminator DNA-Polymerase als vielversprechender Kandidat, die zusammen mit der strukturverwandten Pfu DNA-Polymerase in Folgeuntersuchungen eingesetzt wurde. An diesen beiden Enzymen soll untersucht werden, welche Veränderungen auf Proteinebene zu solchen Eigenschaften führen.
3.1.1.3 Therminator DNA-Polymerase
Bei der Therminator DNA-Polymerase handelt es sich um eine Variante der 3’-5’- Exonuklease defizienten 9°N DNA-Polymerase (aus Thermococcus species 9°N-7)104 und gehört dadurch in die Gruppe der thermostabilen DNA-Polymerasen aus hyperthermophilen, marinen Archaeen. Die Archaea werden seit 1990 neben Bakteria und Eukarya als eine eigenständige Domäne in der Einteilung aller zellulären Lebewesen betrachtet105. Viele charakterisierte Archaeen sind an ein Leben in extremen Umgebungen angepasst. Sie besitzen die Fähigkeit, bei sehr hohen Temperaturen (d.h. über 80 °C, Hyperthermophile), sehr niedrigen und hohen pH-Werten (Acidophile bzw. Alkaliphile) oder hohen Salzkonzentrationen (Halophile) zu leben. Thermococcus species 9°N-7 wurde ungefähr 850 km südlich von Acapulco (9 Grad nördliche Breite), in einem „Schornstein“ einer heissen Quelle in einer Meerstiefe von 2500 m am Grunde des pazifischen Ozeans gefunden106. Die 9°N und die Therminator DNA-Polymerase unterscheiden sich in nur einer Aminosäure.
Dabei handelt es sich um den Austausch des unpolaren Alanins durch das ebenfalls unpolare aber sterisch anspruchsvollere Leucin an Position 485 der Proteinsequenz (Abbildung 9). Die Mutation befindet sich in einer α-Helix im Fingerbereich des Enzyms und bewirkt eine Veränderung der Substratspezifität der Polymerase. Obwohl der Aminosäurerest nicht direkt in das aktive Zentrum hineinzeigt, führt diese Punktmutation in der DNA-Polymerase zum Einbau modifizierter Substrate wie Ribonukleotide, Didesoxynukleotide und azyklische Nukleotide104.
Ergebnisse
Abbildung 9. Ansicht der Kristallstruktur der DNA-Polymerase 9°N-7 aus Thermococcus species107 (PDB-Eintrag 1QHT). Die Punktmutation zur Therminator DNA-Polymerase liegen in der α-Helix O der Fingerdomäne (blau) und bewirkt eine größere Toleranz gegenüber artifiziellen Substraten. Orange: Handflächendomäne, rot:
Daumendomäne, blau: Fingerdomäne, grün: 3’-5’ Exonukleasedomäne, gelb: NH2-Terminus.
Darüber hinaus hat Szostak et al. bei seinen Untersuchungen zu den Eigenschaften der Basenpaarung von Nukleinsäuren mit alternativem Zucker-Phosphat Rückgrat entdeckt, dass die Therminator DNA-Polymerase auch die Synthese von 3’-2’ α-L-Threose Oligonukleotide (TNA) katalysiert108,109. In Studien von Herdewijn et al. konnten auch 3’-2’
phosphonomethyl-threosyl und 5’-3’ phosphonomethyl-desoxyribosyl Oligonukleotide durch die Therminator DNA-Polymerase synthetisiert werden110 (Abbildung 10).
Ergebnisse
Abbildung 10. 3’-2’ α-L-Threose (Szostak109), 3’-2’ phosphonomethyl-threosyl und 5’-3’ phosphonomethyl- desoxyribosyl Oligonukleotide (Herdewijn110) katalysiert durch Therminator DNA-Polymerase.
Diese Punktmutation, die die Therminator DNA-Polymerase in ihrem Substratspektrum so viel flexibler macht als die 9°N DNA-Polymerase wurde auch in der Strukturverwandten Pfu DNA-Polymerase beschrieben.
3.1.1.4 Pfu DNA-Polymerase
Die Pfu DNA-Polymerase stammt aus dem hyperthermophilen Archaeon Pyrococcus furiosus. Die Enzyme der hyperthermophilen Archaeen eignen sich durch ihre Hitzeresistenz besonders für die Anwendung bei molekularbiologischen Methoden wie beispielsweise der PCR oder auch in Sequenzierungsreaktionen111. Unter den im Labor verwendeten thermostabilen DNA-Polymerasen (Pfu, Deep Vent, Vent, Taq) zeichnet sich die Pfu DNA- Polymerase durch die größte Replikationsgenauigkeit aus, mit einer Fehlerrate von 1,6 x 10-6 pro Basenpaar pro Verdopplung112.
Auch bei der Pfu DNA-Polymerase konnte eine Veränderung der Selektivität und des Substratspektrums durch Mutationen in der Fingerdomäne beobachtet werden.
Untersuchungen von Connolly haben gezeigt, dass der Aminosäureaustausch an Position 486 der Pfu-Proteinsequenz von Alanin zu Tyrosin zum Einbau von ddNTPs führt48. Connolly beschreibt auch eine weitere Variante der Pfu DNA-Polymerase, die durch Mutation von zwei Aminosäuren error-prone (fehleranfällige) Eigenschaften erhält96. Die Mutationen befinden sich in der Schlaufe zwischen den beiden Helices der Finger-Domäne des Enzyms (Abbildung 11). Mutationen in den beiden Helices scheinen das Substratspektrum zu
Ergebnisse
verringern. Es ist bisher noch keine Kristallstruktur der Pfu DNA-Polymerase verfügbar.
Aufgrund der Sequenzhomologie zwischen der Pfu und der 9°N DNA-Polymerase, wurde die Sekundärstruktur der 9°N zur Übersicht herangezogen. Bei den rot markierten Aminosäuren handelte es sich um konservierte Aminosäuren in der Fingerdomäne von archaeellen Familie B DNA-Polymerasen.
Abbildung 11. Struktur der Finger-Unterdomäne der 9°N-7 DNA-Polymerase. Die Finger-Unterdomäne besteht aus zwei langen α-Helices (der N und O-Helix), die durch eine kleine Schlaufe aus drei Aminosäuren miteinander verbunden sind. Die Abbildung wurde aus Referenz96 übernommen.
Vergleich der Primär- und Sekundärstruktur der Pfu und Therminator DNA- Polymerase:
Die DNA-Polymerasen Pfu und Therminator gehören beide in die Familie B DNA- Polymerasen und besitzen eine Aminosäure-Sequenzhomologie von 80,3 %. Mutationen im Fingerbereich an Position A485 bei der 9°N und A486 im Falle der Pfu DNA-Polymerase führten in beiden Fällen zu einer Erweiterung des Substratspektrums, beispielsweise um ddNTPs. Aus dem Sequenzvergleich in Abbildung 12 kann man erkennen, dass sich die Mutation in beiden Enzymen an derselben Aminosäure-Position in der α-Helix O der Finger- Domäne befindet.
Ergebnisse
Abbildung 12. Vergleich der Primär- und Sekundärstruktur von Pfu und Therminator DNA-Polymerase. Die Sekundärstruktur der Enzyme ist über dem Sequenzvergleich mit den entsprechenden Farben für ihre Domänenzugehörigkeit abgebildet. Übereinstimmende Aminosäuren sind in rot, unterschiedliche Aminosäuren in schwarz dargestellt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte die stereochemische Kontrolle der DNA-Biosynthese näher untersucht werden. Durch Aufbau eines Selektionssystems, sollten aus einer selbst hergestellten Mutanten-Bibliothek der Pfu DNA-Polymerase Varianten identifiziert werden, die in der Lage sind L-Nukleotide als Substrate bei der DNA-Synthese zu verwenden. Neben einem allgemeinen besseren Verständnis der Prozesse der stereoselektiven DNA- Biosynthese könnten durch diese Versuche auch DNA-Polymerasen erhalten werden, die aufgrund ihrer Nukleaseresistenz nutzbare Eigenschaften besitzen (siehe 1.1.1).
Ergebnisse
3.1.2 Ergebnisse
3.1.2.1 Synthese von Beta-L-2´-Thymidintriphosphat
Abbildung 13. Synthese von L-Thymidin-5’-O-Triphosphat. POCl3, 1,8-bis-(dimethylamino)naphthalen, (CH3O)3PO, 0 °C, dann (nBu3NH)2H2P2O7, nBu3N, DMF, dann 0.1 M wässriges (Et3NH)HCO3.
Im Rahmen der Dissertation wurden Beta-L-2’-Thymidintriphosphate synthetisiert.
Ausgehend vom L-Nukleosid, das kommerziell erworben wurde, erfolgte die Überführung des Thymidins in das entsprechende 5’-O-Triphosphat nach Kovacs und Ötvös113. Experimentelle Details siehe Kapitel 6.5.1.
3.1.2.2 Synthese modifizierter DNA-Oligonukleotide
Für funktionale Untersuchungen mit der Therminator DNA-Polymerase und Pfu DNA- Polymerase Varianten wurden unterschiedliche Primer und Templatstränge mit L-Nukleosid 3’-O-Phosphoramiditen synthetisiert. Des weiteren wurden für die Untersuchungen biophysikalischer Eigenschaften von modifizierten DNA-Duplexen 4’-C-modifizierte Thymidinanaloga in Oligonukleotide inkorporiert. Dies erfolgte am DNA-Synthesizer mittels Standardzyklen der 2-Cyanoethylphosphoramiditchemie (Abbildung 14) und LCAA-CPG (long chain aminoalkyl controled pore glass) als Festphase.
Ergebnisse
Abbildung 14. Reaktionszyklus für einen vollständigen Kettenverlängerungsschritt am DNA-Synthesizer mittels 2- Cyanoethylphosphoramiditchemie. Die Reihenfolge ist 5´-Entschützung, Kopplung unter Verwendung von Tetrazol als Aktivator, Capping mit Ac2O, N-Methylimidazol und Iod-Oxidation.
Die Kopplungen eines modifizierten Phosphoramiditbausteins und des jeweils darauf folgenden wurden mit einer verlängerten Kopplungszeit von 10 min durchgeführt, alle anderen Schritte erfolgten nach Standardmethoden. Nach Abspaltung von der Festphase und Entschützung der 2-Cyanoethylgruppen und der Benzoyl- (A und C) und Isobutyrylschutzgruppen (G) der exozyklischen Aminofunktionen der Nukleobasen mit 33 % NH4OH, wurden die Produkte über denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigt.
3.1.2.3 Einbau von β-L-TTP
Zu Beginn der Untersuchungen bezüglich der Akzeptanz von L-Nukleotiden als Substrate in der DNA-Synthese wurden radiometrische Primerverlängerungsstudien mit verschiedenen DNA-Polymerasen durchgeführt. Es wurde die Stereospezifität von neun kommerziell erhältlichen DNA-Polymerasen getestet, die aus verschiedenen Polymerase-Familien
Ergebnisse
stammen. Auf diese Weise sollte ein breites Spektrum an Enzymen mit unterschiedlichen Funktionen, Selektivitäten und biologischen Ursprüngen abgedeckt werden.
Aus Strukturfamilie A wurden das aus E. coli stammende Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I und die Taq DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus verwendet. Aus Strukturfamilie B wurden verschiedene, aus thermophilen Archaeen stammende DNA- Polymerasen, wie Pfu DNA-Polymerase exo¯, 9°N, Therminator DNA-Polymerase sowie die 3’-5’-exonukleasedefiziente Vent DNA-Polymerase eingesetzt. Aus Strukturfamilie X wurden die humane DNA-Polymerase β und die templatunabhängige Terminale Desoxynukleotidyl Transferase (TdT) untersucht. Zusätzlich wurde die Reverse Transkriptase aus HIV-1 getestet.
Für die Studie wurden unterschiedliche Kombinationen an Primer/Templat Komplexen untersucht (siehe Tabelle 2). Zum einen eine Kombination aus natürlichem D-Primer und D- Templat und zum anderen das Spiegelmer aus L-Primer und L-Templat. Es wurde aber auch der Hybrid-Komplex aus L-Primer und D-Templat untersucht, trotz der unvorteilhaften Hybridisierungs-Bedingungen. Als Primer wurde ein 18mer Oligonukleotid verwendet, das im Falle des L-Primers am 5’-Ende mit vier natürlichen D-Bausteinen versehen wurde, um eine radiometrische Markierung mit 32P an der 5’-OH-Gruppe des Primers durch T4-PNK (Polynukleotidkinase) zu ermöglichen. Als Positivkontrolle fungierte die Primerverlängerung des natürlichen D-Primer/Templat-Komplexes mit D-dTTP unter den selben Reaktionsbedingungen.
Ergebnisse
Abbildung 15. Autoradiogramme von denaturierenden PAGE-Gelen der Produktgemischauftrennung von Primerverlängerungsreaktionen zur Untersuchung der Einbaufähigkeit von L-desoxy-Thymidinen durch verschiedene DNA-Polymerasen. Die Reaktionen enthielten 133 nM Primer, 200 nM Templat (18mer Primer, 18mer Templat), 50 µM L-TTP und 2,5 U Enzym. Die Reaktionen wurden 10 min bei 72 °C (bei 9°N, Therminator, Vent exo-, Pfu exo-, oder 37 °C (bei Pol β, KF exo-, HIV-RT, TdT) inkubiert. M = Primermarker, D = Oligomer bestehend aus D-Nukleotiden. L = Oligomer bestehend aus L-Nukleotiden (im Falle der L-Primer mit kurzer D- Sequenz, zur effizienteren Kinasierung mit 32P).
Tabelle 2. Qualitative, vergleichende Gegenüberstellung der Primerverlängerungsstudien mit verschiedenen DNA-Polymerasen und unterschiedlichen Primer/Templat-Komplexen. Dargestellt ist der Einbaufähigkeit von L- Thymidinen. Als Positivkontrolle wurde ein natürlicher Primer/Templat-Komplex mit D-dNTPs verwendet.
Oligonukleotidsequenz siehe 8.X
Primer/Templat- Komplex
DNA- Polymerase
D-Primer D-Templat
L-TTP
L-Primer D-Templat
L-TTP
L-Primer L-Templat
L-TTP
Positv Kontrolle
D-TTP
KF exo- A - - - +
Taq A - nb - +
9°N B - nb - +
Therminator B +2 nb - +
Pfu exo- B - - - +
Vent exo- B - nb - +
TdT Y +3/-3 nb - +
Pol beta X - nb - +
HIV 1 RT RT +1 - - +
Ergebnisse
Die Ergebnisse zeigen, dass nur bei der Therminator DNA-Polymerase und bei der HIV 1 Reversen Transkriptase eine Primer-Verlängerung durch Einbau des artifiziellen Triphosphats erfolgt ist. Die Verlängerung durch die Terminale Desoxynukleotidyl Transferase war gekoppelt mit Abbruchbanden und wurde deshalb nicht als L-Thymidin einbauendes Enzym gewertet. Auffallend bei den Ergebnissen ist, dass nur die Kombination aus D-Primer/D-Templat bei den aktiven Polymerasen zu einer Verlängerung des Primers mit dem artifiziellen Triphosphat führt. Der Duplex bestehend aus L-Primer und L-Templat konnte dagegen von keiner der getesteten Polymerasen erkannt werden. Die Therminator DNA-Polymerase zeigte deutlich den Einbau von ein bis zwei L-TTP gegenüber dA im Templatstrang, wohin gegen bei der 9°N DNA-Polymerase keine Verlängerung des Primers bei den gewählten Versuchsbedingungen beobachtet werden konnte (Abbildung 15A). Wie in Kapitel 3.1.1.3 beschrieben, unterscheiden sich die beiden Enzyme nur durch eine einzige Punktmutation. Die HIV-1 RT bestätigte die schon in der Literatur beschriebene Fähigkeit zum Einbau eines L-TTPs102. Die DNA-Polymerasen Pfu exo-, KF exo-, Taq und die humane DNA-Polymerase β zeigten dagegen keine Einbau des Substrats unter diesen Bedingungen.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde die Therminator DNA-Polymerase für weitere Untersuchungen ausgewählt. In Folgeexperimenten zeigte sich, dass der Einbau des L- Thymidintriphosphats selektiv gegenüber einem dA im Templatstrang erfolgt (Abbildung 16).
Auf diesen Befunden wurde in weiteren Experimenten aufgebaut.
Abbildung 16. Autoradiogramm eines 12 % denaturierenden PAGE-Gels zur Auftrennung der Produktgemische aus Primerverlängerungsstudien mit der Therminator und 9°N DNA-Polymerase unter Verwendung von verschiedenen Primer/Templat-Systemen und L-TTP als Substrat. Bahn 1 bis 4: A, C, G, oder T im Templatstrang. Die Reaktion enthielt 133 nM Primer, 200 nM Templat (24mer Primer, 36mer Templat), 50 µM L- TTP, 2.5 U Therminator DNA-Polymerase und wurde 5 und 10 min bei 72 °C inkubiert. Oligonukleotidsequenz siehe 8.1.
Das gezeigte Potential der Polymerase bezüglich der Akzeptanz von L-Thymidinen als Substrat und des selektiven Einbaus gegenüber der komplementären Nukleobase sollte in Folgeexperimenten qualitativ untersucht und quantitativ durch kinetische Messungen bestimmt werden.
Ergebnisse
3.1.2.4 Stereospezifität der Therminator DNA-Polymerase
Das Verhältnis der Nukleotid-Einbaueffizienz einer kanonischen Nukleobase zum Einbau gegenüber einer nichtkanonischen Nukleobase ist ein Maß für die Selektivität einer DNA- Polymerase.
In Primerverlängerungsstudien mit natürlichen Primer/Templat-Komplexen und anschließender Analyse durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde das Einbauverhalten von L-TTP als Substrat gegenüber den vier natürlichen Basen im Templatstrang durch die Therminator DNA-Polymerase untersucht. Dafür wurden vier verschiedene Primer/Templat-Kombinationen verwendet, die sich an der -1 Position hinter dem 3’-Ende des Primers im Templatstrang unterschieden. Die Studie zeigte, dass unter den verwendeten Reaktionsbedingungen die Polymerase das stereoisomere Substrat selektiv gegenüber der Watson-Crick-Base dA im Templatstrang einbaut (siehe Abbildung 16).
Während keine Primerverlängerung gegenüber der nicht-kanonischen Templatnukleotiden dC, dG und T zu beobachten waren, erfolgte trotz der spiegelverkehrten Anordnung der Riboseeinheit des Substrats ein selektiver Einbau durch die Therminator DNA-Polymerase gegenüber der kanonischen Templatbase dA.
Durch die Steigerung der Substratkonzentration konnte auch der nicht kanonische Einbau provoziert werden. Die kinetischen Daten Vmax, KM und daraus resultierend die Verlängerungseffizienz Vmax/KM wurden durch steady-state-kinetische Untersuchungen des Einzelnukleotideinbaus mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen bestimmt. Um single- completed-Hit Bedingungen herzustellen, wurde eine Reaktionszeit von 10 min genommen und der verwendete Konzentrationsbereich des Substrats so angepasst, dass nur 20 % oder weniger des Primer/Templat-Komplexes umgesetzt wird. Exemplarisch für diese Studien ist der Einbau von L-TTP gegenüber dG im Templatstrang abgebildet (Abbildung 17). Die Substratkonzentration lag zwischen 2 und 0 mM L-TTP.
Ergebnisse
Abbildung 17. Autoradiogramm eines 12 % denaturierenden PAGE-Gels zur Auftrennung der Produktgemische aus Primerverlängerungsstudien mit der Therminator DNA-Polymerase. Bahn 1: 2 mM, Bahn 2: 1.5 mM; Bahn 3:
1.25 mM, Bahn 4: 1 mM, Bahn 5: 0.75 mM, Bahn 6: 0.5 mM, Bahn 7: 0.25 mM, Bahn 8: 0.1 mM, Bahn 9: 0 mM L- TTP. Die Reaktion enthielt 133 nM Primer, 200 nM G-Templat (24mer Primer, 36mer Templat), 0 bis 2 mM L- TTP, 0.05 U Therminator DNA-Polymerase und wurde 10 min bei 72 °C inkubiert. Oligonukleotidsequenz siehe 8.1.
Die durchgeführten Messungen bestätigten, dass der Einbau des L-TTP gegenüber der nicht kanonischen Templatbasen von der Therminator DNA-Polymerase mit geringerer Effizienz katalysiert wird als der Einbau gegenüber dem kanonischen dA (siehe Tabelle 3).
Tabelle 3. Einzeleinbaukinetiken von L-TTP gegenüber den natürlichen Nukleotiden im Templatstrang unter steady-state- und single-completed-Hit Bedingungen Die Reaktionen wurden mit verschiedenen Kombinationen aus Primer und Templaten durchgeführt und durch die Therminator DNA-Polymerase katalysiert. Grau hinterlegt ist die Reaktion des kanonischen Primer/Templat-Komplexes mit dem natürlichen D-TTP als Substrat. Alle Daten resultieren aus mehreren unabhängigen Messungen.
Templat X
TTP Vmax
[min-1 x 10-3]
KM [µM]
Effizienz [M-1min-1]
A L 25.0 ± 1.1 2.8 ± 1.0 8.9 x 10-3
C L 30.4 ± 0.1 180.7 ± 12.4 1.7 x 10-4
G L 19.2 ± 2.0 210 ± 0.1 9.1 x 10-5
T L 24.5 ± 0.7 8.1 ± 0.01 3.0 x 10-3
A D 18.7 ± 0.1 (0.3± 0.1) x10-3 6.0 X 101 C D 24.9 ± 0.5 (12.2 ± 0.9) x 10-3 2.0 x 100 G D 17.3 ± 0.3 (2.6 ± 0.2) x 10-3 6.8 x 100
T D 21.8 ± 0.02 (0.6 ± 0.2) x 10-3 3.5 x 101
Die Unterschiede in der katalytischen Effizienz werden primär durch die KM-Werte bestimmt.
Während die maximalen Katalysegeschwindigkeiten Vmax sowohl für den Einbau des natürlichen Thymidins als auch für den Einbau des Enantiomers vergleichbar ist, unterscheiden sich die KM-Werte um das 75-fache vom kanonischen Einbau im Falle des L- TTPs. Daraus ergibt sich, dass das artifizielle Substrat mit einer 3-fach höheren Einbaueffizienz (Vmax/KM) gegenüber dem kanonischen A inkorporiert wird als gegenüber
